專利名稱：帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和p10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒，還涉及該質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
桿狀病毒廣泛用于農(nóng)林害蟲的生物防治。同時(shí)桿狀病毒-昆蟲(細(xì)胞)系統(tǒng)還是十分優(yōu)良的真核表達(dá)系統(tǒng)，已用于外源基因、診斷試劑和疫苗等的研究和生產(chǎn)。和其它桿狀病毒一樣，中國棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒(Helicoverpaarmigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovims，以下簡稱野生型病毒或HaSNPV)作為殺蟲劑由于存在殺蟲速度慢的缺點(diǎn)，致使其大面積控制棉鈴蟲危害的作用受到限制；而不斷提高病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量也一直是當(dāng)今生物工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。對桿狀病毒分子生物學(xué)的研究，特別是對病毒基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究將有助于揭示病毒的復(fù)制和侵染規(guī)律，為重組病毒殺蟲劑和快速、高效表達(dá)載體的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
自1983年Smith和Summers首次報(bào)道利用苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒在Sf9細(xì)胞中表達(dá)人-β干擾素基因，桿狀病毒表達(dá)載體因其能在昆蟲細(xì)胞和昆蟲幼蟲中高效表達(dá)外源基因，且在大多數(shù)請況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有加工和修飾表達(dá)產(chǎn)物的能力，如信號肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有很高的生物活性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為十分重要的真核表達(dá)系統(tǒng)。目前應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已表達(dá)了幾百種不同來源的外源基因。
傳統(tǒng)的重組桿狀病毒構(gòu)建需要按以下兩步進(jìn)行首先必須將外源基因克隆到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上，通常多克隆位點(diǎn)位于桿狀病毒的強(qiáng)啟動子控制下。將轉(zhuǎn)移載體同桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組病毒，重組率通常在0.1-1％之間。其次需用空斑法鑒定和純化重組病毒。由于重組病毒的產(chǎn)生率低以及空斑純化法操作復(fù)雜、耗時(shí)，往往需數(shù)月甚至更長的時(shí)間構(gòu)建一個完整的重組病毒。鑒于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)存在上述兩個缺陷，Kuckow發(fā)明了一種快速、有效構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，即桿狀病毒穿梭表達(dá)載體系統(tǒng)，能在7天內(nèi)完成重組病毒的構(gòu)建和外源基因的高效表達(dá)。該系統(tǒng)由穿梭表達(dá)載體(Bacmid)和快速供體質(zhì)粒(pFastBacTM)兩部分組成。穿梭表達(dá)載體(Bacmid)含有一個低拷貝數(shù)的細(xì)菌DNA復(fù)制子(mini-F replicon)、一個卡那霉素抗性基因和一個半乳糖苷酶基因(lacZα)的8.5kb的DNA片段，同時(shí)一個作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，該片段的插入并不改變lacZα基因的閱讀框。該穿梭表達(dá)載體(Bacmid)既能在E.coli內(nèi)復(fù)制又可在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制形成完整的病毒粒子?？焖俟w質(zhì)粒(pFastBacTM)則是由一個mini-Tn7轉(zhuǎn)位因子組成，在mini-Tn7左右臂之間插入一個慶大霉素抗性基因、一個桿狀病毒特異強(qiáng)啟動子、一個多克隆位點(diǎn)和猴多泡病毒40多聚A(SV40(A)poly)信號序列組成的表達(dá)框。在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)位酶的作用下，克隆于快速供體質(zhì)粒(pFastBacTM)多克隆位點(diǎn)的外源基因能轉(zhuǎn)位至穿梭表達(dá)載體(Bacmid)的mini-attTn7位點(diǎn)上，通過抗生素抗性篩選和藍(lán)白斑篩選鑒定重組穿梭表達(dá)載體(Bacmid)，隨后從E.coli內(nèi)提取穿梭表達(dá)載體DNA轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行外源基因的表達(dá)。該方法具有重組率高、重組病毒篩選方便等優(yōu)點(diǎn)。但該穿梭表達(dá)載體為一個缺失多角體基因的不完整病毒，因而僅能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生病毒，不易判定細(xì)胞是否被重組病毒感染。另外，由于缺失多角體基因，重組病毒不能感染昆蟲，就是說不能在昆蟲體內(nèi)表達(dá)外源基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒，將外源基因快速插入HZ8表達(dá)載體上，快速獲得重組病毒，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因，同時(shí)在P10強(qiáng)啟動子的調(diào)控下，高效表達(dá)外源基因，快速鑒定重組病毒。
本發(fā)明的另一個目的是提供該供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案構(gòu)建了帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒pFastPhP10，CCTCC M201047。帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒(pFastPhP10)轉(zhuǎn)化到Eschrichia Coli DH5α株內(nèi)，-80℃保藏。在帶有苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒多角體基因啟動子序列和P10基因啟動子序列的雙向供體質(zhì)粒(pFastBacdual)的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒(pFastPhP10)，并將綠色熒光蛋白(eGFP)基因插入到P10啟動子控制下的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)在DH10B受體菌中轉(zhuǎn)位后，將插入有多角體基因和綠色熒光蛋白基因的重組穿梭表達(dá)載體(HZ8Ph+eGFP)DNA轉(zhuǎn)染到棉鈴蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，至此已成功構(gòu)建一套完善的棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)。HZ8是利用同源重組的方法將一個含有低拷貝數(shù)的細(xì)菌DNA F復(fù)制因子(mini-F replicon)、一個卡那霉素抗性基因和一個lacZα基因、一個作為細(xì)菌轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini-attTn7)的短片段同時(shí)插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置換到病毒基因組的多角體基因位點(diǎn)上，因此，所構(gòu)建的HZ8是缺少多角體基因的重組病毒，用這種重組病毒感染HzAm1細(xì)胞僅能產(chǎn)生細(xì)胞病變，但不能在細(xì)胞核內(nèi)形成包涵體，在利用pFastPhP10供體質(zhì)粒將外源基因轉(zhuǎn)位到HZ8的轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)(mini-attTn7)后，其DNA轉(zhuǎn)染HzAm1細(xì)胞后，能形成具有感染性的重組病毒粒子，并能在多角體啟動子和P10啟動子控制下表達(dá)外源基因。與苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)系統(tǒng)(AcBacmid)不同的是所構(gòu)建的供體質(zhì)粒(pFastPhP10)既有P10啟動子控制下的多克隆位點(diǎn)又插入帶有多角體啟動子序列的完整的多角體基因。
其優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)外源基因插入到P10控制下的多克隆位點(diǎn)后，經(jīng)轉(zhuǎn)位將外源基因和多角體基因同時(shí)插入到棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒全基因組穿梭表達(dá)載體(HaBcmid)中的轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染到棉鈴蟲細(xì)胞(HzAm1)后，能在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)是否形成包涵體，如細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，證明轉(zhuǎn)染獲得成功，隨后可收集重組病毒粒子再感染細(xì)胞，并可進(jìn)行外源基因表達(dá)水平的檢測。因此多角體基因的表達(dá)和包涵體的形成可作為轉(zhuǎn)染成功的重要識別標(biāo)記。另外，由于重新將多角體基因插入到病毒基因組，所產(chǎn)生的重組病毒是一個不缺失任何基因的重組病毒，因而該重組病毒不僅能在昆蟲細(xì)胞內(nèi)也可在昆蟲幼蟲體內(nèi)表達(dá)外源基因。另一個重要優(yōu)點(diǎn)是便于插入對昆蟲有特異性毒殺作用的毒素基因，構(gòu)建高效、快速的重組病毒殺蟲劑。


圖1為一種pFastPhP10供體質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖2為一種pFastPhP10供體質(zhì)粒的物理圖譜；圖3為一種pFastPhP10供體質(zhì)粒的工作原理示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述根據(jù)圖1、圖2、圖3可知，利用一對特異棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒(HaSNPV)的多角體基因的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴(kuò)增出帶有啟動子序列的多角體基因。
引物序列Ph-1 CGGATCCCTTATACTTCTAAACTGTTCGTCGTCPh-2 CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG；利用一對特異棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒(HaSNPV)的P10啟動子的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴(kuò)增出HaP10啟動子序列。
引物序列P10-1 AGATCTCGAAACCTGACACGAAACGP10-2 GGATCCCGTGATTATTTCGTCGTACAGTTGG；將兩者分別克隆到pGEMT-ease載體上，得到pGEMTP10和pGEMTPh質(zhì)粒；利用Pst I和Bgl II限制性內(nèi)切酶切割pGEMTP10質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的pGEMTP10質(zhì)粒；利用Pst I和BamH I限制性內(nèi)切酶切割pGEMTPh質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的帶有啟動子的多角體基因；利用DNA連接酶將多角體基因連接到pGEMTP10質(zhì)粒上，得到帶有多角體基因和P10啟動子的重組質(zhì)粒，命名為pHZT PhP10質(zhì)粒；用Nhe I和BamH I限制性內(nèi)切酶切割pFastBacdual質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的大pFastBacdual質(zhì)粒片段；用Spe I和BamH I限制性內(nèi)切酶切割pHZTPhP10質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離含有多角體基因和P10啟動子序列的片段；將含有多角體基因和P10啟動子序列的片段連接到第7步制備的大pFastBacdual質(zhì)粒片段上，構(gòu)建成供體重組質(zhì)粒，命名為pFastPhP10質(zhì)粒。
權(quán)利要求
1.一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒，pFastPhP10，CCTCC M201047，在帶有苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒多角體基因啟動子序列和P10基因啟動子序列的雙向供體質(zhì)粒上用棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的多角體基因和P10基因的啟動子序列取代苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒多角體基因啟動子序列和P10基因啟動子序列；載體組裝于Tn7轉(zhuǎn)座子的左右臂序列和帶有自身啟動子的棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒多角體基因和棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的P10基因的強(qiáng)啟動子序列和一個多克隆位點(diǎn)。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括下列步驟A、利用一對棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的多角體基因的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴(kuò)增出帶有啟動子序列的多角體基因；B、利用一對棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的P10啟動子的上下游引物，從HaSNPV的基因組中擴(kuò)增出P10啟動子序列；C、將兩者分別克隆到pGEMT-ease載體上，得到pGEMTP10和pGEMTPh質(zhì)粒；D、用Pst I和Bgl II限制性內(nèi)切酶切割pGEMTP10質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的pGEMTP10質(zhì)粒；E、利用Pst I和BamH I限制性內(nèi)切酶切割pGEMTPh質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的帶有啟動子的多角體基因；F、利用DNA連接酶將多角體基因連接到pGEMTP10質(zhì)粒上，得到帶有多角體基因和P10啟動子的重組質(zhì)粒；G、用Nhe I和BamH I限制性內(nèi)切酶切割pFastBacdual質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離線性化的大pFastBacdual質(zhì)粒片段；H、用Spe I和BamH I限制性內(nèi)切酶切割pHZTPhP10質(zhì)粒，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離含有多角體基因和P10啟動子序列的片段；J、將含有多角體基因和P10啟動子序列的片段連接到第G步制備的大pFastBacdual質(zhì)粒片段上，構(gòu)建成供體重組質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的多角體基因的上下游引物，引物序列引物序列Ph-1 CGGATCCCTTATACTTCTAAACTGTTCGTCGTCPh-2 CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒的P10啟動子的上下游引物，引物序列引物序列P10-1 AGATCTCGAAACCTGACACGAAACGP10-2 GGATCCCGTGATTATTTCGTCGTACAGTTGG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種帶有棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒基因和P10基因啟動子序列的快速供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法，當(dāng)外源基因插入到P10控制下的多克隆位點(diǎn)后，經(jīng)轉(zhuǎn)位將外源基因和多角體基因同時(shí)插入到棉鈴蟲單粒包埋核型多角體病毒穿梭表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)位子插入位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染到棉鈴蟲細(xì)胞后，能在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)是否形成包涵體，如細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，證明轉(zhuǎn)染獲得成功，隨后收集重組病毒粒子再感染細(xì)胞，并可進(jìn)行外源基因表達(dá)水平的檢測。本發(fā)明將外源基因快速插入到HZ8表達(dá)載體上，僅需7－14天就能獲得重組病毒并能在HzAml細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因；在P10強(qiáng)啟動子的調(diào)解下能高效表達(dá)外源基因；能通過多角體表型快速鑒定重組病毒。
文檔編號C12N7/01GK1429903SQ0113837
公開日2003年7月16日 申請日期2001年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月31日
發(fā)明者王漢中, 陳新文, 胡志紅 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所