一種大菱鲆肝臟組織細(xì)胞體外構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種大菱解肝臟組織細(xì)胞的體外構(gòu)建方 法及其在魚類營養(yǎng)代謝的分子細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大菱解作為一種肉食性魚類，在人工養(yǎng)殖過程中，其飼料中需要添加魚油。隨著水 產(chǎn)飼料工業(yè)的迅猛發(fā)展，魚油短缺的問題日益突出。植物油W其穩(wěn)定的供應(yīng)量、較高的多不 飽和脂肪酸含量和相對低廉的價格成為較理想的替代脂肪源，但植物油替代魚油的比例過 高會影響魚體的健康和品質(zhì)。近年來在植物油替代魚油的研究上已有了一定進(jìn)展，但在大 菱解飼料中還未能實現(xiàn)W植物油完全替代魚油而不影響其代謝和健康。
[0003] 為進(jìn)一步闡釋植物油替代魚油影響大菱解代謝和免疫的分子機(jī)理，亟需構(gòu)建大菱 解肝臟細(xì)胞體外模型。之前雖有大菱解肝臟組織細(xì)胞原代培養(yǎng)的報道，但存在重復(fù)性差、細(xì) 胞遷出和生長緩慢的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種大菱解肝臟組織細(xì)胞體外構(gòu)建方法，并將其應(yīng)用于魚類 營養(yǎng)代謝的分子細(xì)胞生物學(xué)研究中，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明首先提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基，是添加有20%的胎牛血清、0.5%補(bǔ)體滅活的 花食盧血清、10μg/L的堿性成纖維細(xì)胞生長因子化FGF)、10μg/L表皮樣生長因子巧GF)、 Immol/L丙酬酸鋼、2mmol/L的k丙氨酷谷氨酷胺的kl5培養(yǎng)基。
[0006] 所述的補(bǔ)體滅活的花驢血清，是對花驢靜脈取血后，將血液經(jīng)56°C水浴30min后， 再經(jīng)0. 22μm過濾除菌制成的；
[0007] 上述的細(xì)胞培養(yǎng)基中還添加有抗生素，作為實施例的優(yōu)選，為100000IU/L青霉素 和lOOmg/L鏈霉素。
[0008] 本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)大菱解肝臟組織細(xì)胞；
[0009] 本發(fā)明一方面設(shè)及一種大菱解肝臟組織原代培養(yǎng)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，具體是 利用II型膠原酶消化液處理剪碎的大菱解肝臟組織小塊獲得解離的大菱解肝臟組織小塊， 然后將解離的大菱解肝臟組織小塊接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用上述的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)形成細(xì) 胞單層。
[0010] 上述II型膠原酶消化液的配制方法：是將II型膠原酶溶解于漢克斯平衡鹽溶液 化BSS)中制備的；作為實施例的優(yōu)選，其中II型膠原酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 %的溶液。
[0011] 上述的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行預(yù)處理，具體是吸取纖連蛋白溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 均勻浸潤瓶底，然后吸除多余纖連蛋白溶液，用PBS沖洗后，再用上述的細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗， 備用。
[0012] 上述纖連蛋白溶液是將纖連蛋白溶解于皿SS中制備的。
[0013]本發(fā)明培養(yǎng)的大菱解肝臟組織細(xì)胞在魚類營養(yǎng)代謝的分子細(xì)胞生物學(xué)研究上的 應(yīng)用。將報告基因表達(dá)質(zhì)粒（如PIRES2-eGF巧轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)大菱解肝臟組織細(xì)胞中，可 觀察到綠色巧光蛋白在細(xì)胞中的成功表達(dá)，證明所構(gòu)建的大菱解肝臟組織細(xì)胞體外模型可 用于魚類營養(yǎng)代謝的分子細(xì)胞生物學(xué)研究。
[0014] 本發(fā)明優(yōu)化了培養(yǎng)基的配方，添加了花驢血清、丙酬酸鋼和k丙氨酷谷氨酷 胺，為細(xì)胞的迅速、大量遷出提供了更為全面、充足的營養(yǎng)；調(diào)整了II型膠原酶的配制方法、 濃度和酶解時間，既減小了膠原酶對肝臟組織細(xì)胞的損傷，同時又充分酶解肝臟組織小塊， 促進(jìn)肝臟細(xì)胞的遷出。本發(fā)明所設(shè)及的大菱解肝臟組織細(xì)胞體外模型的構(gòu)建方法，具有簡 便易行、重復(fù)性好、成本低和細(xì)胞生長迅速的優(yōu)點。而且，本發(fā)明所提供的大菱解肝臟組織 原代培養(yǎng)細(xì)胞可成功用于報告基因如綠色巧光蛋白基因的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，表明該體外細(xì)胞模 型可用于魚類營養(yǎng)代謝的分子細(xì)胞生物學(xué)研究。
【附圖說明】
[0015] 圖1:原代培養(yǎng)48小時、72小時、120小時和7天大菱解肝臟組織原代培養(yǎng)細(xì)胞的 光鏡照片，比例尺=lOOym;
[0016] 圖2 :報告質(zhì)粒PIRES2-eGFP轉(zhuǎn)染大菱解肝臟組織原代培養(yǎng)細(xì)胞的巧光顯微鏡照 片，比例尺=100ym;
【具體實施方式】
[0017] 目前，魚類肝臟細(xì)胞原代培養(yǎng)主要采用組織塊和膜酶消化的方法進(jìn)行，但實驗發(fā) 現(xiàn)，組織塊法中的大菱解肝臟組織，細(xì)胞難W遷出，而0. 25 %膜酶酶解法中細(xì)胞成活率較 低。較高濃度和較長作用時間的膠原酶處理，也會損傷大菱解肝臟組織細(xì)胞。為更好地滿 足實驗要求，本發(fā)明調(diào)整了大菱解肝臟組織細(xì)胞原代培養(yǎng)完全培養(yǎng)基的配方，優(yōu)化了II型 膠原酶的配制方法、濃度和酶解時間。為更好地解釋本發(fā)明，W下結(jié)合實例進(jìn)一步闡釋本發(fā) 明的主要內(nèi)容：
[0018] 實施例1 一種大菱解肝臟組織細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。
[0019] 步驟如下：
[0020] (1)培養(yǎng)基的制備，其步驟如下：
[0021] kl5液體培養(yǎng)基購于Sigma公司，100X青鏈霉素溶液和100X丙酬酸鋼溶液購 于索萊寶公司，胎牛血清購于Gibco公司，k丙氨酷谷氨酷胺購于Life公司，生長因 子購于化protech公司；
[0022] 花驢血清的制備方法：2kg左右花驢尾靜脈取血，56°C水浴30min后經(jīng)0. 22μm濾 器過濾除菌制成；
[002引生長因子bFGF和EGF溶液的制備：分別溶解于0. 1 %牛血清白蛋白溶液中，制成lOmg/ml的母液，分裝后-20°C保存。
[0024] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備：每100mlkl5液體培養(yǎng)基中，加入100X青鏈霉素溶液1ml，用 高壓滅菌過的1M氨氧化鋼溶液調(diào)節(jié)抑到7. 4。
[00巧]完全培養(yǎng)基制備：將占完全培養(yǎng)基總體積20%的胎牛血清、0. 5%補(bǔ)體滅活花食盧 血清W及終濃度為10μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10μg/L表皮樣生長因子、Immol/L 丙酬酸鋼及2mmol/Lk丙氨酷A-谷氨酷胺加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，抽濾除菌，制成大菱解 肝臟組織細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
[0026] (2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的纖連蛋白包被處理，具體步驟：吸取1ml25μg/ml纖連蛋白溶 液，加入到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，均勻浸潤瓶底，45min后吸除多余纖連蛋白溶液，備用。
[0027] 上述25μg/ml纖連蛋白溶液的配制方法為：將Img纖連蛋白溶解于40ml皿SS中。
[0028] (3)原代培養(yǎng)具體步驟包括：
[0029] ①實驗魚的選?。哼x取體重約為lOg的健康大菱解幼魚；
[0030] ②實驗魚的暫養(yǎng)：用含lOOOIU/ml青霉素和lOOOIU/ml鏈霉素的無菌海水暫養(yǎng)實 驗魚10小時；
[0031] ③肝臟組織分離：
[0032] 將實驗魚用抄網(wǎng)拱出，在滅菌培養(yǎng)皿中用艦伏（1% )擦拭Ξ次，后轉(zhuǎn)移至超凈臺 中再用70%酒精擦拭Ξ次；在滅菌紗布上用解剖工具解剖試驗魚并無菌分離肝臟組織；注 意，解剖魚體外表及內(nèi)臟的解剖工具不能混用，W減少染菌幾率。
[0033] ④肝臟組織的清洗：