一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明利用三維膠原支架在低血清濃度下完成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的富集培養(yǎng)，為膠質(zhì)瘤體外試驗(yàn)研究提供了一種新型的，更接近體內(nèi)真實(shí)環(huán)境的干細(xì)胞培養(yǎng)方法及應(yīng)用。所述三維培養(yǎng)方法中選用膠原作為制作3D支架的材料，膠原是細(xì)胞外基質(zhì)最主要的成分，可為細(xì)胞提供良好的粘附與遷移環(huán)境，并具有良好的生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度、降解系數(shù)和低免疫原性。本發(fā)明研究多孔膠原支架三維培養(yǎng)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性的影響，探討其機(jī)制，摸索更接近于體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞環(huán)境的靶向GSCs藥物試驗(yàn)方法，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，繼而對(duì)膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為丌發(fā)GSCs靶向藥物提供了新的思路奠定基礎(chǔ)，其成果具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物領(lǐng)域，特別涉及一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性膠質(zhì)瘤作為神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在過去的10年里，即使經(jīng)歷了手術(shù)、放射和化學(xué)治療的較大進(jìn)展，其中位生存期也僅由10個(gè)月提高至14個(gè)月，并且在針對(duì)膠質(zhì)瘤的多個(gè)大型、多中心的新藥試驗(yàn)中，都未能取得令人滿意的結(jié)果，絕大多數(shù)的藥物在二期臨床試驗(yàn)中折戟沉沙，未能體現(xiàn)出與體外試驗(yàn)時(shí)相一致的結(jié)論。這種體外試驗(yàn)與臨床結(jié)果不相符的情況在抗膠質(zhì)瘤治療研究中普遍存在，預(yù)示著目前對(duì)于惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展特性及抗藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)還有很多的空白，抗惡性膠質(zhì)瘤腫瘤藥物體外試驗(yàn)方法存在著進(jìn)一步改 進(jìn)的空間。
[0003]近年來腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展，也為膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療抵抗等關(guān)鍵機(jī)制以及在此基礎(chǔ)上研發(fā)診療新技術(shù)打開了新的視野，且越來越成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSCs)因其自我更新、多向分化和對(duì)治療抵抗的能力，是維持腫瘤惡性生長和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的“種子細(xì)胞”，因此以GSCs為主要靶向的抗膠質(zhì)瘤治療研究也成為抗膠質(zhì)瘤治療的新興重點(diǎn)方向之
[0004]那么進(jìn)行靶向GSCs治療的研究首先就要求我們有一個(gè)針對(duì)GSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)的技術(shù)以及在此技術(shù)之上進(jìn)行不同于傳統(tǒng)的藥物學(xué)試驗(yàn)方法。在我科以往的抗腫瘤新藥研發(fā)中，我們主要按照傳統(tǒng)的腫瘤藥物體外試驗(yàn)方法，即以檢測單層培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)來進(jìn)行。該方法由美國國家癌癥研究所(NCI)于上世紀(jì)八十年代創(chuàng)建，但在臨床應(yīng)用中，常發(fā)現(xiàn)體外試驗(yàn)敏感的藥物效果與患者體內(nèi)實(shí)體瘤臨床評(píng)估的藥效偏差較大。既有研究表明，這至少部分是由于單層培養(yǎng)的體外細(xì)胞生長喪失了三維空間結(jié)構(gòu)，無法相對(duì)真實(shí)地反映體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的病理生理結(jié)構(gòu)、生長狀態(tài)以及相對(duì)耐藥耐輻射的腫瘤干細(xì)胞水平。
[0005]進(jìn)入GSCs研究時(shí)代以后，目前最常用的GSCs體外培養(yǎng)方法是由1992年ReynoldsBA等人在從鼠紋狀體進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)中發(fā)明的無血清懸浮培養(yǎng)法。該培養(yǎng)方法的特點(diǎn)為:無血清、添加高濃度生長因子的培養(yǎng)液，以及低黏附性培養(yǎng)環(huán)境。其優(yōu)勢為:可以比較簡單、直觀地從細(xì)胞層面上體現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的自我更新及分化能力；但缺陷也很明顯:除了成球培養(yǎng)重復(fù)性較差，細(xì)胞球內(nèi)難以觀測等，更重要的是其與體內(nèi)環(huán)境大相徑庭。它無法遷移運(yùn)動(dòng)，由單細(xì)胞分裂成球而來，無法體現(xiàn)細(xì)胞與基質(zhì)的作用，長期傳代成功率極低，而體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞絕非懸浮狀態(tài)，不可運(yùn)動(dòng)，其粘附于由其他細(xì)胞和基質(zhì)支持組成的特殊微環(huán)境，即特定的“干細(xì)胞龕”內(nèi)，也可以接觸到血清成分。
[0006]目前應(yīng)用在制備3D細(xì)胞培養(yǎng)的主要材質(zhì)包括:1.天然有機(jī)物:膠原、殼聚糖、葡萄糖氨基聚糖類、藻酸鹽、絲心蛋白、瓊脂糖、淀粉；2.無機(jī)大分子聚合物:PGA(聚乙醇酸)、PLA(聚乳酸)、PLC(聚己內(nèi)酯)、POE (聚原酸酯)及其多相聚合支架如PLGA等。
[0007]因此，目前繼續(xù)一種新型的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)方法，以真實(shí)地反映體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的病理生理結(jié)構(gòu)、生長狀態(tài)以及相對(duì)耐藥耐輻射的腫瘤干細(xì)胞水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，所述三維培養(yǎng)方法可為細(xì)胞提供良好的粘附與遷移環(huán)境，并具有良好的生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度、降解系數(shù)和低免疫原性。利用三維細(xì)胞培養(yǎng)這種方法將有效的避免不必要的臨床Ι、π期試驗(yàn)，從而減少病人資源和后續(xù)研究資金的浪費(fèi)。
[0009]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0010]一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，利用三維膠原支架，并摸索出適宜的低血清培養(yǎng)濃度，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟:
[0011]1)將三維膠原支架切割成的立方體，使用前Co60照射消毒過夜，4°C干燥環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆?，待接種細(xì)胞前，以細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡預(yù)處理12小時(shí)；
[0012]2)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞株消化離心至單細(xì)胞懸液，再用PBS洗凈2遍，以去除血清成份，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每個(gè)三維膠原支架I X IO4~5 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于步驟I)處理后的三維膠原支架上，靜置4小時(shí)，待細(xì)胞有效粘附于支架上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每2日更換I次培養(yǎng)液，即得到3D膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型。
[0013]進(jìn)一步的，步驟I)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為添加I %胎牛血清的DMEM。
[0014]進(jìn)一步的，所述三維膠原支架的平均孔徑為50 μ m。
[0015]進(jìn)一步的，所述三維膠原支架的材料為I型膠原。
[0016]進(jìn)一步的，膠質(zhì)瘤細(xì)胞株為U87細(xì)胞細(xì)胞。
[0017]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是:
[0018]1、本發(fā)明中制備3D細(xì)胞培養(yǎng)的主要材質(zhì)選用膠原，膠原是細(xì)胞外基質(zhì)最主要的成分，可為細(xì)胞提供良好的粘附與遷移環(huán)境，并具有良好的生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度、降解系數(shù)和低免疫原性；
[0019]2、利用本發(fā)明所述三維細(xì)胞培養(yǎng)，在少見惡性腫瘤的臨床前藥敏試驗(yàn)和藥物篩選中，將有效的避免不必要的臨床1、II期試驗(yàn)，從而減少病人資源和后續(xù)研究資金的浪費(fèi)；
[0020]3、采用本發(fā)明所述方法培養(yǎng)得到的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在三維支架微環(huán)境中可自發(fā)聚集成團(tuán)塊狀，其細(xì)胞生長形態(tài)與二維培養(yǎng)細(xì)胞迥異，細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)較二維培養(yǎng)細(xì)胞含更豐富凸起樣或纖毛樣結(jié)構(gòu)，與人體內(nèi)生長膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)更接近，利于后續(xù)研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞治療藥物；
[0021]4、本發(fā)明率先研究以三維膠原支架為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)的新技術(shù)，更好的模擬體內(nèi)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞微環(huán)境，為進(jìn)一步研發(fā)靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞治療藥物提供新的體外實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為激光共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞分布情況；
[0023]圖2為掃描電鏡顯示細(xì)胞生長形態(tài)；
[0024]圖3為流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)體系內(nèi)腫瘤細(xì)胞生存情況?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
[0026]一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，利用三維膠原支架，并摸索出適宜的低血清培養(yǎng)濃度，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟:
[0027]I)將三維膠原支架切割成的立方體，使用前Co60照射消毒過夜，4°C干燥環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆?，待接種細(xì)胞前，以細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡預(yù)處理12小時(shí)；
[0028]2)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞株消化離心至單細(xì)胞懸液，再用PBS洗凈2遍，以去除血清成份，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每個(gè)三維膠原支架I X IO4~5 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于步驟I)處理后的三維膠原支架上，靜置4小時(shí)，待細(xì)胞有效粘附于支架上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每2日更換I次培養(yǎng)液，即得到3D膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型。
[0029]進(jìn)一步的，步驟I)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為添加I %胎牛血清的DMEM。
[0030]進(jìn)一步的，所述三維膠原支架的孔徑為50 μ m。
[0031]進(jìn)一步的，所述三維膠原支架的材料為I型膠原。
[0032]進(jìn)一步的，膠質(zhì)瘤細(xì)胞株為U87細(xì)胞。
[0033]實(shí)施例2
[0034]本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上的優(yōu)選化方案，提供了一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法。本實(shí)施例中與實(shí)施例1相同的部分，請(qǐng)參照實(shí)施例1中公丌的內(nèi)容進(jìn)行理解，實(shí)施例1公丌的內(nèi)容也應(yīng)當(dāng)作為本實(shí)施例的內(nèi)容，此處不作重復(fù)描述。
[0035]所述三維培養(yǎng)方法包括以下步驟:
[0036]常規(guī)二維培養(yǎng)的U87細(xì)胞消化離心后，制備成單細(xì)胞懸液，再接種于孔徑約50 μ m的膠原支架上，在1%胎牛血清(FBS)+DMEM培養(yǎng)液條件下進(jìn)行培養(yǎng)。觀測細(xì)胞是否能與較好粘連于支架膠原基質(zhì)上并生長，熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白(GFP)的U87細(xì)胞增殖情況，掃描電鏡(SEM)及HE切片觀測細(xì)胞生長形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)體系內(nèi)腫瘤細(xì)胞生存情況(AnnexinV+PI法)，激光共聚焦顯微鏡三維重建法觀測細(xì)胞在支架內(nèi)分布情況。參見圖1、圖2。其中圖1，A.轉(zhuǎn)染GFP的U87細(xì)胞可在支架上增殖性生長；B，C，D.激光共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞在支架上的分布情況，其中在64-125 μ m的范圍內(nèi)細(xì)胞分布較多；E.顯示不同的增殖速度，3D培養(yǎng)的U87細(xì)胞增殖速度慢于2D單層培養(yǎng)的，其生長趨勢較平緩；F.顯示3D培養(yǎng)中的細(xì)胞凋亡比例高于2D培養(yǎng)的，這也反映了與2D培養(yǎng)不同的增殖特性。
[0037]本實(shí)施例中所述支架山中科院發(fā)育生物所制備提供，材質(zhì)為I型膠原。所述支架請(qǐng)參見文獻(xiàn)，CHEN L, XIAO Z, MENGL, et al.The enhancement of cancer stem cellproperties of MCF_7cells in3D collagen scaffolds for modeling of cancer andant1-cancer drugs[J].Biomaterials,2012,33(5):1437_44。
[0038]觀測三維膠原支架培養(yǎng)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性影響:將不同方式(二維vs三維)及不同血清條件(10% vs3%vsl%vs0)培養(yǎng)的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測膠質(zhì)瘤干性細(xì)胞(U87CD133+U87細(xì)胞)的比例。摸索出三維膠原支架富集培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的適宜條件，包括不同血清濃度培養(yǎng)液，不同時(shí)間段收集細(xì)胞以及與懸浮成球細(xì)胞比較等，在此基礎(chǔ)之上尋找三維膠原支架培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的方法。所述適宜條件為:將支架內(nèi)細(xì)胞浸沒于I %胎牛血清+DMEM培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般收集細(xì)胞時(shí)間以5天左右。
[0039]膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞在三維膠原支架中可進(jìn)行性增殖生長，但增殖速度較二維培養(yǎng)顯著性減慢，其差異有顯著性，參見圖1。進(jìn)一步采用HE切片和SEM觀測膠質(zhì)瘤細(xì)胞在三維膠原支架內(nèi)生長情況可發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞在三維支架微環(huán)境中可自發(fā)聚集成團(tuán)塊狀，其細(xì)胞生長形態(tài)與二維培養(yǎng)細(xì)胞迥異，細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)較二維培養(yǎng)細(xì)胞含更豐富凸起樣或纖毛樣結(jié)構(gòu)，與人體內(nèi)生長膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)更接近，參見圖2。在不同濃度下進(jìn)行三維培養(yǎng)對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞干性影響的觀測，在1% FBS濃度條件下進(jìn)行三維培養(yǎng)可對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性明顯提升，且干細(xì)胞比例不弱于經(jīng)典的懸浮成球方法。進(jìn)一步進(jìn)行干性基因、耐藥基因RT-PCR和western blotting的檢測，發(fā)現(xiàn)Q)133、Sox2、Nanog等干性基因及MGMT等耐藥相關(guān)基因表達(dá)均顯著上調(diào)，尤其以Sox2、MGMT上調(diào)最顯著，參見圖3。流式細(xì)胞術(shù)顯示I %血清條件下，三維膠原支架中培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(U87CD133+)比例上調(diào)(A10% FBS, B3% FBS, Cl%FBS，D無FBS)，該條件下，RT-PCR顯示干性因子基因表達(dá)上調(diào)(E)，部分耐藥基因上調(diào)，MGMT最明顯(F)。Western blotting顯示相關(guān)因子蛋白水平上調(diào)(G)。驗(yàn)證了 1%FBS+DMEM利用三維膠原支架培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞可上調(diào)細(xì)胞干性，富集培養(yǎng)干細(xì)胞，所培養(yǎng)的細(xì)胞同時(shí)耐藥基因及蛋白上 調(diào)。
【權(quán)利要求】
1.一種新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，其特征在于，利用三維膠原支架，并摸索出適宜的低血清培養(yǎng)濃度，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟: 1)將三維膠原支架切割成的立方體，使用前Co60照射消毒過夜，4°C干燥環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆茫臃N細(xì)胞前，以細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡預(yù)處理12小時(shí)； 2)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞株消化離心至單細(xì)胞懸液，再用PBS洗凈2遍，以去除血清成份，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每個(gè)三維膠原支架I X IO4~5 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于步驟I)處理后的三維膠原支架上，靜置4小時(shí)，待細(xì)胞有效粘附于支架上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每2日更換I次培養(yǎng)液，即得到3D膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟I)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為添加I %胎牛血清的DMEM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三維膠原支架的平均孔徑為50 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三維膠原支架的材料為I型膠原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，其特征在于，膠質(zhì)瘤細(xì)胞株為U87細(xì)胞 。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103898058SQ201410129815
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】呂東來, 卞修武, 陳葉苗 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院