一種牙周膜干細胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種牙周膜干細胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙周膜干細胞（periodontalligamentstemcells,PDLSCs)是存在于牙齒牙周 組織中的一類可自我更新、增殖能力強及具有多向分化能力的成纖維細胞樣干細胞。牙周 膜干細胞具有多向分化的潛能，體外可分化為成脂細胞、成骨細胞樣細胞、成牙骨質(zhì)樣細胞 和神經(jīng)前體細胞等，體內(nèi)可分化為成牙骨質(zhì)樣和牙周膜樣組織。因此，牙周膜干細胞是牙周 組織再生的種子細胞，將體外培養(yǎng)的牙周膜干細胞回輸人體W治療牙周病等疾病?，F(xiàn)有牙 周膜干細胞的培養(yǎng)多采用單層細胞培養(yǎng)，獲得的細胞數(shù)量低，生物性狀與體內(nèi)存在差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種牙周膜干細胞的培養(yǎng)方法。
[0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] -種牙周膜干細胞的培養(yǎng)方法，將牙周膜干細胞接種到水凝膠上，用含BMP-2的 無血清培養(yǎng)基進行Ξ維培養(yǎng)。
[0006] 優(yōu)選地，所述BMP-2的濃度為5-15ng/mL。
[0007] 優(yōu)選地，Ξ維培養(yǎng)接種用的牙周膜干細胞在二維培養(yǎng)時，使用含bFGF的無血清培 養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0008] 優(yōu)選地，所述bFGF的濃度為5-15ng/mL。
[0009] 優(yōu)選地，所述水凝膠為I型膠原水凝膠。
[0010] 更優(yōu)選地，所述I型膠原水凝膠通過W下方法制備：I型膠原水凝膠溶液瞬時離 屯、脫泡，接種到預(yù)先冷卻的培養(yǎng)板內(nèi)，-80°C靜置2-4h后凍干12-2化。
[0011] 更優(yōu)選地，所述I型膠原水凝膠通過W下方法制備：將I型膠原酸性溶液調(diào)節(jié)抑 值至7. 2左右，得到終濃度為5-15mg/血的膠原水凝膠溶液；瞬時離屯、脫泡后接種到預(yù)先冷 卻的48孔板或96孔板內(nèi)，-80°C靜置化后凍干16h。
[0012] 優(yōu)選地，Ξ維培養(yǎng)接種用的牙周膜干細胞是傳代培養(yǎng)第2代至第5代細胞。
[0013] 優(yōu)選地，所述牙周膜干細胞的培養(yǎng)方法包括W下步驟：
[0014] S1、牙周膜干細胞的分離及純化
[0015] 用I型膠原酶溶液消化牙周膜組織，獲得牙周膜干細胞；用含bFGF的無血清培養(yǎng) 基培養(yǎng)牙周膜干細胞，至匯合度80% -90%，用膜蛋白酶溶液消化進行傳代培養(yǎng)；
[0016] 第一代細胞按照有限稀釋法克隆化培養(yǎng)人牙周膜干細胞，待克隆長至匯合度 30 % -60 %時，用膜蛋白酶溶液消化細胞，進行擴大培養(yǎng)；
[0017] S2、S維培養(yǎng)
[0018] 用膜蛋白酶溶液消化第3代細胞，接種至水凝膠上，用含有BMP-2的無血清培養(yǎng)基 進行Ξ維培養(yǎng)。
[0019] 優(yōu)選地，無血清培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、非必需氨基酸、谷氨酷胺和血清替代物， 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為叫traCULTURESerum-freeMedium。
[0020] 更優(yōu)選地，非必需氨基酸的濃度為1倍，谷胺酷胺的濃度為血清替代物 的體積百分數(shù)為5%。
[0021] 優(yōu)選地，在上述無血清培養(yǎng)基中添加bFGF即為含bFGF的無血清培養(yǎng)基。因含 bFGF的無血清培養(yǎng)基是用于牙周膜干細胞的二維培養(yǎng)，下文中將其稱為二維培養(yǎng)用無血清 培養(yǎng)基。為了防止污染，二維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基中還可W添加抗生素。本發(fā)明中優(yōu)選二 維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基含有5-15ng/mLbFGF、1倍濃度的雙抗（lOOU/mL青霉素和100μg/ mL鏈霉素），即二維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基組成為：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必需氨基酸、 體積百分數(shù)5 %血清替代物、5-15ng/mLbFGF、lOOU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，余量為 U1traCULTURESerum-freeMedium。
[0022] 優(yōu)選地，在上述無血清培養(yǎng)基中添加BMP-2即為含BMP-2的無血清培養(yǎng)基。因含 BMP-2的無血清培養(yǎng)基是用于牙周膜干細胞的Ξ維培養(yǎng)，下文中將其稱為Ξ維培養(yǎng)用無血 清培養(yǎng)基。本發(fā)明中優(yōu)選Ξ維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基含有5-15ng/mLBMP-2,即Ξ維培養(yǎng)用無 血清培養(yǎng)基組成為：2mmol/L谷胺酷胺、1倍的非必需氨基酸、體積百分數(shù)5%血清替代物和 5-15ng/mLBMP-2,余量為叫traCULTURESerum-freeMedium。
[0023]優(yōu)選地，所述的非必需氨基酸包含甘氨酸（Glycine)、k丙氨酸化-Alanine)、 心天冬酷胺（X-Asparagine)、心天冬氨酸（X-Asparticacid)、k谷氨酸（X-Glutamic Acid)、k脯氨酸（X-Proline)和心絲氨酸（Serine)各ImM。
[0024] 優(yōu)選地，所述牙周膜干細胞的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[00巧]S1、牙周膜干細胞的分離及純化
[0026] 刮取根中1/3牙周膜組織，剪碎后用10倍體積的lg/L-5g/LI型膠原酶溶液在 37°C、200巧m條件下消化30-60min，加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，1000-2000巧m離 屯、5-lOmin，丟棄上清，用20-40血PBS反復(fù)吹打離散細胞團塊，70μm的細胞篩網(wǎng)過濾，濾 液1000-200化pm離屯、5-lOmin，用二維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基重懸沉淀；
[0027] 按照化1-1)XlOVwell將細胞懸液接種至培養(yǎng)板中，每孔加入2血二維培養(yǎng) 用無血清培養(yǎng)基，混勻后于37°C、濕度95%的條件下培養(yǎng)，每3d換液1次，當匯合度達 80% -90 %時，用0. 125% -0. 25 %膜蛋白酶溶液消化細胞，進行傳代培養(yǎng)；
[0028] 第1代細胞按照有限稀釋法克隆化培養(yǎng)人牙周膜干細胞，調(diào)整原代細胞密度為 10-100個細胞/mU接種于培養(yǎng)板，用二維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基于37°C、5%C〇2條件下培 養(yǎng)，2d-5d換液1次，待克隆長至匯合度30% -60%時，用0. 125% -0. 25%膜蛋白酶溶液消 化細胞，進行擴大培養(yǎng)；
[0029] S2、S維培養(yǎng)
[0030] 將培養(yǎng)至第3代的牙周膜干細胞用0. 1% -0. 25%膜蛋白酶溶液消化，吸棄膜蛋 白酶溶液，用Ξ維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基重懸，70μm細胞篩過濾細胞，1000-2000rpm離屯、 5-lOmin，收集細胞沉淀，并用Ξ維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，W化1-1)X108個細胞/ mL的密度接種于5-15mg/血的水凝膠材料上，加入Ξ維培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基，在37°C、5% C〇2條件下培養(yǎng)6-8天，每2-3天換半液。
[0031] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemo;rphogeneticp;rotein，BMP)是I963 年由美國的 MarshallR.化ist教授發(fā)現(xiàn)的。骨形態(tài)發(fā)生蛋白能夠誘導(dǎo)動物或人體間充質(zhì)細胞分化為骨、 軟骨、初帶、肌腫和神經(jīng)組織。它是與胚胎骨骼形成有關(guān)的蛋白質(zhì)，在骨形成的數(shù)個階段均 起作用，由形態(tài)發(fā)生的早期階段開始，并延續(xù)至出生后。在中樞神經(jīng)的發(fā)生中也起著關(guān)鍵作 用。近年來基因重組的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2度MP-2)的安全性和有效性得到了充分的證實， 美國FDA也于2002年7月批準重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2用于脊柱融合?；诠切螒B(tài)發(fā)生蛋 白的安全性和高效誘導(dǎo)成骨活性被越來越多的實驗所證實，在一些國家骨形態(tài)發(fā)生蛋白已 進入大規(guī)模的臨床實驗階段。
[0032] 堿性成纖維細胞生長因子化asicfibroblastgrowthfactor,bFGF)是一種能夠 促進成纖維細胞生長的物質(zhì)，因?qū)λ岷蜔崦舾?，等電點呈堿性巧.6)，稱為堿性成纖維細胞 生長因子化FGF)。bFGF是重要的促有絲分裂因子，也是形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子，其生 物學(xué)效應(yīng)分體內(nèi)和體外兩大部分。體外作用十分強烈，對成纖維細胞、骨細胞、軟骨細胞、血 管內(nèi)皮細胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等具有很強的促細胞分裂增 殖活性。體外細胞培養(yǎng)中能在低濃度（Img/mL)發(fā)揮其作用。
[003引 S維細胞培養(yǎng)技術(shù)（t虹ee-dimensionalcellculture,TDCC)是指將具有Ξ維結(jié) 構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng)，使細胞能夠在載體的Ξ維立體 空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成Ξ維的細胞-載體復(fù)合物。Ξ維細胞培養(yǎng)技術(shù)除可W獲得大 量細胞外，還解決了單層細胞培養(yǎng)與動物實驗之間因體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜 化，難W研究單一過程、中間過程的問題。普通的細胞培養(yǎng)由于細胞在體外改變的環(huán)境下增 生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動物實驗完全在體內(nèi)進行，但由于體 內(nèi)的多種因素制約W及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化，難W研究單一過程，且難 W研究中間過程。Ξ維細胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細胞培養(yǎng)與動物實驗之間的一種技術(shù)，既 能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。
[003