專利名稱：超酸性植物的蛋白圖譜的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于植物香葉天竺葵(天竺葵種)的超酸性氣生部分的蛋白提取物的圖譜制作方法，所述方法包含下列步驟選擇有效的提取介質，由0.2M碳酸鈉組成的提取介質提高了約600％的提取百分比，選擇有效介質以確定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介質的組成為0.2-0.4M的碳酸鈉，以及0.2M碳酸鈉含有50％二甲基亞砜，選擇有效介質以確定所述提取物中酶的多分子形式，酶多分子形式介質的組成為pH 7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液并任選含50％二甲基亞砜；碳酸鈉的濃度為0.2-0.4M并任選含50％二甲基亞砜，以及在所述方法中采用包含凝膠電泳、分光光度法、離心、蛋白測定的生物化學和生物物理技術，以確定所述提取物中蛋白質的定量、定性、結構和功能方面，及其提取組合物。
背景技術：
通常通過生化方法的酶學研究包括以活性和/或天然結構形式的定量和定性分離，然后是用于催化水平、酶/同工酶分子形式的分析/圖譜制作，以分辨功能面，蛋白質和/或其多肽模式及其進一步分析，由此構成了主題術語“蛋白質組”。
該主題與來自細胞、組織、器官或生物體的幾乎有益健康的蛋白質補體的分離有關，以用于后續(xù)的鑒定、表征和定量，蛋白質與多肽圖譜的電泳顯示，酶和同工酶的催化水平監(jiān)測，酶的多分子形式的辨別等等。
目前，蛋白質組覆蓋了大量的基因產物或功能基因組的功能分析。僅僅數據庫中的DNA序列是不能解碼生物學功能的，因此，蛋白質組對于理解和調節(jié)生物學功能及機理是至關重要的。有鑒于此，蛋白質組是包括基因操作和代謝工程的現(xiàn)代生物技術的一個關鍵組分。
實際上，對基因生物學功能的理解較之僅僅獲得序列是困難得多的命題。從植物(尤其是具有次級代謝物產生途徑的植物)角度來看，由于對代謝網絡和其中包含的催化/調節(jié)蛋白質知之甚少，情況則顯得更為復雜。
蛋白質組初始最關鍵的要求是細胞蛋白質補體從試驗組織/器官中的定量分離。雖然，在接近中性pH的緩沖條件下，一些蛋白分離的通用方案可從文獻中得到，然而，這些方案應用于香葉天竺葵的一些組織(象葉子、花瓣和萼片)則不能令人滿意。
實際上，目前關于雄性可繁殖基因型香葉天竺葵的水性分離和非變性條件下的蛋白圖譜只有個別報道，并且只與花藥有關(S.Tokumasu，F(xiàn).Yano和M.Kato，1977，Japan J.Genet.52197-205)。
但是該現(xiàn)有技術對于更大的蛋白質組工作幾乎沒有任何關聯(lián)，因為(i)大部分香葉天竺葵的培育克隆是雄性不育的，(ii)該方法不能應用于其他氣生部分，像葉、花瓣和萼片，(iii)從代謝途徑和有價值的用作香料、化妝品和調味品工業(yè)及芳香療法的外來精油的生產的觀點來看，該植物的其他氣生部分對于蛋白質組工作的重要性勝于花藥(E.Gildemeister和Fr.Hoffman，1959，Die atherischen Ole vol 5，p350，Akademie Verlag，Berlin)。
用于本發(fā)明的科學解釋是，香葉天竺葵的氣生部分，像葉片，花瓣和萼片具有高酸性性質，細胞液的pH約3.0(R.S.Sangwan，B.R.Tyagi及N.S.Sangwan，2000，通過天竺葵種香葉天竺葵的化學變性堿土的植物修復的生態(tài)學方法，已提交專利，NF399/00，CSIR，New Delhi)。發(fā)現(xiàn)這些新鮮組織的兩個體積的水性提取物的酸度超過5毫克當量的氫氧化鈉(R.S.Sangwan，B.R.Tyagi及N.S.Sangwan，2000，通過天竺葵種香葉天竺葵的化學變性堿土的植物修復的生態(tài)學方法。相同主題的美國專利申請09/776,502最近被授權。
本發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是開發(fā)一種用于香葉天竺葵植物(天竺葵種)蛋白質圖譜制作的方法學。
本發(fā)明的另一主要目的是開發(fā)一種用于香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性部分的蛋白質圖譜制作的方法學。
本發(fā)明的主要目的是開發(fā)來自香葉天竺葵植物(天竺葵種)高純度蛋白質提取物的組合物。
本發(fā)明的主要目的是開發(fā)來自香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性部分的高純度蛋白提取物的組合物。
本發(fā)明的另一目的是確定所述植物各種蛋白質的酶活。
本發(fā)明的另一目的是開發(fā)所述植物蛋白質的多肽圖譜。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用于香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性氣生部分的蛋白質提取物的圖譜制作方法，所述方法包含下列步驟選擇有效的提取介質，由0.2M碳酸鈉組成的提取介質提高了約600％的提取百分比，選擇有效介質以確定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介質的組成為0.2-0.4M的碳酸鈉，以及0.2M碳酸鈉含有50％二甲基亞砜，選擇有效介質以確定所述提取物中的酶多分子形式，酶多分子形式的介質組成為pH 7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液并任選含50％二甲基亞砜；碳酸鈉濃度為0.2-0.4M并任選含50％二甲基亞砜，以及在所述方法中采用包含凝膠電泳、分光光度法、離心、蛋白測定的生物化學和生物物理技術，以確定所述提取物中蛋白質的定量、定性、結構和功能方面，及其提取組合物。
發(fā)明詳述相應地，本發(fā)明涉及一種香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性氣生部分的蛋白質提取物的圖譜制作方法，所述方法包含下列步驟選擇有效的提取介質，由0.2M碳酸鈉組成的提取介質提高了約600％的提取百分比，選擇有效介質以確定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介質的組成為0.2-0.4M的碳酸鈉，以及0.2M碳酸鈉含有50％二甲基亞砜，選擇有效介質以確定所述提取物中的酶多分子形式，酶多分子形式介質的組成為pH 7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液并任選含50％二甲基亞砜；碳酸鈉的濃度為0.2-0.4M并任選含50％二甲基亞砜，以及在所述方法中采用包含凝膠電泳、分光光度法、離心、蛋白測定的生物化學和生物物理技術，以確定所述提取物中蛋白質的定量、定性、結構和功能方面，及其提取組合物。
在本發(fā)明進一步實施方案中，一種組合物可用于pH約3.0的香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性部分的蛋白質提取物的酸性中和與圖譜制作，所述組合物包含約0.2M碳酸鈉，及任選約50％二甲基亞砜(v/v)，顯示蛋白質提取百分比增長約600％，其中所述組合物在提取物中的最終pH為6.5-8.0。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，一種組合物可用于pH約3.0的香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性部分的蛋白質提取物的酸性中和與圖譜制作，所述組合物包含約0.2M Tris-HCl緩沖液，約0.2M碳酸鈉，pH約7.5，并且顯示蛋白質提取百分比增長約300％，其中所述組合物在提取物中的最終pH為5.5-6.5。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，一種組合物可用于pH約3.0的香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性部分蛋白質提取物的酸性中和與圖譜制作，所述組合物包含約0.2M Tris-HCl緩沖液及約50％二甲基亞砜(v/v)，pH約7.5，并且顯示蛋白質提取百分比增長約300％，其中所述組合物在提取物中的最終pH為6.0-7.0。
在本發(fā)明的一個實施方案中，一種方法可用于pH約3.0的香葉天竺葵植物(天竺葵種)超酸性部分蛋白質提取物的圖譜制作。
在本發(fā)明的另一實施方案中，用含有酸性中和鹽與酸性螯合化合物的緩沖液均質所述植物的超酸性部分。
在本發(fā)明的另一實施方案中，對所述勻漿物離心約30分鐘。
在本發(fā)明的另一實施方案中，在上清液中得到所述蛋白質提取物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，通過常規(guī)方法測定得到的水溶性蛋白質提取物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，采用分光光度法計算所述提取物中過氧化物酶的酶活和酶動力學。
在本發(fā)明的另一實施方案中，將步驟(d)的水溶性蛋白質提取物與十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS)樣品緩沖液混合。
在本發(fā)明的另一實施方案中，將所述混合物持續(xù)煮沸1-10分鐘。
在本發(fā)明的另一實施方案中，將煮沸的混合物快速冷卻。
在本發(fā)明的另一實施方案中，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對所述混合物進行電泳。
在本發(fā)明的另一實施方案中，采用分子量標記(marker)確定電泳混合物的多肽圖譜。
在本發(fā)明的另一實施方案中，采用催化特異性顯色反應混合物，溫育不帶十二烷基硫酸鈉的步驟(i)的非變性聚丙烯酰胺凝膠。
在本發(fā)明的另一實施方案中，使催化活性條帶顯形。
在本發(fā)明的另一實施方案中，確定所述蛋白質提取物酶的多分子形式模式(pattern)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中所述植物在氣生部分具有超酸性的。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中所述植物的氣生部分選自葉片、花瓣和萼片。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中的酸性中和鹽和酸性螯合化合物選自碳酸鹽、碳酸氫鹽、氨合物和二甲基亞砜。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中對所述植物部分的均質優(yōu)選采用手工。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中在室溫或0-4℃的冷凍條件下均質所述植物部分。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中在7,000×g至14,000×g的速率下離心所述勻漿物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中在室溫或0-4℃的冷凍條件下離心所述勻漿物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中蛋白質水溶性提取物與十二烷基硫酸鈉的比例介于1∶5到5∶1。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中在水浴中煮沸所述混合物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中對電泳凝膠進行染色的染料選自考馬斯亮藍R-250和銀染。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中SDS-PAGE的類型為一維和兩維。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中多肽模式緩沖介質選自(a)0.2-0.4M的碳酸鈉，(b)0.2-0.4M的碳酸鈉及10-50％(v/v)的二甲基亞砜，(c)pH為7.0-8.0的約0.2M的Tris-HCl緩沖液，以及(d)pH為7.0-8.0的約0.2M的Tris-HCl與濃度為10-50％(v/v)的二甲基亞砜。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中用于酯酶催化活性的催化特異性顯色反應混合物在pH約6.5的0.1M磷酸緩沖液中含有約2mM α-醋酸萘酯，約2mM β-醋酸萘酯，約1mM固藍鹽。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中用于谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)催化活性的催化特異性顯色反應混合物在pH約8.5的約0.1MTris-HCl中含有約2mM磷酸吡哆醛，約4mM L-天冬氨酸，約4.3mM α-酮戊二酸和約5.4mM的固藍BB鹽。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中所述方法用于具有超酸性特性的植物和動物組織中的蛋白質組。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中對所述植物采用選自如下的緩沖液進行均質(a)pH約10.5或以上的約0.2M Tris溶液，(b)pH約7.5的約0.2M Tris-HCl緩沖液，含有約0.2M碳酸鈉，(c)約0.2M碳酸鈉，(d)pH約7.5的約0.2M Tris-HCl，含有高至50％的二甲基亞砜(v/v)，以及(e)約0.2M碳酸鈉，含有高至50％的二甲基亞砜(v/v)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中的均質緩沖液補充有7-14％的甘油。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中含有約0.2M碳酸鈉的緩沖液組合物顯示蛋白質提取百分比增長約600％。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中含有約0.2M碳酸鈉、約50％二甲基亞砜(v/v)的緩沖液組合物顯示蛋白質提取百分比增長約600％。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中含有約0.2M Tris-HCl、約0.2M碳酸鈉的pH約為7.5的緩沖液組合物顯示蛋白質提取百分比增長約300％。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中的SDS-PAGE具有垂直電泳系統(tǒng)中的帶有堆積膠和分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中的堆積膠濃度為2-6％(T)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，其中的分離膠濃度為10-18％(T)。
進一步地，本發(fā)明提供了用于香葉天竺葵(天竺葵種)組織的蛋白質組的方法，包含用一半至一個體積(1g鮮重加入0.5至1.0毫升或更多，這依賴于組織的性質和狀態(tài))的補充有甘油(10％)的合適緩沖液(像Tris-HCl)，或含有高至0.4M濃度(根據用途)的如碳酸鹽或碳酸氫鹽等的酸性中和鹽的蒸餾水，或在合適濃度(高至50％)的如二甲基亞砜的酸性螯合(如與有機酸形成絡合物)化合物的條件下，通過手工勻化(在室溫下或0-4℃冷凍條件，依賴于蛋白質組工作的最終目的)提取特定組織(葉片、花瓣和萼片)，然后于周圍環(huán)境溫度下或0-4℃(依賴于蛋白質組工作的最終目的)冷凍條件下在離心機內以10,000×g離心30分鐘，以回收上清液中分離的水溶性蛋白質，該水溶性蛋白質可滿意地進一步用于各種蛋白質組工作，這些工作如進行蛋白質濃度的真實定量測定，酶催化活性測定和其他酶/蛋白質物理動力學和調節(jié)研究，分辨和研究酶的多分子形式，包括其非變性PAGE電泳后的原位催化定位以及通過變性或采用標準技術的其他電泳技術進行的多肽模式的圖譜制作。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可相容的細胞酸性取消方法(nullifying process)不可或缺的用于香葉天竺葵(天竺葵種)植物蛋白質組工作的實施，起始用于組織中蛋白質補體的定量回收。
在本發(fā)明的另一實施方案中，組織均質介質可補充有(依賴于特殊目的，可選擇性地和/或另外地)諸如二甲基亞砜的化合物，以完成香葉天竺葵的蛋白質組工作。
在本發(fā)明的另一實施方案中，方法提供了用于各種類型蛋白質組分析/檢測的專題解決方案，從定量測定到催化活性測定，以及香葉天竺葵中指定組織的蛋白質/酶/多肽模式的電泳顯示的完成。
在本發(fā)明的另一實施方案中，該酸性較之通常緩沖提取介質可承受的酸性強得多。因此，在勻漿物中出現(xiàn)了驚人低的pH條件，不僅徹底限制了蛋白質的提取(通過水溶解度的極度減少)，并且定性和/或定量地改變了其天然的物理-化學(包括催化/酶學)屬性。
在本發(fā)明的另一實施方案中，組織提取介質中包含合適水平可相容的酸性中和化學品(如碳酸鹽、碳酸氫鹽、氨/氨合物等)或絡合(如二甲基亞砜)化學品可幫助去除在實施植物/植物部分上蛋白質組工作中的障礙。
在本發(fā)明的另一實施方案中，迄今為止，在植物樣品蛋白質分離中已遭遇到一些困難，并從蛋白酶、多元酚等占優(yōu)的立場通過技術得以解決。這種數量級的組織超酸性在農作物植物中是很少見的。相應地，從這種組織中水性分離蛋白質的問題可能還是很少遭遇到。
在本發(fā)明的另一實施方案中，即使在有把握情況下，植物中試驗組織的變化也可能留下未解決的上述問題。由此，本發(fā)明提供了用于方便香葉天竺葵(天竺葵種)超酸性組織中蛋白質組研究/分析的新穎方法。
附圖簡述

圖1表示香葉天竺葵葉片組織蛋白質制備物(A-E)的SDS-PAGE(考馬斯染色)凝膠。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，D；泳道5，E；泳道6，空缺；泳道7，分子量標記(磷酸化酶b-66000，BSA-66000，卵白蛋白-43000，碳酸酐酶(carbonic anhydrous)-29000，STI-201000，溶菌酶-14300)。
圖2表示香葉天竺葵葉片組織蛋白質制備物(A-C)的SDS-PAGE(考馬斯染色)凝膠。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，空缺；泳道5，分子量標記(磷酸化酶b-66000，BSA-66000，卵白蛋白-43000，碳酸酐酶-29000，STI-201000，溶菌酶-14300)。
圖3表示天竺葵葉片組織制備物(A-E)中酯酶催化活性的非變性PAGE和原位染色。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，D；泳道5，E。反應混合物(12.5ml)在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中含有2mM α-乙酸萘酯，2mM β-乙酸萘酯，1mM固藍RR鹽。
圖4表示天竺葵葉片組織制備物(A-E)中谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)催化活性的非變性PAGE和原位染色。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，D；泳道5，E。反應混合物(12.5ml)在0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.5)中含有2mM磷酸吡哆醛，4mM L-天冬氨酸，4.3mMα-酮戊二酸及5.4mM固藍RR鹽。
實施例下列實施例僅以說明本發(fā)明的方式給出，不應解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1將1克栽培品種為“Bourbon”的香葉天竺葵(天竺葵種)新鮮葉片組織進行可溶蛋白質的水性分離，采用一半體積(0.5ml提取介質每1.0克新鮮組織)的(A)0.2M Tris-HCl，pH7.5或(B)雙蒸水或(C)0.2M Tris溶液，pH 10.5以上或(D)pH7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液，含0.2M Na2CO3或(E)0.2M Na2CO3或(F)pH7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液，含50％(v/v)二甲基亞砜或(G)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亞砜，用全玻璃研棒和研缽在室溫下進行手工均質。組織勻漿物在10,000×g下離心30分鐘，收集上清液。記錄上清液的pH。在每種情況下向微離心管內的400fil上清液中加入400jal 12％的三氟乙酸(TCA)，并維持30分鐘。內含物在微型離心機內離心，并保留蛋白沉淀物。將蛋白質溶于400jal的0.1NNaOH溶液中。用100至200^1等分樣的溶液，采用標準Lowry法(O.HLowry，N.J.Rosebrough，A.L.Farr和R.J.Randall，1951，J.Biol.Chem.193265)對蛋白質定量。顯色反應后在660nm下讀取吸光度。蛋白質采用BSA作為標準進行定量，結果制表如下。
表1

顯然，本發(fā)明技術方法(像處理E和G)可導致蛋白質從組織中基本分離。相比較而言，它使得組織蛋白回收率提高達6.5倍。這對于蛋白質組工作和分析是具有定量和定性的本質。
實施例2將1克栽培品種為“Bourbon”的香葉天竺葵(天竺葵種)新鮮葉片組織進行可溶蛋白質的水性分離，采用一半體積(0.5ml提取介質每1.0克新鮮組織)的冷卻提取介質(A)0.2M Tris-HCl，pH7.5或(B)0.2M Tris溶液，pH 10.5以上或(C)pH7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液，含0.2M Na2CO3或(D)0.2M Na2CO3或(E)pH7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液，含50％(v/v)二甲基亞砜或(F)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亞砜，用全玻璃研棒和研缽在0-4℃下進行手工均質。組織勻漿物在0-4℃冷凍離心機內及10,000×g下離心30分鐘，收集上清液并用作為酶提取物檢測過氧化物酶的催化水平。催化活性的檢測采用愈創(chuàng)木酚作為底物，30℃下通過分光光度計由470nm下吸光度的增長速率確定。標準分析混合物(3.0ml)的組成為5ml 0.1M醋酸緩沖液(pH5.5)，0ml的.0mM愈創(chuàng)木酚，300^1的1.3mM H2O2，10至50^1(依賴于催化水平)等分樣的酶制備物(EP)，用蒸餾水定容。結果制表如下。
表2

一個單位酶活定義等同為每分鐘吸光度增長0.010。
顯然，本發(fā)明技術對于香葉天竺葵組織酶催化活性的實際評價是一個先決條件。以酶特異性方式的適當應用還需要根據酶或實驗者的要求對方法進行標準化/優(yōu)化。
實施例3將1克栽培品種為“Bourbon”的香葉天竺葵(天竺葵種)新鮮葉片組織進行可溶蛋白質的水性分離，采用一半體積(0.5ml提取介質每1.0克新鮮組織)的冷卻提取介質(A)0.2M Tris-HCl緩沖液，pH7.5或(B)pH7.5的0.2M Tris-HCl，含50％(v/v)二甲基亞砜或(C)0.2M Na2CO3或(D)0.4M Na2CO3(E)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亞砜，用全玻璃研棒和研缽在0-4℃下進行手工均質。組織勻漿物在0-4℃冷凍離心機內及10,000×g下離心30分鐘，收集上清液用于進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以顯示組織提取物中的多肽圖譜。為此，將100μl提取物與相同體積的SDS樣品緩沖液混合于微離心管內，并置于沸水浴中持續(xù)3分鐘。將樣品置于冰塊上快速冷卻，并貯存于-20℃下直到用于電泳。變性的SDS-PAGE采用垂直電泳系統(tǒng)(MiniProtean-II，Bio Rad)中的堆積膠和分離膠不連續(xù)系統(tǒng)進行實施。將等量體積(每種25fil用于考馬斯染色)的每種樣品制備物加入加樣孔中，并在每塊膠中用標準分子量標記混合物進行共同電泳。凝膠中的聚合物濃度是堆積膠內4.0％(T)，分離膠內14.0％(T)。采用溴酚藍試劑作為跟蹤染料。電泳在恒定電壓下進行(樣品在堆積膠內移動時150伏特，而在分離膠內移動時100伏特)。電泳結束后，堆積膠區(qū)域用刮刀切除，分離膠上的蛋白質圖譜用考馬斯亮藍R-250進行染色。一些代表性的顯示有蛋白質組模式的凝膠如后所示。(圖1)顯然，只有采用構成本發(fā)明技術領域的提取介質(尤其像C，D和E處理)用于香葉天竺葵組織的蛋白質組(多肽模式)溶液才是可行的。這作為關鍵特征可同時用于該種植物的一維和二維蛋白質組。
實施例4將1克栽培品種為“Bourbon”的香葉天竺葵(天竺葵種)新鮮葉片組織進行可溶蛋白質的水性分離，采用一半體積(0.5ml提取介質每1.0克新鮮組織)的冷卻提取介質(A)0.2M Tris-HCl，pH7.5或(B)pH7.5的0.2M Tris-HCl，含50％(v/v)二甲基亞砜或(C)0.2M Na2CO3，用全玻璃研棒和研缽在0-4℃下進行手工均質。組織勻漿物在0-4℃冷凍離心機內及10,000×g下離心30分鐘，收集上清液用于進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以顯示組織提取物中的多肽圖譜。為此，將100μ1提取物與等體積的SDS樣品緩沖液混合于微離心管內，并置于沸水浴中持續(xù)3分鐘。
將樣品置于冰塊上快速冷卻，并貯存于-20℃下直到用于電泳。變性的SDS-PAGE采用垂直電泳系統(tǒng)(Mini Proten-II，Bio Rad)中的堆積膠和分離膠不連續(xù)系統(tǒng)進行。將等體積(10jjl)的每種樣品制備物加入加樣孔中，并在每塊膠中用標準分子量標記混合物進行共同電泳。凝膠中的聚合物濃度是堆積膠內4.0％(T)，分離膠內14.0％(T)。采用溴酚藍試劑作為跟蹤染料。電泳在恒定電壓下進行(樣品在堆積膠內移動時150伏特，而在分離膠內移動時100伏特)。電泳結束后，堆積膠區(qū)域用刮刀切除，分離膠中的蛋白質圖譜采用銀染方案(非雙胺化學顯色的蛋白質染色)進行染色。一些代表性的顯示有蛋白質組模式的凝膠如后所示。(圖2)顯然，即使使用銀染輔助檢測，采用構成本發(fā)明技術領域的提取介質(尤其像C處理)用于香葉天竺葵組織蛋白質組(多肽圖譜)溶液也是相當可行的。這作為關鍵特征可同時用于該種植物的一維和二維蛋白質組。
實施例5將1克栽培品種為“Bourbon”的香葉天竺葵(天竺葵種)新鮮葉片組織進行可溶蛋白質的水性分離，采用一半體積(0.5ml提取介質每1.0克新鮮組織)的冷卻提取介質(A)pH7.5的0.2M Tris-HCl，含50％(v/v)二甲基亞砜或(B)0.2M Tris-HCl緩沖液，pH7.5或(C)0.2M Na2CO3或(D)0.4M Na2CO3或(E)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亞砜，用全玻璃研棒和研缽在0-4℃下進行手工均質。組織勻漿物在0-4℃冷凍離心機內及10,000×g下離心30分鐘，收集上清液用于在非變性聚丙烯酰胺凝膠中實施酶多分子模式。非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用垂直電泳系統(tǒng)(Mini Proten-II，Bio Rad)中的堆積膠和分離膠不連續(xù)系統(tǒng)進行。將等體積(25jal)的每種樣品制備物加入加樣孔中。凝膠中的聚合物濃度是堆積膠內4.0％(T)，分離膠內14.0％(T)。采用溴酚藍試劑作為跟蹤染料。電泳在0-4℃、恒定電壓下進行(樣品在堆積膠內移動時150伏特，而在分離膠內移動時100伏特)。電泳結束后，堆積膠區(qū)域用刮刀切除，分離膠用催化特異性顯色反應混合物在37℃下進行培育，以進行催化活性條帶的原位定位。催化活性條帶顯形后，在采用光學增強掃描儀(420oe，pdi Inc)及Diversity DatabaseTM的凝膠記錄系統(tǒng)(pdi Inc.，USA)上進行同工酶模式的圖象捕捉。一些顯示有原位催化模式的代表性的酶/同工酶定位凝膠如后所示。
顯然，只有采用構成本發(fā)明技術領域的提取介質用于香葉天竺葵組織的蛋白質組(酶)溶液才是可行的。
本發(fā)明主要優(yōu)點1.它提供了從香葉天竺葵頑拗型組織(recalcitrant tissues)中水性提取可溶蛋白質的可行性。實際上，這些組織從商業(yè)和學術用途上講都非常重要。
2.它使得組織的蛋白質組得以施行，這對于理解功能基因組是很關鍵的。
3.它方便了組織中一些信號多肽/蛋白質涉及從發(fā)育到調節(jié)等的內在或外源因子的分離與鑒定。
4.該方法可用于進行酶/同工酶/蛋白質/多肽模式形成，以用于不同應用，包括多樣性評價，譜系分析，種系發(fā)生，基因型/栽培品系診斷，遺傳，雜交評價，以及其他應用，像基于蛋白質的共顯性標記(同工酶，抗體探針的多肽等等)等。
5.該方法可有助于代謝/酶學研究，這對于了解初級和次級代謝途徑的機理和調節(jié)是很重要的。這也形成其調節(jié)的基礎。
6.它可用作為天然(內源的)或外源基因(轉基因)等表達(翻譯或翻譯后水平)研究的一個有效工具。
權利要求
1.一種可用于pH約3.0的香葉天竺葵(天竺葵種)植物超酸性部分蛋白質提取物的酸性中和與圖譜制作的組合物，所述組合物包含約0.1-0.3M碳酸鈉，及任選約45-55％(v/v)二甲基亞砜，并且顯示蛋白質提取百分比增長約600％。
2.權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物中碳酸鈉的濃度優(yōu)選約0.2M。
3.權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物中任選的二甲基亞砜濃度優(yōu)選約50％。
4.權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物中所述提取物的pH為6.5-8.0。
5.權利要求4中所述的組合物，其中所述組合物中所述提取物的pH優(yōu)選約7.0。
6.一種可用于pH約3.0的香葉天竺葵(天竺葵種)植物超酸性部分蛋白質提取物的酸性中和與圖譜制作的組合物，所述組合物包含約0.1-0.3M Tris-HCl緩沖液，約0.1-0.3M碳酸鈉，pH約7.5，并且顯示蛋白質提取百分比增長約300％。
7.權利要求6中所述的組合物，其中所述組合物中Tris-HCl緩沖液的濃度優(yōu)選約0.2M。
8.權利要求6中所述的組合物，其中所述組合物中碳酸鈉濃度優(yōu)選約0.2M。
9.權利要求6中所述的組合物，其中所述組合物中所述提取物的pH為5.5-6.5。
10.權利要求9中所述的組合物，其中所述組合物中所述提取物的pH優(yōu)選約6.0。
11.一種可用于pH約3.0的香葉天竺葵(天竺葵種)植物超酸性部分蛋白質提取物的酸性中和與圖譜制作的組合物，所述組合物包含約0.1-0.3M Tris-HCl，以及約45-55％(v/v)二甲基亞砜，pH約7.5，并且顯示蛋白質提取百分比增長約300％。
12.權利要求11中所述的組合物，其中所述組合物中Tris-HCl緩沖液濃度優(yōu)選約0.2M。
13.權利要求11中所述的組合物，其中所述組合物中二甲基亞砜濃度優(yōu)選約50％。
14.權利要求11中所述的組合物，其中所述組合物中所述提取物的pH為6.0-7.0。
15.權利要求14中所述的組合物，其中所述組合物中所述提取物的pH優(yōu)選約6.0。
16.一種用于pH約3.0的香葉天竺葵(天竺葵種)植物超酸性部分蛋白質提取物的圖譜制作方法，所述方法包含(a)采用含有酸性中和鹽與酸性螯合化合物的緩沖液均質所述植物的超酸性部分，(b)將所述勻漿物離心約30分鐘，(c)從上清液中獲得所述蛋白質提取物，(d)通過常規(guī)方法測定所獲得的蛋白質提取物，(e)利用分光光度法計算所述提取物中過氧化物酶的酶活與酶動力學，(f)將步驟(d)的水性蛋白質提取物與十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS)樣品緩沖液混合，(g)將所述混合物煮沸1-10分鐘，(h)快速冷卻煮沸混合物，(i)采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對所述混合物進行電泳，(j)采用分子量標記確定電泳混合物的多肽圖譜，(k)采用催化特異性顯色反應混合物，將不含十二烷基硫酸鈉的步驟(i)的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行溫育，(l)顯形催化活性條帶，以及(m)確定所述蛋白質提取物的酶多分子形式模式。
17.權利要求16所述的方法，其中所述植物的氣生部分具有超酸性。
18.權利要求17所述方法，其中所述植物的氣生部分選自葉片、花瓣和萼片。
19.權利要求16所述的方法，其中酸性中和鹽和酸性螯合化合物選自碳酸鹽、碳酸氫鹽、氨合物和二甲基亞砜。
20.權利要求16所述的方法，其中對植物部分的均質優(yōu)選采用手工。
21.權利要求16所述的方法，其中在室溫或0-4℃冷凍條件下均質所述植物部分。
22.權利要求16所述的方法，其中在7,000×g至14,000×g速率下離心所述勻漿物。
23.權利要求16所述的方法，其中在室溫或0-4℃冷凍條件下離心所述勻漿物。
24.權利要求16所述的方法，其中蛋白質水性提取物與十二烷基硫酸鈉的比例為1∶5至5∶1。
25.權利要求16所述的方法，其中所述混合物的煮沸在水浴中進行。
26.權利要求16所述的方法，其中對電泳凝膠進行染色的染料選自考馬斯亮藍R-250和銀染。
27.權利要求16所述的方法，其中SDS-PAGE可以是一維也可以是二維形式。
28.權利要求16所述的方法，其中的多肽模式緩沖介質選自(a)0.2-0.4M的碳酸鈉，(b)0.2-0.4M的碳酸鈉及10-50％(v/v)的二甲基亞砜，(c)pH7.0-8.0的約0.2M Tris-HCl緩沖液，以及(d)pH7.0-8.0的約0.2M Tris-HCl緩沖液及濃度介于10-50％(v/v)之間的二甲基亞砜。
29.權利要求16所述的方法，其中用于酯酶催化活性的催化特異性顯色反應混合物于pH約6.5的約0.1M磷酸鹽緩沖液中含有約2mM α-乙酸萘酯，約2mM β-乙酸萘酯，約1mM固藍鹽。
30.權利要求16所述的方法，其中用于谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)催化活性的催化特異性顯色反應混合物于pH約8.5的約0.1MTris-HCl中含有約2mM磷酸吡哆醛，約4mM L-天冬氨酸，約4.3mMα-酮戊二酸及約5.4mM固藍BB鹽。
31.權利要求16所述的方法，其中所述方法用于具有超酸性性質的植物和動物組織的蛋白質圖譜。
32.權利要求16所述的方法，其中對所述植物的均質采用選自如下的緩沖液(a)約0.2M Tris溶液，pH約10.5及以上，(b)pH約7.5的0.2M Tris-HCl緩沖液，含約0.2M碳酸鈉，(c)約0.2M碳酸鈉，(d)pH約7.5的約0.2M Tris-HCl，含高達50％(v/v)的二甲基亞砜，以及(e)約0.2M碳酸鈉，含高達50％(v/v)的二甲基亞砜。
33.權利要求32中所述的方法，其中用于均質的緩沖液補充有7-14％的甘油。
34.權利要求32中所述的方法，其中含有約0.2M碳酸鈉的酸性中和緩沖液組合物顯示蛋白質提取百分比增長約600％。
35.權利要求32中所述的方法，其中含有約0.2M碳酸鈉、約50％(v/v)二甲基亞砜的酸性中和緩沖液組合物顯示蛋白質提取百分比增長約600％。
36.權利要求32中所述的方法，其中含有約0.2M Tris-HCl緩沖液、約0.2M碳酸鈉，pH約7.5的酸性中和緩沖液組合物顯示蛋白質提取百分比增長約300％。
37.權利要求32中所述的方法，其中含有約0.2M Tris-HCl緩沖液以及約50％(v/v)二甲基亞砜，pH約7.5的酸性中和緩沖液組合物顯示蛋白質提取百分比增長約300％。
38.權利要求32中所述的方法，其中SDS-PAGE具有垂直電泳系統(tǒng)中帶有堆積膠和分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)。
39.權利要求38中所述的方法，其中堆積膠濃度為2-6％(T)。
40.權利要求38中所述的方法，其中分離膠濃度為10-18％(T)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于植物香葉天竺葵(天竺葵種)的超酸性氣生部分的蛋白提取物的圖譜制作方法，所述方法包含下列步驟選擇有效的提取介質，由0.2M碳酸鈉組成的提取介質提高了提取百分比約600％，選擇有效介質以確定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介質的組成為0.2－0.4M的碳酸鈉，以及0.2M碳酸鈉含有50％二甲基亞砜，選擇有效介質以確定所述提取物中酶的多分子形式，酶多分子形式介質的組成為pH7.5的0.2M Tris－HCl緩沖液并任選含50％二甲基亞砜；碳酸鈉的濃度為0.2－0.4M并任選含50％二甲基亞砜，以及在所述方法中采用包含凝膠電泳、分光光度法、離心、蛋白測定的生物化學和生物物理技術，以確定所述提取物中蛋白質的定量、定性、結構和功能方面，及其提取組合物。
文檔編號C12Q1/44GK1623093SQ02828643
公開日2005年6月1日 申請日期2002年3月25日 優(yōu)先權日2002年3月25日
發(fā)明者拉金德爾·辛格·桑萬, 尼蘭·辛格·桑萬, 巴利·拉姆·佳格, 阿夫迪什·庫馬·斯里瓦斯塔瓦, 烏沙·亞達夫 申請人:科學和工業(yè)研究委員會