一種適合昆蟲細胞Sf-9的無血清無動物源培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種適合昆蟲細胞Sf-9的無血清無動 物源培養(yǎng)基的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 桿狀病毒表達系統(tǒng)化aculovirusexpressionsystem)是近年來應(yīng)用較多的真核 表達系統(tǒng)，它可W在昆蟲細胞中表達多種外源基因，包括真菌，植物，細菌，病毒的基因。桿 狀病毒是一類W昆蟲細胞為天然宿主的雙鏈DNA病毒，具有高度的種屬特異性，不感染脊 椎動物，對人、畜無害。桿狀病毒表達系統(tǒng)的主要優(yōu)越性有如下特點：
[0003] ①表達的重組蛋白能正確折疊，并形成二硫鍵；
[0004] ②翻譯后可進行修飾加工如糖基化、憐酸化、酷胺化及信號膚切割等，使重組蛋白 在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白； 陽〇化]③與其他真核表達系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達系統(tǒng)可W高效表達外源基因，表達量 最高可達被感染昆蟲細胞總蛋白量的50% ;
[0006] ④可W容納大片段外源基因。
[0007] 目前研究較多的是首猜銀紋夜蛾核多角體病毒（AcNPV)，其宿主是草地貪夜 蛾，而Sf-9細胞，正是桿狀病毒表達系統(tǒng)的宿主細胞之一。Sf-9細胞，即：Spodoptera 化ugiperda(草地夜蛾）卵巢細胞，是由G.E.Smith和C.L.化er巧在1983年從細胞株 IPLB-SF21AE得來的一個克隆。IPLB-SF21AE是1977年由Vau曲η等從草地夜蛾蛹的 卵巢組織得到的。Sf-9細胞屬于半貼壁型細胞系，可W進行懸浮培養(yǎng)，也可W進行貼壁培 養(yǎng)，在應(yīng)用于蛋白的表達與制備純化中，有著許多的優(yōu)點。早些年間Sf-9細胞的培養(yǎng)基常 為TNM-iW培養(yǎng)液，即在Grace'SAntheraea培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，每升培養(yǎng)液加3. 3g酵母粉和 3. 3g乳白蛋白水解物，用1MK0H調(diào)抑到6. 2-6. 4過濾除菌，完整培養(yǎng)液在使用前加入10% 熱滅活的胎牛血清。
[0008] 相對于添加血清的培養(yǎng)，無血清懸浮培養(yǎng)是最為先進的工藝。無血清培養(yǎng)基相比 有血清培養(yǎng)基具有諸多優(yōu)勢：1)可避免血清的外源性污染，因為動物來源血清常攜帶病毒 或支原體；2)可克服血清批次間的差異性，使細胞培養(yǎng)性能更加穩(wěn)定，能提高結(jié)果的重復(fù) 性；如成分相對明確，有利于研究細胞生長、增殖、分化、代謝及基因調(diào)控等一系列細胞行 為；4)可簡化下游目的產(chǎn)物的分離純化，節(jié)省成本。
[0009] 目前，國外的無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品價格高且配方保密，同時國內(nèi)外均缺少專口針對 昆蟲細胞Sf-9細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基性能較差，不能持續(xù)的維持細胞的活 力，或者是成本較高。己斯福股份公司申請的中國專利申請公開號CN1498267A，其所生產(chǎn) 的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，對于運輸和放菌要求極高，并且價格昂貴，不適合我國的目前的培 養(yǎng)基發(fā)展?fàn)顩r。本發(fā)明基于上述狀況，開發(fā)了適合Sf-9懸浮生長的純固體培養(yǎng)基，特別是 將一些脂類經(jīng)過了特殊處理之后，能W固體的形式加入到培養(yǎng)基中，并且使細胞能夠獲得 24化的連續(xù)生長，細胞活力能保持在95%W上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種針對我國工業(yè)生產(chǎn)所用昆蟲細 胞Sf-9細胞的生長的特點，研制適合Sf-9細胞高密度懸浮培養(yǎng)的低成本、無血清、無動物 源、低蛋白培養(yǎng)基。通過添加脂類、維生素、微量元素、重組蛋白和水解物等組分來替代血清 的生物學(xué)功能，避免了血清對后期純化和抗原的分離帶來的一些負面作用。通過對培養(yǎng)基 組分的優(yōu)化，使Sf-9細胞在懸浮培養(yǎng)中增殖速度更快，細胞密度更高，細胞活力更強，更適 合于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)。
[0011] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：提供一種適合懸浮培養(yǎng)Sf-9細 胞的無血清無動物源培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中包括下列含量的原料物質(zhì)：
[0012] (1)氨基酸部分： 陽〇1引 k丙氨酸lOO-SOOmg/l,
[0014] 心谷氨酷胺 900-5500mg/l，
[0015] k精氨酸鹽酸鹽 700-2500mg/l，
[0016] 心天冬氨酸 900-1700mg/l,
[0017] 心天冬酷胺SOO-lSOOmg/l，
[0018] k半脫氨酸一水合物120-320mg/l，
[0019] k谷氨酸l3〇〇-28〇Omg/l,
[0020] 心異亮氨酸 40〇-l3〇Omg/l，
[0021] k亮氨酸 3〇〇-75〇mg/l，
[0022] k賴氨酸鹽酸鹽 400-1600mg/l，
[0023] k蛋氨酸 600-1650mg/l,
[0024] k苯丙氨酸 700-1800mg/X, 陽0巧]k脯氨酸 300-1000mg/l，
[0026] k絲氨酸 200-1050mg/l,
[0027] k蘇氨酸 200-900mg/l，
[0028] k色氨酸 100-400mg/l,
[0029] k酪氨酸二鋼鹽 200-900mg/l，
[0030] k鄉(xiāng)氨酸 300-980mg/l，
[0031] k脫氨酸鹽酸鹽50-85mg/l，
[0032] k組氨酸鹽酸鹽 100-250mg/l，
[0033] k賴氨酸 300-1000mg/l,
[0034] 甘氨酸 200-900mg/L; 陽0對 似無機鹽部分：
[0036] 四水鋼酸錠0. 01-加邑/1，
[0037] 無水氯化巧 100-950mg/l，
[0038] 氯化鋼 1000-7500mg/l,
[0039] 憐酸氨二鋼 10-45mg/l，
[0040] 六水氯化儀 500-800mg/l,
[0041] 無水硫酸儀 200-900mg/l，
[0042] 氯化鐘 400-2350mg/l,
[0043] 一水憐酸二氨鋼 800-1500mg/l,
[0044] 屯水合硫酸鋒0. 1-0. 7mg/l，
[0045] 亞砸酸鋼 0.01-0. 〇3mg/l,
[0046] 硫酸亞鐵0. 01-0.加邑/1，
[0047] 碳酸氨鋼 100-900mg/L; W48] 0)維生素部分：
[0049]生物素 0.005-0.Olmg/l, 陽化0]維生素B12 0. 1-0.Smg/l,
[0051] 氯化膽堿 0.S-Smg/l,
[0052] D-泛酸巧0. 2-加邑/1，
[0053] 葉酸 0. 2-5mg/X,
[0054] 煙酷胺 5-8mg/l， 陽化5] 鹽酸[I比唉醇5-8mg/l,
[0056] 憐酸化唉醒 0.oe-o. 3mg/l，
[0057] 核黃素 0. 08-0. 6mg/l，
[0058] 鉆胺素 0. 04-3mg/l，
[0059] 鹽酸硫胺素 0. 05-0. 5mg/l， 柳6〇]肌醇 5-8mg/L;
[0061] (4)脂類添加部分： 柳創(chuàng) 亞油酸0. 1-0. 3mg/l， 陽〇6；3] 大豆卵憐脂IS-Wmg/l, 柳64]膽固醇 20-60mg/l， 陽0化]腐胺 0. 04-0.Smg/X,
[0066] 乙醇胺 5-40mg/l，
[0067] 無水乙醇 0. 5-2ml/L;
[0068] (5)水解物添加部分：
[0069] 大豆水解物 500-4000mg/l,
[0070] 酵母超濾物 500-4000mg/l,
[0071] 大米水解物 500-2000mg/l，
[0072] (6)其余添加物部分：
[0073] D-葡萄糖 3〇0〇-6〇OOmg/l,
[0074] 丙酬酸鋼 10〇-25〇mg/l， 陽0巧]硫辛酸0.OS-O.emg/l，
[0076] 胸巧 0. 06-0. 5mg/l,
[0077] 腺嚷嶺 0.l-5mg/l，
[0078] 胸腺喀晚 0. 02-2mg/l，
[0079] 重組膜島素3-25mg/l，
[0080] 巧樣酸鐵 0. 02-lmg/l，
[0081] 環(huán)庚Ξ締酪酬 0.l-8mg/l，
[0082] F-68 50-600mg/l,
[0083] 還原型谷脫甘膚0. 01-0. 9mg/l，
[0084] 次黃嚷嶺鋼鹽0.l-5mg/L。
[0085] 其中，F(xiàn)-68是pluronicF-68的簡稱，在細胞培養(yǎng)過程中的常用添加物，對細胞具 有保護作用。
[0086] 關(guān)于"大豆水解物"、"酵母超濾物及"大米水解物"在本領(lǐng)域中有公認(rèn)的含義， 就是將大豆，酵母，大米，經(jīng)過特殊的工藝，包括酶消化、酸處理等手段進行處理后，提取適 合細胞生長組分，目前均有商品化試劑，本發(fā)明具體使用的是Difico公司生產(chǎn)的水解物。
[0087] 本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果如下：本發(fā)明提供一種適宜懸浮培養(yǎng)Sf-9細胞的無血 清、無動物源培養(yǎng)基，它是一種低成本的、適用于Sf-9細胞懸浮培養(yǎng)的無血清、無動物源、 低蛋白培養(yǎng)基，通過一些脂類、維生素、微量元素等成分的添加，特別是通過Ξ種水解物的 添加和優(yōu)化，完全替代了血清的功能，顯著促進了細胞的增殖速度，并使細胞能保持較高的 活力。本發(fā)明開發(fā)了適合Sf-9懸浮生長的純固體培養(yǎng)基，特別是將一些脂類經(jīng)過了特殊處 理之后，能W固體的形式加入到培養(yǎng)基中，并且使細胞能夠獲得24化的連續(xù)生長，細胞活 力能保持在95%W上。
[0088] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的另一個技術(shù)方案是針對于工業(yè)化生產(chǎn)而配置 的一種懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞Sf-9的無血清無動物源培養(yǎng)基的固體實現(xiàn)方法，其特征在于，所 述配制方法包括如下工藝步驟：
[0089] 第一步，在容器中加入注射用水（水溫25°C)至總體積的90% ;
[0090] 第二步，將上述混合好的培養(yǎng)基加入容器中，輕微攬拌溶解；
[0091] 第Ξ步，輕微攬拌至完全溶解，加注射用水至總體積的100% ;
[0092] 第四步，用Imol/L氨氧化鐘溶液或Imol/L鹽酸溶液調(diào)抑至6. 2 ;
[0093] 第五步，用0. 2μm濾膜正壓過濾除菌；
[0094] 第六步，溶液配制完成后應(yīng)在2-8°C下密閉避光保存。 陽0巧]本發(fā)明開發(fā)了適合Sf-9懸浮生長的純固體培養(yǎng)基，特別是將一些脂類經(jīng)過了特 殊處理之后，能W固體的形式加入到培養(yǎng)基中，并且使細胞能夠獲得24化的連續(xù)生長，細 胞的峰值濃度可達1300萬/毫升，細胞活力能保持在95%W上。
【附圖說明】
[0096] 圖1 :Sf-9細胞在本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基JYK-SF9中的生長情況。
[0097] 圖2 :對照組1，即Sf-9細胞在Gibico培養(yǎng)基SF900II當(dāng)中的生長情況。
[0098] 圖3 :對照組2,即Sf-9細胞在蘇州沃美培養(yǎng)基SF-SFM當(dāng)中的生長情況。
【具體實施方式】
[0099] 實施例1.無血清、無動物源、低蛋白培養(yǎng)基的制備
[0100] 本實施例是一種適合Sf-9細胞懸浮培養(yǎng)的無血清無動物源低蛋白培養(yǎng)基 (JYK-S巧），它包括22種氨基酸，12種無機鹽，12種維生素，6種脂類，3種蛋白水解物，12種 添加物；所用材料如無特殊說明均購自sigma公司。具體成分如下： 陽1〇1] (1)氨基酸部分： 陽 1〇2]k丙氨酸lOO-SOOmg/l,
[0103] 心谷氨酷胺 90〇-55〇Omg/l，
[0104] k精氨酸鹽酸鹽 700-2500mg/l， 陽1〇5] 心天冬氨酸90〇-l7〇Omg/l,
[0106]心天冬酷胺SOO-lSOOmg/l， 陽1〇7] k半脫氨酸一水合