專利名稱：CRY1EA和CRY1CA的嵌合型δ－內(nèi)毒素蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高活性嵌合型δ-內(nèi)毒素的發(fā)現(xiàn)。通過將Cry1Ea蛋白的多肽結(jié)構(gòu)域(530-587位)用Cry1Ca的多肽結(jié)構(gòu)域(533-602位)進行替換從而在策略上設(shè)計出長度為641個氨基酸殘基的新型δ-內(nèi)毒素(此處稱為嵌合型Cry1E)。在這種方式中，嵌合型毒素含有Cry1Ea的氨基酸殘基1-529、Cry1Ca的氨基酸殘基530-599和Cry1Ea的氨基酸殘基600-616。25個氨基酸殘基的新的多肽作為δ-內(nèi)毒素的C-末端而包括在其中。換句話說就是該多肽構(gòu)成了嵌合型毒素的氨基酸殘基617-641。通過將Cry1Ea的不同部分用在策略上設(shè)計出的氨基酸序列或者其他毒素的部分進行替換可以形成幾個嵌合型毒素。在理論上設(shè)計出1.99kb的核苷酸序列以編碼上面提及的嵌合型δ-內(nèi)毒素。設(shè)計出編碼毒素蛋白的基因(此處稱為cry1E)以便通過引入植物首選的密碼子來獲得植物中的高水平表達。每個氨基酸的植物首選的密碼子均勻地分布以促進有效的翻譯。在5’-末端引入適合于植物中的基因表達的翻譯起始鄰近序列(TAAACCATGGCT)，并在嵌合型毒素的讀碼框的末端引入兩個翻譯終止密碼子(信號)。將總共33個唯一的限制位點以40-80bp的間距均勻地引入基因的全部長度之中。在基因的上游創(chuàng)建BamHI和HindIII限制位點，并在基因的下游創(chuàng)建BamHI和EcoRI限制位點，以便使得其克隆變得容易。(請參考圖2)。
翻譯起始鄰近序列自動在基因的緊靠著起始的地方形成NcoI位點。將基因分成58個重疊的寡核苷酸(長度為40-65個核苷酸)，它們相互之間有長度為6-26個堿基的間隙(請參考

圖1)。每個寡核苷酸具有長度為13-18個核苷酸的重疊，并且其緊鄰的寡核苷酸位于互補鏈上。設(shè)計互補的重疊以保持Tm值位于48-50℃。在DNA合成儀(GeneAssembler Special，Pharmacia，瑞典)上以200nmole的規(guī)模合成寡核苷酸，并在變性尿素-PAGE上進行純化。依照Singh等人(1996)的無連接基因合成方法將所有58個寡核苷酸裝配成1.99kb的雙鏈DNA(此處稱為嵌合型cry1E基因)，這顯示在圖1中。用HindIII和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化該DNA，并克隆進pBluescriptII SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中。將該質(zhì)粒命名為pPK200。合成DNA的核苷酸序列通過在自動DNA測序系統(tǒng)(Applied Biosystems 373A型)上對克隆得到的合成DNA進行測序而加以確認。
還構(gòu)建了盒(cassette)以用于在T71ac啟動子的控制下于大腸桿菌中表達嵌合型毒素。用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI消化質(zhì)粒pPK200，并克隆進表達載體pET-19b(Novagen，Madison WI)中。將該質(zhì)粒命名為pPK206。通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增編碼Cry1Ca和Cry1Ea毒素的DNA，其使用能夠在擴增子的上游和下游形成NcoI和BamHI限制位點的合適的引物。將擴增出的產(chǎn)物克隆進pET-19b載體中。將具有編碼Cry1Ca和Cry1Ea毒素的DNA的構(gòu)建體分別命名為pPK135和pPK141。用構(gòu)建體pPK206、pPK135和pPK141轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3菌株。(請參考圖3)。通過用合適濃度的IPTG進行誘導(dǎo)而表達毒素蛋白。表達于15℃進行以避免可能的錯誤折疊。用溶菌酶裂解大腸桿菌細胞，并進行超聲處理，以釋放出δ-內(nèi)毒素。在包含體中發(fā)現(xiàn)有毒素蛋白。將這些包含體于28℃溶解在50mM的碳酸氫鹽緩沖液(pH9.5)中。毒素蛋白通過光密度測定方法進行定量。將系列稀釋的毒素混合入半合成飼料中，并將混合物倒入培養(yǎng)皿中?？偞竽c桿菌蛋白質(zhì)用作對照飼料。將15條斜紋灰翅夜蛾的新生幼蟲釋放到置于100-ml燒杯中的餅狀飼料混合物之上，并用薄紗織物覆蓋杯口以允許空氣交換。每個實驗重復(fù)進行六次。每隔一天之后更換一次飼料。生物測定以16/8小時的光周期于25±0.2℃進行。在飼養(yǎng)7天之后記錄毒性數(shù)據(jù)。EC50通過標準的log-概率值分析來測定。全部三種蛋白質(zhì)同時進行測定。具有代表性的結(jié)果顯示于下面的表1中。 表1δ-內(nèi)毒素(S)EC50(μg/ml半合成飼料) Cry1Ea ＞108 Cry1Ca 29.48±1.77 嵌合型Cry1E 6.27±0.59 結(jié)果顯示了表達嵌合型毒素的大腸桿菌菌株具有超過Cry1Ea蛋白幾倍的毒性，和具有超過Cry1Ca蛋白4倍以上的毒性。Cry1Ea毒素蛋白不能對灰翅夜蛾幼蟲產(chǎn)生任何影響。結(jié)果表明成功地改造了Cry1Ea毒素而形成新型蛋白質(zhì)即嵌合型Cry1E，其具有生物活性，并且為經(jīng)改良的毒素。經(jīng)改造的蛋白質(zhì)具有比Cry1Ca蛋白高4倍的毒性，Cry1Ca蛋白是最眾所周知的抗灰翅夜蛾屬物種的δ-內(nèi)毒素。
還將全部三種δ-內(nèi)毒素進行抗實夜蛾屬物種的72小時大小的幼蟲的測試。將每只幼蟲釋放在置于分離的盒中的飼料上。用每種濃度的毒素測試40只幼蟲。毒性結(jié)果顯示出嵌合型毒素對于實夜蛾也具有毒性。具有代表性的結(jié)果顯示于下面的表2中。
表2δ-內(nèi)毒素(S) EC50(μg/ml半合成飼料)Cry1Ea ＞176Cry1Ca 136.22±8.77嵌合型Cry1E 26.71±1.39 在此處使用時，“毒素”表示對于殺昆蟲害蟲的活性起著重要作用的N-末端部分。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠通過添加同源或異源δ-內(nèi)毒素的部分或完整C-末端片段而將該毒素轉(zhuǎn)化為前毒素。這種前毒素將會是在微生物細胞(例如大腸桿菌、假單胞菌(Pseudomonas)等等)中非常穩(wěn)定的分子，并可以用于形成微生物配劑。這種配劑可以用作殺蟲劑。用由我們開發(fā)出的新型毒素來形成這種前毒素和配劑也在我們所要求保護的發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明有用的基因和毒素不僅包括長度為641氨基酸的毒素，而且包括所述新的序列的片段、變體和突變體，它們保持了此處特別地舉例說明的毒素的特征性殺蟲活性。在此處使用時，術(shù)語基因的“變體”或“變異體”是指編碼同樣的毒素或編碼具有較低或相等殺蟲活性的毒素的核苷酸序列。在此處使用時，術(shù)語“相等的殺蟲活性”是指具有與所要求保護的毒素具有類似的或基本上同樣的抗目標害蟲生物活性的毒素。
本領(lǐng)域經(jīng)訓(xùn)練的技術(shù)人員可以很容易地創(chuàng)建出另外的編碼同樣或基本同樣的毒素的DNA序列。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在此處使用時，“基本上同樣的”序列是指具有氨基酸的替換、缺失、添加或插入但沒有實質(zhì)性地影響殺蟲活性的序列。保持了殺蟲活性的片段也包括在此定義之內(nèi)。
本發(fā)明的新型嵌合型毒素已經(jīng)在此處特別地進行了舉例說明。應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，本發(fā)明包括具有與舉例說明的毒素同樣或類似的殺蟲活性的變體或者相當(dāng)?shù)亩舅?和編碼相當(dāng)?shù)亩舅氐暮塑账嵝蛄?。相當(dāng)?shù)亩舅貢c舉例說明的毒素具有氨基酸同源性。這一氨基酸同源性通常會高于75％，優(yōu)選高于90％，最優(yōu)選高于95％。這一氨基酸同源性在毒素的關(guān)鍵性區(qū)域中是最高的，這些關(guān)鍵性區(qū)域造成了生物活性的出現(xiàn)，或者參與了三維構(gòu)型的決定，這種三維構(gòu)型最終對于生物活性起著重要作用。在這一點上，某些氨基酸替換是可接受的和可以希望的，如果這些替換位于對于生物活性來說不是關(guān)鍵性的區(qū)域之中，或者這些替換是不影響分子的三維構(gòu)型的保守氨基酸替換。例如，氨基酸可以分為下列類別非極性的、無電荷的極性的、堿性的和酸性的。將一個類別的一個氨基酸用同一類別的另一個氨基酸進行替換的保守替換在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要該替換不實質(zhì)性地改變δ-內(nèi)毒素的生物活性。下面給出的表3提供了屬于每個類別的氨基酸的例子的列表。
表3氨基酸的類別氨基酸的例子非極性的Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp無電荷的極性的Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性的Asp、Glu堿性的Lys、Arg、His 在一些情況下，也可以進行非保守的替換。關(guān)鍵性的因素是這些替換一定不能顯著地降低毒素的生物活性。在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域經(jīng)訓(xùn)練的技術(shù)人員的能力之內(nèi)，可以用丙氨酸替換嵌合型毒素的任何氨基酸。任何氨基酸的這種替換是最安全的，因為丙氨酸是常見的氨基酸。這種替換也正好位于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可以將編碼本發(fā)明的嵌合型毒素的基因?qū)牒芏喾N微生物或植物宿主中。毒素基因的表達直接或間接地導(dǎo)致在細胞內(nèi)產(chǎn)生和維持殺蟲嵌合型毒素。使用合適的微生物宿主例如假單胞菌可以將微生物施用于害蟲增殖的地點。這將會導(dǎo)致控制住害蟲?？蛇x擇地，含有毒素基因的微生物可以在延長毒素的活性和穩(wěn)定細胞的條件下進行處理。然后可以將保持了毒性活性的經(jīng)處理的細胞施用于目標害蟲的環(huán)境中。當(dāng)將編碼嵌合型毒素的基因通過合適的載體導(dǎo)入微生物宿主中，并將該宿主以有生命狀態(tài)施用于環(huán)境中時，必要的是使用某些宿主微生物。選擇那些已知占據(jù)了一種或多種目標農(nóng)作物的“植物圈”(葉面、葉圈、根際和/或根面)的微生物。選擇這些微生物以致能夠成功地在特殊環(huán)境(農(nóng)作物和其他昆蟲生活環(huán)境)中與野生型微生物進行競爭，從而能夠穩(wěn)定地維持和表達表達多肽殺蟲劑的基因，和按希望能夠更好地保護殺蟲劑不受環(huán)境降解和失活的影響。
已知大量的微生物存在于很多種重要農(nóng)作物的葉面(植物葉片的表面)和/或根際(圍繞植物根的土壤)。這些微生物包括細菌、藻類和真菌。其中特別感興趣的微生物例如為細菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilius)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotoba cter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)；真菌，特別是酵母，如酵母屬(Saccharomyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)和短梗霉屬(Aureobasidium)。其中特別感興趣的是那些植物圈的細菌物種，如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、根瘤土壤桿菌(Agrobactetiumtumefaciens)、類球紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhozobiummelioti)、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes entrophus)和棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和那些植物圈的酵母物種，如深紅酵母(Rhodotorula rubra)、黏紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、橙黃紅酵母(R.aurantiaca)、淺白隱球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隱球酵母(C.diffluens)、羅倫隱球酵母(C.laurentii)、羅斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、擲孢酵母(Sporobolomycesroseus)、香氣擲孢酵母(S.odorus)、佛地克魯維酵母(Kluyveromycesveronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。其中特別感興趣的是有顏色的微生物。有很多種方法可用于在這樣的情況下將編碼嵌合型毒素的基因?qū)胛⑸锼拗髦?，即這種情況使得能夠穩(wěn)定地維持和表達該基因。這些方法對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是熟知的，并描述于例如U.S.Pat.No.5,135,867之中，此處引用作為參考。
構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體以形成轉(zhuǎn)基因植物。將質(zhì)粒pPK58(含有具有雙重增強子的CaMV35S啟動子)用BamHI和HindIII進行消化，并將質(zhì)粒pPK200用HindIII和EcoRI進行消化，以便分別切出具有雙重增強子的CaMV35S啟動子和嵌合型cr1E基因。施行三重連接以便將這兩個片段克隆進pLITMUS38克隆載體(New England Biolabs)中。該質(zhì)粒即pPK59在嵌合基因的上游含有具有雙重增強子的CaMV35S啟動子。pPK59的限制性內(nèi)切酶酶切分析顯示在圖2中。在嵌合基因的下游克隆了nos轉(zhuǎn)錄終止子。擴增nos聚腺苷酸化元件的DNA，這是使用pBI101.1作為模板并使用能夠分別在上游和下游形成MfeI和EcoRI限制位點的合適的引物來進行的。用EcoRI消化質(zhì)粒pPK59，并在用MfeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化之后克隆PCR產(chǎn)物。挑選出這樣的克隆并命名為pPK201，即在該克隆中合成基因的EcoRI限制位點與nos終止子的MfeI位點相連(因為它們具有匹配末端)。通過限制性內(nèi)切酶酶切分析還可以通過測序來確認nos終止子的正確方向。將表達盒(具有E-35S啟動子和nos終止子的合成的cry基因)克隆進Ti二元載體中。將質(zhì)粒pPK201的BamHI-EcoRI片段克隆進pBI101.1中以替換pBI101.1的BamHI-EcoRI片段(uidA基因和nos終止子)。將該二元載體命名為pPK202。大腸桿菌和植物表達載體的圖譜顯示在圖3中。
為了研究嵌合型Cry1E毒素在植物中的效能，選擇煙草用于表達。根據(jù)由Cangelosi等人(1991)所討論的“土壤桿菌的電穿孔”的修改方案，用二元載體pPK202轉(zhuǎn)化含有輔助質(zhì)粒pAL4404的根瘤土壤桿菌菌株LBA 4404，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落對于抗生素鏈霉素、利福平和卡那霉素進行選擇。根據(jù)Horsch等人(1985)的方法進行土壤桿菌介導(dǎo)的煙草栽培品種Patit Havana(Nicotiana tobacum cv.Patit Havana)的轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)基因植物對于抗生素卡那霉素進行選擇。編碼嵌合型毒素的基因的存在通過PCR和Southern分析來確認，轉(zhuǎn)基因的表達通過RT-PCR、Western分析和ELISA來加以確定。ELISA結(jié)果顯示出，在選擇出的轉(zhuǎn)基因品系中，在總?cè)芙馊~蛋白質(zhì)之中毒素蛋白有0.5％的表達。該高水平的表達是設(shè)計了在其中專門使用植物首選密碼子的基因的結(jié)果。在該研究中使用的植物首選翻譯起始鄰近序列也會在獲得增強的表達中起重要的作用。
使用兩個月大小的轉(zhuǎn)基因植物和斜紋灰翅夜蛾的1齡與5齡幼蟲來施行昆蟲生物測定。(請參考圖4-6)。將15cm2的轉(zhuǎn)基因植物和對照植物的葉片圓盤置于在底部含有弄濕的紙的圓柱形盒子之中，然后在它們上面釋放10條1齡幼蟲。盒口用濕的薄紗織物覆蓋以保持足夠的濕度和空氣交換。于25±0.2℃重復(fù)三次進行毒性實驗，并保持16/8小時的光周期。在使用5齡幼蟲的生物測定中，使用完整的轉(zhuǎn)基因植物和對照植物的葉片。將葉柄置于位于含有MS鹽溶液的250ml燒瓶上方的棉花塞之中，以克服葉片的萎蔫。在每個葉片上允許飼養(yǎng)5條昆蟲幼蟲。對照植物的葉片每8小時之后進行更換，它們被昆蟲幼蟲完全吃光了。
結(jié)果(圖4和6)表明，1齡以及5齡幼蟲在48-72小時之內(nèi)死亡。被1齡幼蟲吃掉的葉片的數(shù)量與被狼吞虎咽地吃掉的對照植物葉片圓盤相比是可以忽略的。攝取大約1cm2的轉(zhuǎn)基因葉片就足夠殺死5齡幼蟲。這些幼蟲在轉(zhuǎn)基因葉片上飼養(yǎng)8-16小時之后顯現(xiàn)出瀕死的狀態(tài)，并最后在2-3天之內(nèi)死亡。在葉片表面上觀察到具有高水份含量的綠色排泄物。一些幼蟲在死亡之前顯示出嚴重的體重損失。在一個分開的實驗中，讓不同齡期的幼蟲在轉(zhuǎn)基因植物的葉片上飼養(yǎng)1小時、2小時、4小時、8小時和16小時，然后將它們轉(zhuǎn)移至對照植物葉片上。觀察到在轉(zhuǎn)基因植物上飼養(yǎng)8小時足夠引起處于所有發(fā)育階段的幼蟲的100％死亡率，甚至是在非轉(zhuǎn)基因植物上飼養(yǎng)之后。年幼的幼蟲攝取非常少量的毒素，這將它們的蛹化從15天的正常幼蟲周期延遲了10-15天。少數(shù)逃脫死亡的幼蟲發(fā)育成蛾。40％的使用這種蛾的配對交配得到了卵?？墒?，這些卵是不育的和不能孵化。從轉(zhuǎn)基因煙草植物中提取總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)，并上載至Sepharose Q離子交換柱上。用梯度增加的氯化鈉洗脫下蛋白質(zhì)，匯集含有δ-內(nèi)毒素的峰，并在G10柱上進行脫鹽。將洗脫下的蛋白質(zhì)混合入半合成飼料中。也進行類似的從非轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉片中的蛋白質(zhì)提取和純化，并將這種植物蛋白質(zhì)用作對照。依照前面的討論施行毒性實驗。對于斜紋灰翅夜蛾和棉鈴蟲的EC50為37ng/ml人工飼料和285ng/ml人工飼料。結(jié)果再次確認了嵌合型δ-內(nèi)毒素對于目標昆蟲害蟲的效能。
用于控制昆蟲害蟲的新型δ-內(nèi)毒素和用于該新型δ-內(nèi)毒素在植物中高水平表達的基因，這包括下列步驟在理論上設(shè)計一種新型δ-內(nèi)毒素(此處稱為嵌合型Cry1E)，這是通過將Cry1Ea蛋白的多肽結(jié)構(gòu)域(530-587位)用Cry1Ca的多肽結(jié)構(gòu)域(533-602位)進行替換，并在蛋白質(zhì)的C-末端加入新的長度為25個氨基酸殘基的多肽以增加穩(wěn)定性，從而設(shè)計出來的；在理論上設(shè)計出用于在植物中以高水平表達嵌合型δ-內(nèi)毒素的基因；設(shè)計并化學(xué)合成代表了理論上設(shè)計出的基因的寡核苷酸；將寡核苷酸裝配成雙鏈DNA，克隆，并對于克隆得到的合成DNA進行序列分析；構(gòu)建用于在大腸桿菌和植物中表達嵌合基因的載體；在大腸桿菌中表達合成基因；比較嵌合蛋白與親本蛋白抗斜紋灰翅夜蛾的毒性；用嵌合基因轉(zhuǎn)化植物如煙草；在轉(zhuǎn)基因植物中高水平表達經(jīng)改造的蛋白質(zhì)；和評價嵌合型毒素在轉(zhuǎn)基因植物中抗斜紋灰翅夜蛾的保護能力。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，涉及Cry1Ea的氨基酸1-529、Cry1Ca的氨基酸530-599、Cry1Ea的氨基酸600-616和新型多肽的氨基酸617-641，以及其在結(jié)構(gòu)上和/或在功能上相當(dāng)?shù)淖凅w或其片段。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述毒素具有SEQ ID No.1中顯示的氨基酸序列；并且顯示出比親本毒素Cry1Ea和Cry1Ca高幾倍的對于目標鱗翅目昆蟲的毒性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，編碼具有抗鱗翅目昆蟲活性的嵌合型毒素的嵌合型cry1E基因具有SEQ ID No.2中顯示的核苷酸序列或其片段。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，使用該蛋白質(zhì)控制鱗翅目害蟲的方法使用有效劑量的就這樣應(yīng)用的毒素，或者使用有效劑量的作為化學(xué)或微生物配劑的組分進行應(yīng)用的毒素。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，重組DNA轉(zhuǎn)移載體含有編碼具有抗鱗翅目昆蟲活性的毒素的多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列具有SEQID No.2的核苷酸序列或其片段。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，用該基因轉(zhuǎn)化重組宿主。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述宿主為微生物，例如大腸桿菌、假單胞菌、酵母、藍細菌和/或其他微生物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主為表達毒素的植物，例如煙草、棉花、鷹嘴豆、pegeonpea、花生、花椰菜、甘藍、紅辣椒、辣椒和/或其他植物，其中該毒素具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，或者其具有相等的抗鱗翅目昆蟲活性的變體。
在本發(fā)明的進一步的實施方案中，本申請清楚地表明，在蛋白質(zhì)中更特別是在內(nèi)毒素的領(lǐng)域中，沒有發(fā)現(xiàn)序列的高度同源性能夠造成任何顯著的活性上的差異。上面提及的內(nèi)毒素Cry1Aal至Cry1Aa6的例子清楚地反映了本工作的本質(zhì)。在本申請中，申請者觀察到了特別高的殺蟲活性。此外，也發(fā)現(xiàn)在本申請的嵌合蛋白Cry1E的序列中的70％及以上同源性沒有顯示出活性上的顯著變化。這意味著與嵌合蛋白Cry1E具有70％及以上序列同源性的蛋白質(zhì)可用作殺蟲劑。
下面的實施例是作為舉例說明而給出的，因此不應(yīng)當(dāng)將它們解釋為限制了本發(fā)明的范圍。
實施例1 在大腸桿菌中表達的新型嵌合型Cry1E對于鱗翅目昆蟲害蟲的幼蟲的相當(dāng)?shù)亩拘? 通過將Cry1Ea蛋白的多肽結(jié)構(gòu)域(530-587位)用Cry1Ca的多肽結(jié)構(gòu)域(533-602位)進行替換從而在策略上設(shè)計出長度為616個氨基酸殘基的嵌合型δ-內(nèi)毒素(此處稱為嵌合型Cry1E)。如前所述在C-末端附加地包含有25個氨基酸殘基的多肽。在理論上設(shè)計出1.99kb的核苷酸序列以編碼上面提及的嵌合型δ-內(nèi)毒素。每個氨基酸的密碼子均勻地分布以避免在翻譯期間暫時的tRNA缺乏。在所設(shè)計的基因中形成幾個6堿基切割體限制性內(nèi)切酶酶切位點。在所設(shè)計的基因的5’-末端形成BamHI、HindIII和NcoI限制位點，和在3’-末端形成EcoRI限制位點。將基因分成58個重疊的寡核苷酸(長度為40-65個核苷酸)。每個寡核苷酸具有長度為13-18個核苷酸的重疊，其緊鄰的寡核苷酸位于互補鏈上(Tm位于48-50℃)。在DNA合成儀(Gene Assembler Special，Pharmacia，瑞典)上以200nmole的規(guī)模合成寡核苷酸，并在變性尿素-PAGE上進行純化。依照Singh等人(1996)的無連接基因合成方法將所有58個寡核苷酸裝配成雙鏈DNA(此處稱為嵌合型cry1E基因)，這顯示在圖1中。用HindIII和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化該DNA，并克隆進pBluescriptII SK(+)(Stratagene)中。將該質(zhì)粒命名為pPK200。合成DNA的核苷酸序列通過在自動DNA測序系統(tǒng)(Applied Biosystems373型)上對克隆得到的合成DNA進行測序而加以確認。
還構(gòu)建了盒以用于在T7啟動子的控制下于大腸桿菌中表達嵌合型毒素。為此，用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI消化質(zhì)粒pPK200，并克隆進表達載體pET-19b(Novagen)中。將該質(zhì)粒命名為pPK206。通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增編碼Cry1Ea和Cry1Ca的毒素部分的DNA，其使用分別在兩個DNA中能夠在擴增子的上游和下游形成NcoI和BamHI限制位點的合適的引物。將擴增出的產(chǎn)物于NcoI和BamHI位點克隆進同一載體(pET-19b)中。如前所述將具有Cry1Ea毒素DNA的構(gòu)建體命名為pPK141，和將具有Cry1Ca毒素DNA的構(gòu)建體命名為pPK135。用構(gòu)建體pPK141、pPK135和pPK206轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3菌株。通過用合適濃度的IPTG進行誘導(dǎo)而表達毒素蛋白。表達于15℃進行以避免任何可能的毒素的錯誤折疊。毒素蛋白在變性聚丙烯酰胺凝膠上通過光密度測定方法進行定量。將系列稀釋的毒素混合入半合成飼料中?？偞竽c桿菌蛋白質(zhì)用作飼料中的對照。將15條斜紋灰翅夜蛾的新生幼蟲釋放到置于100-ml燒杯中的餅狀飼料混合物之上，并用薄紗織物覆蓋杯口以允許空氣交換。每個實驗重復(fù)進行六次。每隔一天之后更換一次飼料。生物測定以16/8小時的光周期于25±0.2℃進行。在飼養(yǎng)7天之后記錄毒性數(shù)據(jù)。EC50通過標準的log-概率值分析來測定。全部三種蛋白質(zhì)同時進行測定。具有代表性的結(jié)果顯示于下面給出的表4中。
表4δ-內(nèi)毒素(S) EC50(μg/ml半合成飼料)Cry1Ea ＞108Cry1Ca 29.48±1.77嵌合型Cry1E 6.27±0.59 結(jié)果顯示了嵌合型毒素具有超過Cry1Ea蛋白幾倍的毒性，和具有超過Cry1Ca蛋白4倍的毒性。Cry1Ea毒素蛋白不能引起任何灰翅夜蛾幼蟲的死亡或生長阻滯。結(jié)果表明成功地改造了Cry1Ea毒素而將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚圆⒌玫礁纳频亩舅?。?jīng)改造的蛋白質(zhì)具有比Cry1Ca蛋白更高的毒性，Cry1Ca蛋白是最眾所周知的抗灰翅夜蛾屬物種的δ-內(nèi)毒素。
用棉鈴蟲的幼蟲來施行類似的毒性實驗。在這種情況下，將72小時大小的幼蟲釋放在含有三種蛋白質(zhì)中的一種的半合成飼料上，并且每個盒中只釋放1條幼蟲。在飼養(yǎng)7天之后記錄體重損失。具有代表性的結(jié)果顯示于下面的表5中。表5 δ-內(nèi)毒素(S) EC50(μg/ml半合成飼料) Cry1Ea ＞176 Cry1Ca 136.22±8.77 嵌合型Cry1E 26.71±1.39 結(jié)果表明，由我們設(shè)計的新型嵌合型δ-內(nèi)毒素不僅對于灰翅夜蛾更具有毒性，而且抗實夜蛾也是有效的。該設(shè)計已經(jīng)擴大了毒素的宿主范圍，以及以相當(dāng)大的程度將毒性增強至超過親本蛋白。
實施例2 表達新型嵌合型Cry1E蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的高度幼蟲毒性 為了確認新型嵌合型毒素在植物中的效能，構(gòu)建一個植物轉(zhuǎn)化載體以用于形成轉(zhuǎn)基因植物。將質(zhì)粒pPK58(含有具有雙重增強子的CaMV35S啟動子)用BamHI和HindIII進行消化，并將質(zhì)粒pPK200用HindIII和EcoRI進行消化，以便分別切出具有雙重增強子的CaMV35S啟動子和嵌合型cry1E基因。施行三重連接以便將這兩個片段克隆進pLITMUS38克隆載體(New England Biolabs)中。將該質(zhì)粒命名為pPK59，其在嵌合基因的上游含有具有雙重增強子的CaMV35S啟動子。在嵌合基因的下游克隆了nos轉(zhuǎn)錄終止子。擴增nos聚腺苷酸化元件，這是使用pBI101.1作為模板并使用能夠分別在上游和下游形成MfeI和EcoRI限制位點的合適的引物來進行的。用EcoRI消化質(zhì)粒pPK59，并在用MfeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化之后克隆PCR產(chǎn)物。挑選出這樣的克隆并命名為pPK201，即在該克隆中合成基因的EcoRI限制位點與nos終止子的MfeI位點相連(因為它們具有匹配末端)。通過限制性內(nèi)切酶酶切分析還可以通過DNA測序來確認nos終止子的正確方向。將表達盒(具有E-35S啟動子和nos終止子的合成的cry基因)克隆進Ti二元載體中。將質(zhì)粒pPK201的BamHI-EcoRI片段克隆進pBI101.1中以替換pBI101.1的BamHI-EcoRI片段(uidA基因和nos終止子)。將該二元載體命名為pPK202。大腸桿菌和植物表達載體的構(gòu)建示意性地顯示在圖3中。該構(gòu)建體具有多核苷酸序列TAAACCATG GCT作為植物首選的翻譯起始鄰近序列，在合成基因中導(dǎo)入TAA TGA用于翻譯終止。根據(jù)由Cangelosi等人(1991)所討論的“土壤桿菌的電穿孔”的修改方案，用二元載體pPK202轉(zhuǎn)化含有輔助質(zhì)粒pAL4404的根瘤土壤桿菌菌株LBA4404，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落對于抗生素鏈霉素、利福平和卡那霉素進行選擇。根據(jù)Horsch等人(1985)的方法進行土壤桿菌介導(dǎo)的煙草栽培品種Patit Havana(Nicotiana tobacum cv.Patit Havana)的轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)基因植物對于抗生素卡那霉素進行選擇。編碼嵌合型毒素的基因的存在通過PCR和Southern分析來確認，轉(zhuǎn)基因的表達通過RT-PCR、Western分析和ELISA來加以確定。ELISA結(jié)果顯示出，在選擇來用于這些實驗的轉(zhuǎn)基因品系中，在總?cè)芙馊~蛋白質(zhì)之中毒素蛋白有0.5％的表達。該高水平的表達是設(shè)計了在其中專門使用植物首選密碼子的基因的結(jié)果。植物首選的翻譯起始鄰近序列也會在表達中起重要的作用。使用兩個月大小的轉(zhuǎn)基因植物和斜紋灰翅夜蛾的新生幼蟲來施行昆蟲生物測定。將15cm2的轉(zhuǎn)基因植物和對照植物的葉片圓盤置于在底部含有弄濕的紙的圓柱形盒子之中，然后在它們上面釋放10條1齡幼蟲。盒口用濕的薄紗織物覆蓋以保持足夠的濕度和允許空氣交換。于25±0.2℃重復(fù)六次進行毒性實驗，并保持16/8小時的光周期。結(jié)果(圖4)顯示出表達新型嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物對于斜紋灰翅夜蛾的新生幼蟲具有高度的毒性，其在飼養(yǎng)48小時之內(nèi)引起100％的死亡率。昆蟲幼蟲對于葉片圓盤所造成的損害與被幾乎完全吃光的對照植物葉片圓盤相比是可以忽略的。轉(zhuǎn)基因植物的高水平的保護以及由于在轉(zhuǎn)基因植物上進行飼養(yǎng)而造成的灰翅夜蛾幼蟲的死亡再次證明了嵌合型毒素和轉(zhuǎn)基因植物的效能。
實施例3 嵌合型Cry1E蛋白對于灰翅夜蛾物種處于所有發(fā)育階段的幼蟲的高毒性 對于1齡(3天大小)、3齡(7天大小)和5齡(12天大小)幼蟲進行生物測定以確定在轉(zhuǎn)基因植物中表達的經(jīng)改造的蛋白質(zhì)的效能。用1齡幼蟲所進行的生物測定已經(jīng)在實施例2中進行了討論。使用完整的轉(zhuǎn)基因植物和對照植物的葉片來飼養(yǎng)高級階段的幼蟲。將葉柄置于位于含有MS鹽溶液的250ml燒瓶上方的棉花塞之中，以克服葉片的萎蔫。在每個葉片上允許飼養(yǎng)5條昆蟲幼蟲。飼養(yǎng)3齡(圖5)和5齡(圖6)幼蟲的對照植物的葉片分別在16小時和8小時之后進行更換，因為它們被昆蟲幼蟲完全吃光了。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因葉片上飼養(yǎng)引起處于所有發(fā)育階段的幼蟲在48小時之內(nèi)死亡。攝取大約1cm2的轉(zhuǎn)基因葉片就足夠殺死5齡幼蟲。這些幼蟲在轉(zhuǎn)基因葉片上飼養(yǎng)8-16小時之后顯現(xiàn)出瀕死的狀態(tài)，并最后在2天之內(nèi)死亡。在葉片表面上觀察到具有高水份含量的綠色排泄物。一些幼蟲在死亡之前顯示出嚴重的體重損失。
在一個分開的實驗中，讓不同齡期的幼蟲在轉(zhuǎn)基因植物的葉片上飼養(yǎng)1小時、2小時、4小時、8小時和16小時，然后將它們轉(zhuǎn)移至對照植物葉片上。觀察到在轉(zhuǎn)基因植物上飼養(yǎng)4小時足夠引起處于所有發(fā)育階段的幼蟲的100％死亡率，甚至是當(dāng)它們隨后在非轉(zhuǎn)基因植物上進行飼養(yǎng)。年幼的幼蟲攝取非常少量的毒素，這會超過15天的正常幼蟲周期而將它們的蛹化延遲10-15天。少數(shù)逃脫死亡的幼蟲發(fā)育成蛾。40％的使用這種蛾的配對交配得到了卵?？墒?，這些卵是不育的和不能孵化。至今還沒有在文獻中報道δ-內(nèi)毒素對于高級階段的昆蟲幼蟲的毒性。高水平的毒性可能是由于嵌合型毒素在昆蟲幼蟲中腸中的更高的穩(wěn)定性，或者是由于改善了的δ-內(nèi)毒素的受體結(jié)合能力和成孔能力。該實施例再次表明嵌合型毒素抗灰翅夜蛾物種的能力。因為實夜蛾不喜歡吃煙草葉，所以不能對實夜蛾進行使用轉(zhuǎn)基因煙草植物的毒性實驗。
實施例4 從表達δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉中制備得到的新型嵌合型Cry1E蛋白的高毒性 從轉(zhuǎn)基因煙草的葉中制備總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)。將新鮮的葉組織在液氮條件下磨成粉，然后懸浮在5倍體積的蛋白質(zhì)提取緩沖液(Tris Cl，20mM，pH9.5；EDTA 2mM，pH8.0；NaCl，50mM；DTT，1mM；PVP2％和PMSF，100mM)中。將該懸浮液充分混合，并離心兩次(20,000×g，20分鐘和4℃)。將上清液上載至Sepharose Q柱(10cm×2.5cm)上。用在提取緩沖液中的梯度增加的NaCl洗脫下蛋白質(zhì)，并收集100個5ml的級分。用ELISA檢測δ-內(nèi)毒素。匯集含有δ-內(nèi)毒素的級分。將已知數(shù)量的從植物中純化出的δ-內(nèi)毒素混合入半合成飼料中。如前面實施例的描述，用3天大小的斜紋灰翅夜蛾和棉鈴蟲的幼蟲進行毒性試驗。結(jié)果顯示出，對于灰翅夜蛾和實夜蛾的EC50(對于50％的致死率所需的濃度)為42.39±1.72ng/ml半合成飼料和283.11±8.29ng/ml半合成飼料。該結(jié)果進一步證明了對于灰翅夜蛾和實夜蛾的幼蟲的高水平毒性。值得注意的一點是，在植物組織中制造出的殺蟲晶體蛋白比在大腸桿菌中制造出的同樣的蛋白質(zhì)更具有毒性?？赡苁铅?內(nèi)毒素在植物細胞質(zhì)中折疊得更好，不能否認一些未鑒定的侶伴蛋白在這種折疊中的作用。
實施例5 嵌合型δ-內(nèi)毒素在植物組織中的穩(wěn)定性 如前面所討論的，提取轉(zhuǎn)基因植物的總?cè)芙馊~蛋白質(zhì)，并于4℃和28℃進行溫育。將它們用于毒性試驗。在前者的情況下每2天取出樣品，在后者的情況下每天取出樣品。將總的粗制蛋白質(zhì)混合入半合成飼料中，并用斜紋灰翅夜蛾的新生幼蟲進行毒性實驗。在飼養(yǎng)7天之后記錄昆蟲死亡率數(shù)據(jù)，并計算LC50。結(jié)果顯示在下面的表6和表7中。表6 S.No 粗制蛋白質(zhì)在4℃的溫育時間(天) LD50(ng/ml半合成飼料) 1. 2 48.71±2.4 2. 4 57.87±2.96 3. 6 66.44±3.65 4. 8 70.19±3.55 5. 12 73.82±3.1 6. 16 74.37±3.67 表7 S.No粗制蛋白質(zhì)在28℃的溫育時間(天) LD50(ng/ml半合成飼料) 1.1 76.44±3.3 2.2 98.13±4.6 3.3 143.46±8.5 4.4 --- 5.5 --- 結(jié)果證實了由我們所設(shè)計的嵌合型δ-內(nèi)毒素抗植物蛋白酶的穩(wěn)定性。嵌合型毒素在4℃溫育多于16天是穩(wěn)定的，在28℃溫育3天是穩(wěn)定的，并引起超過80％的死亡率。LC50隨著時間的增加大概是由于毒素有一些降解。
本發(fā)明的主要優(yōu)點為 1.改造Cry1Eaδ-內(nèi)毒素以獲得新型嵌合型毒素，此處稱為嵌合型Cry1E。嵌合蛋白的毒性比親本毒素或其他據(jù)報道具有抗灰翅夜蛾的功能的δ-內(nèi)毒素高幾倍。當(dāng)該嵌合蛋白在植物中形成時，其殺幼蟲活性是非常高的。
2.設(shè)計編碼嵌合型毒素的基因以便在大腸桿菌和植物中表達。因此，其可以用于改造微生物以表達嵌合型毒素，該嵌合型毒素可以用于制備微生物配劑。同樣的基因還可以用于遺傳工程改造植物以獲得昆蟲抗性。我們已經(jīng)表明了，我們所設(shè)計的序列造成嵌合型毒素在轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉(此處未包括結(jié)果)中的非常高水平的表達(總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)的0.5％)。
3.表達嵌合型毒素的轉(zhuǎn)基因植物具有非常高度的抗處于所有發(fā)育階段的斜紋灰翅夜蛾幼蟲的保護。它們在于轉(zhuǎn)基因植物上飼養(yǎng)2-3天之內(nèi)死亡。至今還沒有報道這種轉(zhuǎn)基因植物抗任何鱗翅目昆蟲的高水平毒性。該蛋白質(zhì)還可能有效地抗許多其他的昆蟲幼蟲。我們的結(jié)果表明該毒素對于抗實夜蛾也是有效的。
4.通過在轉(zhuǎn)基因植物上進行短期的飼養(yǎng)進一步證實了嵌合型毒素在轉(zhuǎn)基因植物中的效能。飼養(yǎng)4小時引起處于所有發(fā)育階段的灰翅夜蛾幼蟲的100％死亡率。飼養(yǎng)非常短的時間(1小時以內(nèi))延緩了幼蟲的發(fā)育和干擾了變態(tài)。這種蛋白質(zhì)可能在保護農(nóng)業(yè)經(jīng)濟上重要的農(nóng)作物和森林中非常有價值。編碼嵌合型毒素的基因可以用于形成轉(zhuǎn)基因植物和/或在微生物中產(chǎn)生可用于微生物配劑的毒素。
5.因為表達新型嵌合型毒素的轉(zhuǎn)基因植物引起灰翅夜蛾幼蟲在非常短時間的飼養(yǎng)中的100％死亡率，所以昆蟲形成抗該δ-內(nèi)毒素的抗性的可能性將會是非常低的。
SEQ ID No.1的信息
1.序列特征
A長度 641
B類型 氨基酸
C拓撲學(xué) 線性
D分子類型 蛋白質(zhì)
2.序列描述SEQ ID No.1
1 M A I V N N Q N Q C V P Y N C L N N P E N E I L D I E R S N
31 S T V A T N I A L E I S R L L A S A T P I G G I L L G L F D
61 A I W G S I G P S Q W D L F L E Q I E L L I D Q K I E E F A
91 R N Q A I S R L E G I S S L Y G I Y T E A F R E W E A D P T
121 N P A L K E E M R T Q F N D M N S I L V T A I P L F S V Q N
151 Y Q V P F L S V Y V Q A A N L H L S V L R D V S V F G Q A W
181 G F D I A T I N S R Y N D L T R L I P I Y T D Y A V R W Y N
211 T G L D R L P R T G G L R N W A R F N Q F R R E L T I S V L
241 D I I S F F R N Y D S R L Y P I P T S S Q L T R E V Y T D P
271 V I N I T D Y R V G P S F E N I E N S A I R S P H L M D F L
301 N N L T I D T D L I R G V H Y W A G H R V T S H F T G S S Q
331 V I T T P Q Y G I T A N A E P R R T I A P S T F P G L N L F
361 Y R T L S N P F F R R S E N I T P T L G I N V V Q G V G F I
391 Q P N N A E V L Y R S R G T V D S L N E L P I D G E N S L V
421 G Y S H R L S H V T L T R S L Y N T N I T S L P T F V W T H
451 H S A T N T N T I N P D I I T Q I P L V K G F R L G G G T S
481 V I K G P G F T G G D I L R R N T I G E F V S L Q V N I N S
511 P I T Q R Y R L R F R Y A S S R D A R V I V L T G A A S T G
541 V G G Q V S V N M P L Q K T M E I G E N L T S R T F R Y T D
571 F S N P F S F R A N P D I I G I S E Q P L F G A G S I S S G
601 E L Y I D K I E L I L A D A T F K R R R W S V H K A S R P L
631 H L H Q Q A G L A A D
SEQ ID No.2的信息
1.序列特征
A長度 1990bp
B類型 核酸
C標準 雙鏈
D拓撲學(xué) 線性
E分子類型 合成的
F來源 蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)
G特征 嵌合基因
2.序列描述SEQ ID No.2
10 20 30 40 50
| | | | |
1 CCCGCATGCCCCGGGGGATCCAAGCTTTAAACCATGGCTATCGTTAACAA
GGGCGTACGGGGCCCCCTAGGTTCGAAATTTGGTACCGATAGCAATTGTT
51
CCAGAACCAGTGCGTCCCTTACAATTGCCTCAACAACCCAGAGAACGAGA
GGTCTTGGTCACGCAGGGAATGTTAACGGAGTTGTTGGGTCTCTTGCTCT
101TCTTGGACATCGAAAGATCCAATTCTACCGTGGCCACCAACATTGCTCTT
AGAACCTGTAGCTTTCTAGGTTAAGATGGCACCGGTGGTTGTAACGAGAA
151GAGATTTCCAGATTGCTCGCTAGCGCAACTCCCATTGGTGGCATCCTCCT
CTCTAAAGGTCTAACGAGCGATCGCGTTGAGGGTAACCACCGTAGGAGGA
201
TGGATTGTTCGACGCCATTTGGGGTTCCATCGGACCATCACAATGGGATC
ACCTAACAAGCTGCGGTAAACCCCAAGGTAGCCTGGTAGTGTTACCCTAG
251
TCTTCCTTGAACAGATCGAGTTGCTCATTGACCAGAAGATCGAAGAGTTT
AGAAGGAACTTGTCTAGCTCAACGAGTAACTGGTCTTCTAGCTTCTCAAA
301
GCTAGGAACCAGGCAATTAGCCGTCTCGAGGGGATCTCTTCCCTTTACGG
CGATCCTTGGTCCGTTAATCGGCAGAGCTCCCCTAGAGAAGGGAAATGCC
351
AATCTATACAGAGGCCTTCAGAGAGTGGGAAGCTGACCCTACTAATCCAG
TTAGATATGTCTCCGGAAGTCTCTCACCCTTCGACTGGGATGATTAGGTC
401
CATTGAAGGAAGAGATGCGTACTCAATTCAACGATATGAACTCTATCTTG
GTAACTTCCTTCTCTACGCATGAGTTAAGTTGCTATACTTGAGATAGAAC
451GTCACCGCCATTCCTCTCTTCTCAGTGCAGAACTACCAAGTGCCATTCCT
CAGTGGCGGTAAGGAGAGAAGAGTCACGTCTTGATGGTTCACGGTAAGGA
501CTCCGTCTATGTTCAAGCTGCAAACTTGCACCTTTCTGTCCTTCGCGACG
GAGGCAGATACAAGTTCGACGTTTGAACGTGGAAAGACAGGAAGCGCTGC
551TGTCCGTCTTTGGTCAAGCCTGGGGCTTCGATATCGCTACTATCAACTCC
ACAGGCAGAAACCAGTTCGGACCCCGAAGCTATAGCGATGATAGTTGAGG
601CGTTACAACGACCTCACAAGGTTGATTCCTATCTACACTGACTACGCTGT
GCAATGTTGCTGGAGTGTTCCAACTAAGGATAGATGTGACTGATGCGACA
651
TAGATGGTACAATACTGGGCTTGACAGACTCCCACGTACCGGCGGATTGA
ATCTACCATGTTATGACCCGAACTGTCTGAGGGTGCATGGCCGCCTAACT
701
GGAATTGGGCTCGCTTCAACCAGTTTAGGCGTGAGCTCACCATTAGCGTG
CCTTAACCCGAGCGAAGTTGGTCAAATCCGCACTCGAGTGGTAATCGCAC
751TTGGACATCATTTCCTTCTTCAGAAACTACGACTCTAGACTTTATCCTAT
AACCTGTAGTAAAGGAAGAAGTCTTTGATGCTGAGATCTGAAATAGGATA
801
TCCAACTAGTTCTCAACTCACCAGGGAGGTCTACACCGATCCTGTGATCA
AGGTTGATCAAGAGTTGAGTGGTCCCTCCAGATGTGGCTAGGACACTAGT
851
ACATTACCGACTATCGTGTGGGTCCCTCCTTCGAGAACATTGAAAACAGC
TGTAATGGCTGATAGCACACCCAGGGAGGAAGCTCTTGTAACTTTTGTCG
901GCTATCAGATCTCCACACCTTATGGACTTCCTCAATAACTTGACTATCGA
CGATAGTCTAGAGGTGTGGAATACCTGAAGGAGTTATTGAACTGATAGCT
951
TACAGACCTTATCAGAGGTGTTCACTACTGGGCTGGCCATAGGGTCACCT
ATGTCTGGAATAGTCTCCACAAGTGATGACCCGACCGGTATCCCAGTGGA
1001
CTCACTTTACCGGTAGTTCCCAAGTGATCACAACCCCTCAATACGGAATT
GAGTGAAATGGCCATCAAGGGTTCACTAGTGTTGGGGAGTTATGCCTTAA
1051
ACTGCCAACGCAGAGCCAAGACGTACCATTGCTCCAAGTACCTTTCCCGG
TGACGGTTGCGTCTCGGTTCTGCATGGTAACGAGGTTCATGGAAAGGGCC
1101GTTGAACCTCTTCTACCGCACATTGTCAAATCCATTCTTCAGGAGATCTG
CAACTTGGAGAAGATGGCGTGTAACAGTTTAGGTAAGAAGTCCTCTAGAC
1151
AGAACATCACCCCTACCCTTGGGATCAACGTTGTCCAGGGAGTGGGTTTC
TCTTGTAGTGGGGATGGGAACCCTAGTTGCAACAGGTCCCTCACCCAAAG
1201
ATCCAGCCAAACAATGCTGAGGTGCTCTACAGGTCTAGAGGCACAGTGGA
TAGGTCGGTTTGTTACGACTCCACGAGATGTCCAGATCTCCGTGTCACCT
1251
CTCCTTGAACGAACTTCCAATTGACGGTGAGAACTCACTCGTCGGATACA
GAGGAACTTGCTTGAAGGTTAACTGCCACTCTTGAGTGAGCAGCCTATGT
1301GTCACCGTCTTAGCCACGTTACTTTGACCAGGTCTCTCTATAACACTAAT
CAGTGGCAGAATCGGTGCAATGAAACTGGTCCAGAGAGATATTGTGATTA
1351
ATCACTAGTTTGCCCACCTTCGTGTGGACTCACCACTCAGCCACCAACAC
TAGTGATCAAACGGGTGGAAGCACACCTGAGTGGTGAGTCGGTGGTTGTG
1401
AAACACTATCAATCCCGATATCATTACACAAATCCCCCTTGTCAAGGGCT
TTTGTGATAGTTAGGGCTATAGTAATGTGTTTAGGGGGAACAGTTCCCGA
1451
TCCGCTTGGGTGGAGGGACCTCCGTCATTAAAGGGCCCGGATTCACCGGT
AGGCGAACCCACCTCCCTGGAGGCAGTAATTTCCCGGGCCTAAGTGGCCA
1501
GGCGATATCCTCCGTAGAAACACCATTGGTGAGTTTGTGTCCCTCCAGGT
CCGCTATAGGAGGCATCTTTGTGGTAACCACTCAAACACAGGGAGGTCCA
1551
TAACATTAACTCTCCTATCACACAAAGGTACCGTCTTAGGTTCCGCTACG
ATTGTAATTGAGAGGATAGTGTGTTTCCATGGCAGAATCCAAGGCGATGC
1601
CTTCCTCTAGAGACGCAAGAGTCATTGTGCTTACCGGTGCCGCTTCCACA
GAAGGAGATCTCTGCGTTCTCAGTAACACGAATGGCCACGGCGAAGGTGT
1651
GGAGTCGGTGGCCAAGTCAGCGTTAACATGCCATTGCAAAAGACTATGGA
CCTCAGCCACCGGTTCAGTCGCAATTGTACGGTAACGTTTTCTGATACCT
1701
GATCGGAGAGAACCTCACTAGTAGAACCTTCAGGTATACCGACTTCTCTA
CTAGCCTCTCTTGGAGTGATCATCTTGGAAGTCCATATGGCTGAAGAGAT
1751
ACCCTTTCTCCTTCCGTGCTAACCCAGATATCATTGGCATCAGCGAACAA
TGGGAAAGAGGAAGGCACGATTGGGTCTATAGTAACCGTAGTCGCTTGTT
1801
CCTCTCTTCGGCGCCGGCTCCATCAGCTCTGGTGAACTCTACATCGATAA
GGAGAGAAGCCGCGGCCGAGGTAGTCGAGACCACTTGAGATGTAGCTATT
1851
GATCGAGTTGATCCTTGCTGACGCCACATTCAAGAGGAGACGATGGAGCG
CTAGCTCAACTAGGAACGACTGCGGTGTAAGTTCTCCTCTGCTACCTCGC
1901
TGCACAAAGCCTCACGCCCTCTTCACCTCCACCAACAAGCTGGACTCGCT
ACGTGTTTCGGAGTGCGGGAGAAGTGGAGGTGGTTGTTCGACCTGAGCGA
1951GCTGATTAATGAGAATTCGGATCCAAGCTTGGGCCCGCTC
CGACTAATTACTCTTAAGCCTAGGTTCGAACCCGGGCGAG
權(quán)利要求
1.SEQ ID No.1的嵌合型δ-內(nèi)毒素蛋白Cry1E，和其他在序列上具有75％及以上同源性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述SEQ ID No.1的蛋白質(zhì)的長度為641個氨基酸殘基。
3.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述SEQ ID No.1的嵌合蛋白是從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的δ-內(nèi)毒素Cry1Ea和Cry1Ca中設(shè)計出來的。
4.權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述長度為641個殘基的嵌合蛋白的組成如下殘基1-529來自內(nèi)毒素Cry1Ea的相同位置、殘基530-599來自Cry1Ca的533-602位、殘基600-616來自Cry1Ea的588-604位、殘基617-641為合成多肽。
5.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中Cry1Ea的530-587的肽結(jié)構(gòu)域可以用任何其他δ-內(nèi)毒素的進行替換。
6.權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中最后25個氨基酸殘基改善了抵抗植物蛋白酶的穩(wěn)定性。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述嵌合蛋白在4-35℃的溫度是穩(wěn)定的。
8.SEQ ID No.2的嵌合體基因。
9.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體編碼SEQ ID No.1的嵌合蛋白。
10.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體的長度為1990個堿基對(bp)。
11.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體為1.99kb的雙鏈DNA。
12.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體含有均勻分布的植物首選的密碼子以促進有效的翻譯。
13.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體在5’-末端含有植物首選的翻譯起始密碼于ATGGCT。
14.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體含有植物首選的翻譯終止密碼子TAATGA。
15.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體含有33個限制位點，這些限制位點以大約40-80bp的間距均勻地分布于基因的全部長度之中。
16.權(quán)利要求15所述的嵌合體，其中限制位點為選自HindIII、EcoRI和BamHI的酶。
17.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體分成58個長度為40-65bp的重疊的寡核苷酸，它們每個以6-26個堿基對(bp)的間距進行分布。
18.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體含有所述重疊的核苷酸，這些重疊的核苷酸具有13-18個核苷酸的重疊，并且其緊鄰的寡核苷酸位于互補鏈上。
19.權(quán)利要求8所述的嵌合體，其中所述嵌合體具有44-55℃的Tm值。
20.在微生物中過表達殺蟲嵌合蛋白Cry1E的方法，該方法包括
(a)將編碼所述嵌合蛋白的SEQ ID No.2的基因Cry1E克隆進載體中，
(b)用所述克隆載體轉(zhuǎn)化微生物，和
(c)在所述微生物中過表達所述嵌合蛋白。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述嵌合體在選自細菌、藻類和真菌的微生物中表達。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中用于所述克隆的限制性內(nèi)切酶選自HindIII、EcoRI、Ncol、MfeI和BamHI。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其中使用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)所述蛋白質(zhì)的過表達。
24.權(quán)利要求20所述的方法，其中于15℃過表達所述蛋白質(zhì)以避免所述蛋白質(zhì)的錯誤折疊。
25.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述載體選自質(zhì)粒、病毒DNA和粘粒。
26.權(quán)利要求20所述的方法，其中嵌合體在微生物中的表達通過RT-PCR、Western分析和ELISA來確認。
27.權(quán)利要求20所述的方法，其中嵌合體在微生物中的存在通過PCR和Southern分析來確認。
28.用權(quán)利要求1的殺蟲嵌合蛋白處理受昆蟲侵害的植物的方法，該方法包括
(a)將編碼嵌合蛋白Cry1E的基因整合入受昆蟲侵害的植物中，
(b)將轉(zhuǎn)基因植物暴露于昆蟲，和
(c)測定所述轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲活性。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中昆蟲害蟲選自灰翅夜蛾屬物種和實夜蛾屬物種。
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中植物選自煙草、棉花、鷹嘴豆、pegeonpea、花生、花椰菜、甘藍、紅辣椒和辣椒。
31.權(quán)利要求28所述的方法，其中用于所述克隆的限制性內(nèi)切酶選自HindIII、EcoRI、Ncol和BamHI。
32.權(quán)利要求28所述的方法，其中嵌合蛋白顯示出在植物中的高度表達，其占植物總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)的大約0.5％。
33.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白在所述轉(zhuǎn)基因植物中是穩(wěn)定的。
34.權(quán)利要求28所述的方法，其中暴露于所述嵌合蛋白的昆蟲在死亡之前顯示出體重損失。
35.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白顯示出抗處于所有發(fā)育階段的昆蟲的殺蟲特性。
36.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白為具有比親本蛋白高幾倍的能力的殺蟲劑。
37.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白的殺蟲活性為，在大約4小時的暴露中有80-100％的昆蟲害蟲死亡率。
38.權(quán)利要求28所述的方法，其中暴露于所述嵌合蛋白大約1小時的昆蟲顯示出延緩的發(fā)育、不育和中斷的變態(tài)。
39.權(quán)利要求28所述的方法，其中對于實夜蛾屬物種的EC50為250-350ng/ml人工昆蟲飼料。
40.權(quán)利要求2 8所述的方法，其中對于灰翅夜蛾屬物種的EC50為25-50ng/ml人工飼料。
41.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述方法對于轉(zhuǎn)化植物的正常生長沒有顯示出不利影響。
全文摘要
本發(fā)明涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ－內(nèi)毒素蛋白Cry1E，其具有特別高的殺蟲特性，以及SEQ ID No.2的嵌合體基因，其編碼來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的δ－內(nèi)毒素cry1Ea和cry1Ca的該嵌合蛋白，還涉及用該嵌合體蛋白處理受昆蟲侵害的植物的方法。
文檔編號C12N15/62GK1625562SQ0282885
公開日2005年6月8日 申請日期2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月27日
發(fā)明者R·圖里 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究會