專利名稱：舞毒蛾核型多角體病毒的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種舞毒蛾病毒的生產(chǎn)方法，其用于生產(chǎn)舞毒蛾病毒殺蟲劑，屬于林木害蟲——舞毒蛾生物防治領域。
背景技術(shù)：
舞毒蛾(Lymantria dispar L.),又名秋千毛蟲、蘋果毒蛾、柿毛蟲,隸屬于鱗翅目 Lepidoptera,毒蛾科Lymantriidae,毒蛾屬Lymantria,是世界性食葉害蟲，具有分布廣、 食性雜、危害重、幼蟲隨風遷移等特點。
由于舞毒蛾對農(nóng)林業(yè)的危害嚴重，近百年來，人們采用了多種方法對舞毒蛾進行防治?；瘜W農(nóng)藥防治是應用最早也是迄今為止應用最為廣泛的防治手段。因其具有經(jīng)濟、有效、方法簡便、不受地形限制等特點，當森林蟲害發(fā)生時，能在短期內(nèi)取得滿意的防治效果，減少經(jīng)濟損失。但大量采用化學制劑防治，產(chǎn)生了嚴重的一 3R”問題，即抗藥性 (Resistance)、再娼獗(Resurgence)和殘留(Residue)。
近年來，隨著人們生活水平的提高和環(huán)保意識的增強，使用和開發(fā)高效、低毒、無公害的農(nóng)藥已成為發(fā)展的必然趨勢。昆蟲病毒不僅具有寄主專一性、防治效果好、不污染環(huán)境、對其它生物安全、不使害蟲產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，而且病毒還能在環(huán)境中積累，通過外界因子的刺激或誘發(fā)等多種途徑在害蟲種群中形成流行病而長期控制蟲口密度，在害蟲的可持續(xù)控制中發(fā)揮重要的作用。
在舞毒蛾防治中，核型多角體病毒(NPV)是最常用的一種。利用舞毒蛾核型多角體病毒(LdNPV)防治舞毒蛾已有幾十年的歷史。國外對LdNPV的應用研究較早，60年代初就開始利用舞毒蛾核型多角體病毒進行林間防治，并取得了較為理想的效果。實驗證明，舞毒蛾核型多角體病毒是影響舞毒蛾種群動態(tài)的主要因子之一，常引起舞毒蛾種群數(shù)量的急劇下降，是有效防治舞毒蛾、降低其危害的有效方法。應用舞毒蛾核型多角體病毒(LdNPV) 防治舞毒蛾在世界各地均取得了良好效果，特別是在各種化學合成殺蟲劑嚴重污染環(huán)境以及害蟲對化學合成殺蟲劑抗性日益增強的情況下，應用舞毒蛾核型多角體病毒防治舞毒蛾顯得尤為重要和迫切。
上述試驗證明，LdNPV對舞毒蛾不但有良好的防治效果，且對哺乳動物無不良影響，值得推廣使用。目前，舞毒蛾核型多角體病毒以在舞毒蛾幼蟲體內(nèi)復制最為經(jīng)濟，且舞毒蛾人工飼養(yǎng)技術(shù)已成功解決，但利用人工飼料飼養(yǎng)的舞毒蛾接毒齡期、接毒濃度、接毒時間對舞毒蛾生長、發(fā)育、存活以及病毒復制量是否存在影響還未見報道。因此，本發(fā)明對舞毒蛾病毒復制最佳幼蟲齡期、接毒濃度、接毒時間等進行了試驗篩選。通過這些試驗完善了舞毒蛾核型多角體病毒工廠化生產(chǎn)流程與方法，擴大了舞毒蛾病毒產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本， 為野外大面積推廣應用舞毒蛾核型多角體病毒防治舞毒蛾奠定基礎。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種舞毒蛾病毒擴增的生產(chǎn)方法，其特征在于，將濃度為I.OX 106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予飼料上，用帶有病毒的飼料來飼養(yǎng)4齡舞毒蛾的幼蟲使其感染，10天后收集感毒蟲或死亡蟲，粉碎、過濾，將濾液離心后收集沉淀。
根據(jù)本發(fā)明，所述舞毒蛾病毒優(yōu)選舞毒蛾核型多角體病毒。
進一步優(yōu)選的，本發(fā)明涉及一種舞毒蛾病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟
I)舞毒蛾病毒的擴增
將配制好的病毒液(濃度為I. OX 106PIB/ml)均勻施予飼料(例如人工飼料)表面， 晾干(以人工飼料表面無水滴為準)后，讓4齡幼蟲取食感染，擴增室溫度優(yōu)選控制在25°C。
2)感毒蟲的收集及病毒提取
健康蟲接毒10天后，收集感毒蟲或死亡蟲，放入容器中，優(yōu)選將其放入_18°C的冰箱中保存，必須保證及時收集，避免蟲體破損造成病毒液流失。
將收集的感毒蟲或死亡蟲的尸體加無菌水稀釋(例如2 3倍)，粉碎(優(yōu)選在高速組織搗碎機上，做間斷勻漿2 3min)，用紗布過濾(優(yōu)選三層)，然后再用篩子過濾(優(yōu)選80 目)，濾液加水稀釋(例如2 3倍)，再離心(例如使用16000r/min離心機)，棄上清液，得沉淀。
將提取的多角體沉淀加適量蒸餾水稀釋，利用血球計數(shù)器在光學顯微鏡下進行觀察計數(shù)。多角體含量不得低于2. 5 X IOkiPIBAiI。
本發(fā)明進一步涉及一種舞毒蛾病毒殺蟲劑的制備方法，將上述擴增得到的舞毒蛾病毒用水稀釋，加入熒光素鈉、防腐劑、乳化劑、甘油，攪拌得到懸浮液劑。在上述制備過程中，優(yōu)選在無菌環(huán)境下進行，所有器皿、分裝盛具均優(yōu)選消毒滅菌，所述水優(yōu)選使用無菌水。
進一步優(yōu)選的，本發(fā)明涉及一種舞毒蛾病毒殺蟲劑的制備方法將已測數(shù)的多角體沉淀物加水稀釋至2. δΧΚΓΡΙΒ/πιΙ，稱取螢光素鈉，再加少量無菌水，充分研磨溶解后， 加入多角體懸液再攪勻；將防腐劑溶于無菌水然后加入前液中攪勻，加入乳化劑攪勻；最后加入甘油，用電動機攪拌(例如20min)。分裝，封口，貼標簽。在配制過程中，應在無菌環(huán)境下進行。
飼毒齡期、飼毒濃度以及飼毒時間均是影響LdNPV室內(nèi)增殖的重要因子。
其中飼毒齡期低于4齡時，幼蟲體重增加速率緩慢，蟲尸重也越小,從而影響最終的病毒獲得量。但齡期若太高(5齡)，會有絕大部分個體發(fā)育至蛹期，最終也影響病毒的產(chǎn)量。舞毒蛾飼毒以4齡幼蟲為最佳。
同飼毒齡期一樣，飼毒濃度對舞毒蛾幼蟲體重、蟲尸重以及含毒量也存在一定影響。飼毒濃度高于1.0X106PIB/ml時，會抑制幼蟲的取食，促進幼蟲死亡的速度，從而影響體重增長，蟲尸重也越低。但飼毒濃度若低于該濃度時，最終死亡幼蟲體重同此濃度無顯著差異，但死亡時間會增加4 - 8d，從而增加一次喂飼次數(shù)，提高人工飼養(yǎng)成本。飼毒濃度以I.0X106PIB/ml 為最佳。
飼毒時間優(yōu)選10天，此時收集的飼毒蟲體重最高，體內(nèi)濃度含量也最高。
根據(jù)本發(fā)明，所述飼料可以為人工飼料，或者為本發(fā)明人于2011年11月19日提交的，申請?zhí)枮?01110318830. 5，發(fā)明名稱為“舞毒蛾核型多角體病毒殺蟲劑的生產(chǎn)工藝” 的在先申請中提及的飼料或人工飼料，其全文引入本文作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，所述人工飼料可以為干酪素35g、韋氏鹽10g、蔗糖12g、果糖23g、麥胚60g、氯化膽堿lg、對輕I. 5g、瓊脂25g、金霉素O. 3g、抗壞血酸4g、4M KOH 5ml、38%甲醒O.5ml、55%亞麻酸4. 3ml、混合維生素IOml (煙酸100g、泛酸I丐100g、核黃素50g、鹽酸硫胺素25g、鹽酸吡哆醇25g、葉酸25g、生物素2g、B120. 2g)、水860ml ;或者
飼料干酪素40g、蔗糖30g、韋氏鹽10g、山梨酸2g、麥胚100g、瓊脂16g、對羥 lg、混合維生素IOg (抗壞血酸280g、氯化膽堿55g、葉酸250ml、肌醇20g、煙酸lg、卩比卩多辛 230mg、膽固醇 50g、B121. 5g)、水 800ml。
根據(jù)本發(fā)明，所述人工飼料包括韋氏鹽4-15重量份、麥胚80-180重量份、干酪素 30-90重量份、鹿糖5-15重量份、抗壞血酸4-15重量份、氯化膽堿0. 3_6重量份、肌醇0. 3-6 重量份、膽固醇0.5-6重量份。優(yōu)選地，進一步包括瓊脂8-25重量份、水適量。更優(yōu)選地， 所述飼料還包括山梨酸0. 3-6重量份。
更優(yōu)選的，本發(fā)明的人工飼料包括韋氏鹽6-10重量份、麥胚100-140重量份、干酪素35-70重量份、蔗糖8-13重量份、抗壞血酸6-10重量份、氯化膽堿0. 5-4重量份、肌醇0.5-4重量份、膽固醇1-5重量份。優(yōu)選地，進一步包括瓊脂10-20重量份、水適量。更優(yōu)選地，所述飼料還包括山梨酸0. 5-4重量份。
特別優(yōu)選的，本發(fā)明的人工飼料中的組分及其重量份為韋氏鹽8重量份、麥胚 120重量份、干酪素50重量份、鹿糖10重量份、抗壞血酸8重量份、氯化膽堿2重量份、肌醇2重量份、膽固醇3重量份。優(yōu)選地，進一步包括瓊脂15重量份、水780重量份。更優(yōu)選地，所述飼料還包括山梨酸2重量份。


圖I :飼毒齡期舞毒蛾幼蟲存活率的影響。
圖2 :飼料濃度對舞毒蛾幼蟲存活率的影響。
圖3 :飼毒齡期對舞毒蛾幼蟲體重增長的影響。
圖4 :飼毒濃度對舞毒蛾幼蟲體重增長的影響。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于實施例。 任何對本發(fā)明做出的改進都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
實施例I :舞毒蛾核型多角體病毒殺蟲劑的生產(chǎn)工藝
I、供試昆蟲和病毒
舞毒蛾2010年4月舞毒蛾卵塊采自內(nèi)蒙古赤峰市烏蘭察布林區(qū)，卵塊用10%甲醛溶液消毒，將同一時期孵出的活潑的一齡幼蟲為供試昆蟲；
舞毒蛾核型多角體病毒(LdNPV)原液北京市西山試驗林場生防中心2000年自北京市房山區(qū)林區(qū)采集獲得，-10°C實驗室保存；
LdNPV母液的制備利用無菌水將上述實驗室保存的LdNPV原液配成濃度為I.0X109PIB/ml 的母液。
2、飼料
韋氏鹽8g、麥胚120g、干酪素50g、鹿糖10g、山梨酸2g、抗壞血酸8g、氯化膽堿2g、 肌醇2g、膽固醇3g、瓊脂15g、水780ml。
3、生產(chǎn)工藝
I)舞毒蛾病毒的擴增
幼蟲發(fā)育4齡時，用滴管吸取舞毒蛾病毒液(濃度為I. OX 106PIB/ml)(由病毒原液稀釋而成)，每杯滴入O. I O. 2ml (約3滴)于人工飼料表面上，晾干(以人工飼料表面無水滴為準)后，每杯放入6條4齡蟲，讓其取食感染，擴增室溫度控制在25°C。
2)感毒蟲的收集及病毒提取
健康蟲接毒10天后，收集感毒蟲或死亡蟲，放入容器中，并將其放入_18°C的冰箱中保存，必須保證及時收集，避免蟲體破損造成病毒液流失。
將收集的病死蟲尸加2 3倍無菌水稀釋，在高速組織搗碎機上，做間斷勻漿2 3min后取出，用三層紗布過濾，然后再用80目篩子過濾，濾液加2 3倍的水稀釋，再用 16000r/min離心機離心,棄上清液,得沉淀。
將提取的多角體沉淀加適量蒸餾水稀釋，利用血球計數(shù)器在光學顯微鏡下進行觀察計數(shù)。多角體含量不得低于2. 5 X IOkiPIBAiI。
3)病毒殺蟲劑的配制
將已測數(shù)的多角體沉淀物加水稀釋至2. 5X IOkiPIBAiI,稱取螢光素鈉，再加少量無菌水，充分研磨溶解后，加入多角體懸液再攪勻；將防腐劑溶于無菌水然后加入前液中攪勻，加入乳化劑攪勻；最后加入甘油，用電動機攪拌20min。分裝，封口，貼標簽。在配制過程中，應在無菌環(huán)境下進行。
制成的產(chǎn)品為濃縮懸浮液劑，濃度為I. 25X IOkiPIBAiL該制劑對光和高溫敏感， 應避光低溫保存。一般情況下，保質(zhì)期為_15°C保存3年，4°C保存2年，常溫保存I年。
實施例2 :飼毒齡期、飼毒濃度、飼毒時間的影響分析
I、實驗
I. I飼毒齡期對舞毒蛾存活的影響以及蟲尸重與病毒含量關(guān)系分析
將I. ILdNPV母液稀釋1000X，倒入盛有新鮮人工飼料的透明塑料養(yǎng)蟲杯(底 Φ =3. 5cm,頂Φ=5. 0cm, H = 5cm)內(nèi)，將多余液體倒出，放于養(yǎng)蟲室內(nèi)陰干后待用。然后分別選取體重相當?shù)奈瓒径?、3、4和5齡幼蟲，單頭放于上述養(yǎng)蟲杯中，蓋蓋后倒置于飼養(yǎng)筐內(nèi)，置于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。室內(nèi)平均溫度25. (TC,RH = 60%，L :D= 16:8。每24小時記錄一次幼蟲體重并清理一次蟲糞,每5d更換一次新鮮帶毒人工飼料，直至完全死亡或化蛹，并分別收集死亡蟲尸，稱重后測病毒顆粒體含量。不同處理重復200次，以浸清水的人工飼料喂飼2 5齡幼蟲為CK。統(tǒng)計分析飼毒齡期對其體重的影響以及蟲尸重與病毒含量之間的關(guān)系。
I. 2飼毒濃度對舞毒蛾存活的影響以及蟲尸重與病毒含量關(guān)系分析
將I. ILdNPV 母液分別稀釋至 I. OX 108、I. OX 107、I. OX 106、I. OX 105、I. OX 104、I.0X103PIB/ml后，倒入盛有新鮮人工飼料的透明塑料養(yǎng)蟲杯(底Φ=3. 5cm，頂Φ=5. 0cm,H =5cm)內(nèi)，將多余液體倒出，放于養(yǎng)蟲室內(nèi)陰干后待用。然后選取體重相當?shù)奈瓒径?齡初幼蟲，單頭放于帶蓋養(yǎng)蟲杯中，試驗條件與方法同上。不同處理重復200次，以浸清水的人工飼料喂飼初孵4齡幼蟲為CK。統(tǒng)計分析飼毒濃度對其體重的影響以及蟲尸重與病毒含量之間的關(guān)系。
I. 3飼毒時間對舞毒蛾含毒量的影響
將I. ILdNPV母液分別稀釋至I. O X 106，倒入盛有新鮮人工飼料的透明塑料養(yǎng)蟲杯 (底Φ =3. 5cm,頂Φ =5. 0cm, H = 5cm)內(nèi)，將多余液體倒出，放于養(yǎng)蟲室內(nèi)陰干后待用。然后選取體重相當?shù)奈瓒径瓿醴?齡幼蟲，單頭放于帶蓋養(yǎng)蟲杯中，單頭放于上述養(yǎng)蟲杯中，蓋蓋后倒置于飼養(yǎng)筐內(nèi)，試驗條件同上。分別自第6、8、10、12、14d收集50頭幼蟲，稱重后測病毒顆粒體含量。統(tǒng)計分析飼毒時間對其體重的影響以及蟲尸重與病毒含量之間的關(guān)系。
I. 4舞毒蛾核型多角體病毒含量測定
收取I. 1,1. 2,1. 3中收集的幼蟲，分別稱重后加蒸餾水至200mL，用組織勻漿器 IOOOOrpm勻衆(zhòng)9min后稀釋至500倍,然后IOOOrpm離心20min,取上清液按最初病毒尸體重量稀釋成2000倍液體(W/V)，鏡檢測定舞毒蛾顆粒體病毒濃度。
應用SPAS軟件對上述試驗相關(guān)數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。具體結(jié)果和分析如圖 1-4及以下分析所示
2、結(jié)果與分析
2. I飼毒齡期和濃度對舞毒蛾存活的影響
2. I. I飼毒齡期對舞毒蛾存活的影響
從圖I可以看出，飼毒濃度一致時，飼毒齡期對舞毒蛾幼蟲存活率影響較大。齡期越大，飼毒后幼蟲開始死亡的時間越長，且全部死亡的時間也越長，即取食的時間越長，有利于幼蟲體重的增長。而低齡幼蟲，如2齡幼蟲，飼毒后9天內(nèi)即全部死亡，死亡時體重較輕，病毒獲得量較少，不利于工廠化病毒的生產(chǎn)。5齡幼蟲喂飼9天后有78%的個體發(fā)育至蛹，也不利于病毒的復制。
2. I. 2飼毒濃度對舞毒蛾存活的影響
如圖2所示，飼毒濃度對4齡舞毒蛾幼蟲存活率存在一定影響，飼毒濃度越大，幼蟲發(fā)生死亡的時間越短，且全部死亡的時間也越短。4齡幼蟲喂飼I. OX 103PIB/ml濃度的病毒后，幼蟲自第Ild開始死亡，自21d全部死亡；而喂飼I. OX 108PIB/ml病毒后，第5d即開始死亡，第Ild時已經(jīng)完全死亡。對照存活率為100%，全部正?；?。
2. 2飼毒齡期和濃度對舞毒蛾體重的影響
2. 2. I飼毒齡期對舞毒蛾體重的影響
舞毒蛾不同齡期的幼蟲飼喂病毒后的體重增長情況如圖3所示。各齡期幼蟲飼毒后體重均低于CK，說明飼毒對各齡期幼蟲體重增長均有不同程度的抑制。最高體重量從高至低依次為CK>5齡>4齡>3齡>2齡，飼毒齡期越小，增長越緩慢。
2. 2. 2飼毒濃度對舞毒蛾體重增長的影響
圖4統(tǒng)計了不同飼毒濃度對舞毒蛾4齡幼蟲體重增長的影響，可以看出，飼毒濃度越高越抑制舞毒蛾的取食，從而影響它死亡時的體重。
2. 3飼毒蟲尸重與病毒含量關(guān)系分析
2. 3. I飼毒齡期對蟲尸重和病毒含量的影響
通過表I可以看出，飼毒齡期與蟲尸重成正相關(guān)，飼毒齡期越大，死后尸體重量越重。其中，2、3齡幼蟲飼毒后蟲尸體重彼此差異不顯著，單頭重量均不超過O. 03g，而4、5齡飼毒幼蟲蟲尸重與2、3齡差異顯著，單頭蟲尸均超過O. 2g。通過表I還可以發(fā)現(xiàn)，蟲尸內(nèi)病毒顆粒體含量與蟲尸體重也成正比,蟲尸體重越大,顆粒體含量越多。因此,室內(nèi)增殖LdNPV 時，還應選取老熟幼蟲進行復制。由于5齡幼蟲飼毒后，有78%個體發(fā)育至蛹，沒有全部死亡，因此，以4齡幼蟲為飼毒蟲最佳。
表I飼毒齡期對舞毒蛾蟲尸重和病毒含量的影響
權(quán)利要求
1.ー種舞毒蛾病毒擴增的生產(chǎn)方法，將濃度為I. OX 106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予飼料上，用上述帶有病毒的飼料來飼養(yǎng)4齡舞毒蛾的幼蟲使其感染，10天后收集感毒蟲或死亡蟲，粉碎、過濾，將濾液離心后收集沉淀。
2.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，包括如下步驟 1)、舞毒蛾病毒的擴增 將配制好的病毒液(濃度為I. OX 106PIB/ml)均勻施予飼料(例如人工飼料)表面，晾干(以人工飼料表面無水滴為準)后，讓4齡幼蟲取食感染，擴增室溫度優(yōu)選控制在25°C ； 2)、感毒蟲的收集及病毒提取 健康蟲接毒10天后，收集感毒蟲或死亡蟲，放入容器中，優(yōu)選將其放入_18°C的冰箱中保存， 將收集的病死蟲尸加無菌水稀釋(例如2 3倍)，粉碎(優(yōu)選在高速組織搗碎機上，做間斷勻漿2 3min)，用紗布過濾(優(yōu)選三層)，然后再用篩子過濾(優(yōu)選80目)，濾液加水稀釋(例如2 3倍),再離心(例如使用16000r/min離心機),棄上清液,得沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述飼料包括韋氏鹽4-15重量份、麥胚80-180重量份、干酪素30-90重量份、鹿糖5-15重量份、抗壞血酸4_15重量份、氯化膽堿O. 3-6重量份、肌醇O. 3-6重量份、膽固醇O. 5-6重量份,優(yōu)選地,進ー步包括瓊脂8-25重量份、水適量,更優(yōu)選地,所述飼料還包括山梨酸O. 3-6重量份。
4.ー種舞毒蛾病毒殺蟲劑的制備方法，將權(quán)利要求1-3任一項中擴增得到的舞毒蛾病毒用水稀釋，加入熒光素鈉、防腐剤、乳化剤、甘油，攪拌得到懸浮液剤，優(yōu)選在無菌環(huán)境下進行，所述水優(yōu)選使用無菌水。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，將已測數(shù)的多角體沉淀物加水稀釋至2.5X IO10PIB/ml，稱取螢光素鈉，再加少量無菌水，充分研磨溶解后，加入多角體懸液再攪勻；將防腐劑溶于無菌水然后加入前液中攪勻，加入乳化劑攪勻；最后加入甘油，用電動機攪拌(例如20min)o
全文摘要
本發(fā)明提供一種舞毒蛾病毒的生產(chǎn)方法，其中對舞毒蛾病毒復制最佳幼蟲齡期、接毒濃度、接毒時間等進行了改進。通過這些改進完善了舞毒蛾核型多角體病毒工廠化生產(chǎn)流程與方法，擴大了舞毒蛾病毒產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，為野外大面積推廣應用舞毒蛾核型多角體病毒防治舞毒蛾奠定基礎。
文檔編號A01P7/04GK102978170SQ20121048031
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者梁洪柱, 陳倩, 田會鵬, 梁曉梅 申請人:北京市西山試驗林場