專利名稱：：心肌細胞蛋白質差異表達圖譜的構建與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于藥理學和醫(yī)藥
技術領域：
，涉及藥物誘導干細胞定向分化的蛋白質差異表達圖譜的構建與應用，具體涉及構建淫羊藿苷誘導干細胞定向分化心肌細胞的蛋白質差異表達圖譜，鑒定淫羊藿苷誘導組和自發(fā)分化組表達蛋白質組的特征性變化。技術背景胚胎干細胞(embryonicstemcell,ES細胞)體外可定向分化為具有典型結構和功能的心肌細胞，該分化體系己成為研究心臟基因表達和功能的重要工具。目前，對ES細胞定向分化為心肌細胞過程中眾多基因功能和信號轉導網(wǎng)絡調控機制尚不十分清楚。雖有一些研究進行了初步探索，但主要集中于一種或少數(shù)幾種己知基因及蛋白質對心肌細胞終末分化途徑的影響。而ES細胞定向分化過程中有眾多基因、轉錄因子、蛋白質和生長因子在不同層面和不同時間調控著心肌細胞分化，若只利用傳統(tǒng)基因、蛋白分析方法，難以系統(tǒng)、徹底地闡釋整個心臟發(fā)育的基本機制。僅從DNA序列尚不能回答某基因的表達時間、表達量、蛋白質翻譯后加工和修飾的情況等等，因此在整體水平上研究蛋白質表達及功能變得日益重要。近年來發(fā)展起來的蛋白質組學技術是以基因組編碼的所有蛋白質為研究對象，從細胞水平及整體水平研究蛋白質的組成及其變化規(guī)律，從而深入認識有機體的多種生理和病理過程。其核心技術雙向電泳、質譜分析和蛋白質組信息學的迅速發(fā)展，可完成極其復雜的蛋白質功能和細胞因子變化的研究。如將其應用于ES細胞體外定向分化過程的研究，可深入探索心肌分化每一階段特征性基因轉錄產(chǎn)物蛋白質的表達及功能模式，闡明胚胎心臟早期發(fā)生與分化的生命現(xiàn)象本質，對探索干細胞的分化機制和應用有重大意義。本專利申請者所在研究小組前期工作己經(jīng)成功構建了小鼠胚胎干細胞定向分化為心肌細胞藥效篩選模型，對多種中藥單體化合物和結構多樣性庫內小分子化合物藥效進行了評價，已經(jīng)證實淫羊藿苷(icariin，ICA)介入后顯著提高ES細胞體外定向分化為心肌細胞的分化率，并使分化時相顯著提前，有良好的量效和時效關系，并初步探索了ICA能促進心肌發(fā)育依賴性基因的表達增加，并在時相上呈先后順序。但僅從基因的角度來研究還遠遠不夠，必須研究由基因轉錄和翻譯出蛋白質的過程，才能真正揭示生命現(xiàn)象的本質和規(guī)律。對ICA誘導ES細胞定向分化時信號轉導通路中基因功能的執(zhí)行者一一功能性蛋白質的表達也尚未開展研究。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供藥物誘導干細胞定向分化時蛋白質差異表達圖譜的構建方法，具體構建了ICA誘導干細胞定向分化為心肌細胞的蛋白質差異表達圖譜，通過以下步驟實現(xiàn)(1)建立藥物誘導干細胞定向分化為心肌細胞模型ES細胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，加入藥物ICA誘導其定向分化為心肌細胞。(2)制備二維電泳蛋白質樣品收集上述不同分化時相的分化細胞，加入裂解緩沖液混勻，液氮中反復凍融3次，加50(ig/mlRNase及200pg/mlDNase，在4。C放置15分鐘，16100轉離心，棄上清，再用1。/。二硫蘇糖醇(DTT)預冷丙酮洗兩遍，室溫干燥1h，水化液溶解后測蛋白濃度。優(yōu)先的上述裂解緩沖液組成含10%三氯乙酸丙酮冷溶液和1%DTT。水化液組成含8mol/L尿素，4%CHAPS和0.001%溴酚藍。(3)雙向凝膠電泳分別取步驟(2)的蛋白質各100昭與溶脹液混合，加入IPG持膠槽中進行等電聚焦。結束后膠條在平衡液中平衡20分鐘，將膠條移至SDS-PAGE分離膠上，以恒流方式電泳得凝膠。上述溶脹液組成含8mol/L尿素，4%CHAPS，65mmol/LDTT，0.2%Bio-Lyte和0.001%溴酚藍。(4)圖像采集分析:上述所得凝膠經(jīng)染色后，掃描得到的圖像用PDQUEST軟件進行分析。ES細胞自發(fā)分化為心肌細胞蛋白質的雙向電泳圖譜為參考膠,ICA誘導組的雙向電泳圖譜與之進行配比，獲得ICA誘導分化的差異表達蛋白質。上述凝膠染色采用銀染法。(5)同步驟(3)獲得凝膠，然后采用考馬氏亮藍法染色，差異蛋白質經(jīng)膠內酶切后，通過質譜，鑒定并篩選出差異蛋白。(6)明確差異蛋白后，其生物學功能即可確定，也可作蛋白印跡進一步驗證。本發(fā)明的另一個目的是提供藥物誘導干細胞定向分化的蛋白質差異表達圖譜在制備高效低毒型促進干細胞分化誘導劑中的應用，主要運用比較蛋白質圖譜篩選鑒定出ICA誘導ES細胞定向分化為心肌細胞的差異表達蛋白，該圖譜中顯示的差異表達蛋白可作為藥物作用靶位，指導制備高效低毒新型促進干細胞分化誘導劑的研發(fā)。對上述差異表達的蛋白質進行質譜鑒定和分析，共篩選出49個差異表達蛋白點，主要可分為細胞周期蛋白，蛋白質合成代謝蛋白，能量代謝蛋白，自身保護蛋白，細胞骨架蛋白，糖代謝蛋白，轉錄因子，信號轉導蛋白等7類。揭示了ICA誘導心肌細胞分化的作用靶點，為闡明ICA誘導心肌分化的作用機制提供了實驗依據(jù)，同時可作為藥物作用靶位直接指導研發(fā)新型的促細胞分化誘導劑的應用。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明成功構建了藥物ICA誘導小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞的蛋白質差異表達圖譜。(2)對上述差異表達的蛋白質進行質譜鑒定和分析，共篩選出49個差異表達蛋白點，主要可分為細胞周期蛋白，蛋白質合成代謝蛋白，能量代謝蛋白，自身保護蛋白，細胞骨架蛋白，糖代謝蛋白，轉錄因子，信號轉導蛋白等7類。揭示了ICA誘導心肌細胞分化的作用靶點，為闡明ICA誘導心肌分化的作用機制提供了實驗依據(jù)，同時可作為藥物作用耙位直接指導研發(fā)新型的促細胞分化誘導劑的應用。圖1為ES細胞定向分化的過程中細胞形態(tài)的變化。圖2為不同分化時相(分化d5+3，d5+7)由ES細胞自發(fā)分化和由ICA誘導分化而來的心肌細胞團，經(jīng)過雙向電泳得到的蛋白質表達圖譜差異比較。圖3為WESTERNBLOT法驗證ICA誘導ES細胞定向分化為心肌細胞差異蛋白表達。具體實例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。應理解，下面的優(yōu)選具體實施方案僅僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例l構建ICA誘導干細胞定向分化為心肌細胞的蛋白質差異表達圖譜(1)建立藥物誘導干細胞定向分化為心肌細胞模型ES細胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，加入藥物淫羊藿苷誘導其定向分化為心肌細胞。(2)制備二維電泳蛋白質樣品收集上述不同分化時相的分化細胞，磷酸緩沖液沖洗后，吸干殘留液，加入裂解緩沖液混勻，液氮中反復凍融3次，加50|Lig/mlRNase及200fig/mlDNase，在4。C放置15分鐘，16100轉離心，棄上清，再用1%二硫蘇糖醇(DTT)預冷丙酮洗兩遍，室溫干燥1h，水化液溶解后測蛋白濃度，分裝，-S(TC保存。優(yōu)先的上述裂解緩沖液組成含10%三氯乙酸丙酮冷溶液和1°/。DTT。水化液組成含8mol/L尿素，4。/。CHAPS和0.001%溴酚藍。(3)雙向凝膠電泳分別取步聚(2)的蛋白質各100iag與溶脹液混合，加入IPG持膠槽中，IPG干膠條膠面向下放入槽中，上覆一層礦物油，加蓋后置于水平電泳儀電極板上,進行等電聚焦。結束后膠條在平衡液中平衡20分鐘，將膠條移至SDS-PAGE分離膠上，瓊脂糖封膠，將玻璃板置于電泳槽中，以恒流方式電泳，至溴酚蘭前沿遷移至距凝膠底邊lcm處停止電泳，得凝膠。上述溶脹液組成含8mol/L尿素，4%CHAPS，65mmol/LDTT，0.2°/。Bio-Lyte和0.001%溴酚藍。(4)圖像采集分析:上述所得凝膠經(jīng)染色后,掃描得到的圖像用PDQUEST軟件進行分析。圖像分析過程包括圖譜的剪切，蛋白質點的檢測，不同凝膠間的匹配，量的歸一化以及利用內標的標準分子量和等電點確定膠內蛋白點的相對分子量和等電點。ES細胞自發(fā)分化為心肌細胞蛋白質的雙向電泳圖譜為參考膠，淫羊藿苷誘導組的雙向電泳圖譜與之進行配比，獲得淫羊藿苷誘導分化的差異表達蛋白質。上述凝膠染色采用銀染法。(5)同步驟(3)獲得凝膠，然后采用考馬氏亮藍法染色，差異蛋白質經(jīng)膠內酶切后，通過質譜，鑒定差異蛋白，與質譜庫比較，篩選出差異蛋白。(6)明確差異蛋白后，其生物學功能即可確定，也可作蛋白印跡進一步驗證。實施例2ICA誘導小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞培養(yǎng)1.ICA誘導ES細胞的分化培養(yǎng)(1)懸滴三天將未分化的ES細胞，用ES細胞分化培養(yǎng)基制成單細胞懸液后，計數(shù)，用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋成2.0xl04+/ml，在培養(yǎng)皿蓋內表面上滴加30)ul/滴的細胞液(每個懸滴包含600個ES細胞)進行懸滴分化培養(yǎng)3天待擬胚體(embryonicbody,EB)形成。(2)懸浮兩天培養(yǎng)皿預先用1%瓊脂溶液鋪置底部，將形成的EB轉入含高糖DMEM、20%胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中懸浮2天。(3)貼壁培養(yǎng)將擬胚體轉移到預先用明膠處理過的24孔板上，放入培養(yǎng)箱中孵育4-5小時，待擬胚體貼壁后，每孔加lml分化培養(yǎng)基含藥物liilICA，ICA終濃度為10'7md/L，以加溶劑DMSO為陰性對照，培養(yǎng)3天或7天收取樣本。2.免疫細胞化學鑒定心肌細胞免疫熒光法鑒定心肌特異性標記物肌鈣蛋白(TroponinT)的表達。EB貼壁培養(yǎng)數(shù)天后用純冷丙酮固定10min，再用含10%羊血清PBS處理30min，然后加入一抗Monoclonalmouseanti-cardiactroponinT(JLT-12),1:100稀釋，4。C孵育過夜。第二天用PBS洗三次，每次5min，吸干多余的液體，再加入二抗Rodamin誦F(ab，)2fragmentgoatanti-mouseIgGfortroponinT，1:1000稀釋，37。C孵育1.5h。再用PBS洗三次，每次5min，吸干多余的液體，熒光顯微鏡觀察，拍照記錄。以是否出現(xiàn)肌小節(jié)表示由ES細胞分化而來的是否是心肌細胞。參見圖l，結果顯示，擬胚體轉移到鋪有明膠的24孔板內培養(yǎng)，貼壁后繼續(xù)分化，從細胞團中由未分化的細胞團分化成心肌細胞。心肌細胞團形狀類似球體，有自動節(jié)律性收縮的中心。一個擬胚體含有一個或多個收縮中心，說明此時已經(jīng)分化得到心肌細胞。對貼壁分化成的心肌細胞進行免疫熒光染色，可見心肌細胞肌小節(jié)蛋白troponinT呈現(xiàn)紅色熒光，出現(xiàn)明顯的肌小節(jié)，參見圖1D。圖1是ES細胞定向分化的過程中細胞形態(tài)的變化，圖中(A)ES細胞在MEF伺養(yǎng)層上克隆(箭頭處為ES細胞克隆)；(B)懸浮培養(yǎng)的EB;(C)由EB發(fā)育而來的自發(fā)收縮跳動的心肌細胞群。(D)肌鈣蛋白T(troponinT)免疫熒光陽性染色。Bar=25(im(A,B，D),10pm(C)。實施例3雙向凝膠電泳分離ICA誘導ES細胞定向心肌細胞分化的蛋白質表達點先進行等電聚焦電泳將總蛋白按照等電點分離，然后再進行SDS-PAGE按照分子大小進一步分離，經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。通過對照蛋白質圖分析ES細胞分化為心肌細胞不同分化時期和ICA誘導后的蛋白質表達變化情況，從而發(fā)現(xiàn)和確定目標蛋白。(1)樣品制備A.細胞樣品吸出培養(yǎng)液，用細胞刮收集細胞(貼壁培養(yǎng)3天和7天的自發(fā)分化和經(jīng)ICA誘導分化成的心肌細胞)。加入D-Hanks溶液，1500轉、分離心10分鐘，棄上清。重復3次。加入5倍體積裂解液(含10%三氯乙酸丙酮冷溶液和1%DTT)消化混勻。液氮中反復凍融3次。加50pg/mlRNase及200pg/mlDNase，在4°C放置15分鐘。16100轉，4。C離心15分鐘。收集上清，分裝后凍存于一80。C。B.蛋白定量采用Bradford試劑盒。(2)第一向等電聚焦從-2(TC冰箱中取出保存的水化上樣緩沖液400pl(含8mol/L尿素，4%CHAPS，0.001%溴酚藍，不含DTT，不含Bio-Lyte)—小管(lml/管)，置室溫溶解。在小管中加入0.01gDTT，Bio-Lyte各5^1，加入100pl樣品，充分混勻。從-20'C冰箱取出保存的IPG預制膠條(18cmpH3-10)，室溫放置10分鐘。沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。上樣量為100^ig蛋白/300pl。當所有的蛋白質樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕去除預制IPG膠條上的保護層。分清膠條正負極，輕輕將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使膠條正極(標有+)對應于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油。對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序為每根膠條的極限電流50(iA/根，等電聚焦時的溫度2(TC。將聚焦結束的膠條立即進行平衡和第二向SDS-PAGE電泳。(3)膠條的平衡聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。將膠條轉移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液(I)(含6mol/L尿素，2%SDS，0.375mol/LTris-HCl，20%甘油和2%DTT)。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。第一次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液。再加入膠條平衡緩沖液(II)(含6mol/L尿素，2%SDS,0.375mol/LTris-HCl，20%甘油和2.5%碘乙酰胺)，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。(4)第二向SDS-PAGE電泳配制12.5%丙烯酰胺凝膠兩塊。待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水，用MilliQ水沖洗。用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。將10x電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成lx電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。第二次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在lx電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。用鑷子輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。放置10分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時用的低電流或低電壓，待樣品完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流(或電壓)，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。(5)電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號。采用銀染法進行凝膠染色。(6)圖象分析采用PDQuest軟件進行詳細分析，比較蛋白質斑點差異。結果顯示，以18cm長pH范圍3-10的IPG膠條作為一相分離，以12.5%SDS-PAGE作為二相分離，SDS-PAGE凝膠銀染法染色后，掃描圖片以PDQuest軟件分析，自發(fā)分化d5+3、d5+7心肌細胞、ICA誘導分化d5+3、d5+7心肌細胞組別順序，蛋白質表達整體上依次呈上調趨勢(參見圖2)。蛋白表達呈明顯分化時相，隨著分化進行蛋白表達數(shù)量逐漸遞增，同時期的ICA誘導分化組較自發(fā)分化組表達明顯增加，且與小鼠胎心組織的蛋白表達情況更為接近。圖2是不同分化時相(分化d5+3，d5+7)由ES細胞自發(fā)分化和由ICA誘導分化而來的心肌細胞團，經(jīng)過雙向電泳得到的蛋白質表達圖譜差異比較，圖中(A)ES細胞自發(fā)分化組第5+3天；(B)ICA誘導組第5+3天；(C)ES細胞自發(fā)分化組第5+3天；(D)ICA誘導組第5+7天；(E)胎鼠心肌組織。圖中標注的編號對應表達差異的蛋白質點。實施例4質譜鑒定ICA誘導ES細胞定向心肌細胞分化的差異表達蛋白質1.質譜鑒定重復進行雙向電泳實驗，利用考馬斯亮藍染色，將掃描分析后的膠置于明亮的燈光下,用硅垸化的槍頭切取蛋白質點,用胰蛋白酶膠內酶解蛋白,MOLDI-TOF-MS鑒定，獲得檢測樣品的肽質量指紋圖譜。2.數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質數(shù)據(jù)庫檢索(http:〃mascot.proteomics.com.cn/search-form-PMF.html)，根據(jù)搜索結果并結合蛋白質在膠上的等電點和分子量最終確定蛋白質。結果顯示，將實施例2中差異蛋白點切割酶解，通過質譜鑒定，共得到49個差異表達蛋白，其中上調44，下調5個(表l)。差異表達的49個蛋白主要可分為細胞周期蛋白，蛋白質合成代謝蛋白，能量代謝蛋白，自身保護蛋白，細胞骨架蛋白，糖代謝蛋白，轉錄因子，信號轉導蛋白等7類。提示雙向電泳技術的應用能在蛋白質整體水平上揭示藥物誘導ES細胞分化為心肌細胞過程中的差異表達情況，為深入探索心肌分化每一階段蛋白質的表達及功能模式和確認藥物誘導分化作用靶點提供了實驗依據(jù)。表1ICA誘導ES細胞定向分化為心肌細胞過程中的差異表達蛋白蛋白質名稱編號序列號分子量等電點肽序列肽序列打:(NCBI)(kDa)打分信度細胞周期RAS相關同源體A2F131692398621768.15.83216100細胞骨架內質網(wǎng)蛋白29前體E141952646328805.15.9338100角蛋白復合物1，酸性，基因19E19668060644514.75.28374100加帽蛋白(肌動蛋白絲)肌Z線alFl3346888732919.35.34369100肌球蛋白輕鏈2異構體MLC-2aF1762791918252.94.48193100波形蛋白C24207800151533.14.96238100能量代謝腺苷酸激酶4D2675302225046.17.02364100ATP合成酶，轉H+作用的線粒體D242131367918737.65.52259100F0復合物，d亞單位電子傳遞黃素蛋白，a多肽E66691122934987.58.62177100E8218100E10l卯100異檸檬酸脫氫酶3(NAD+)aE171825028439613.16.27417100蛋白質合成/代謝/加工/分解泛素羧基末端水解酶L1D3675592924821.55.33180100遍在蛋白綴合酶E2ND164507793171276.13207100E3413100<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例5采用WSTERNBLOT法鑒定ICA誘導ES細胞定向心肌細胞分化的差異表達蛋白質收集各組樣本于4'C冰浴上加入裂解緩沖液(PH7.5Tris-鹽酸20mmol/L，NaCl150mmol/L，EDTA1mmol/L，TritonX-1001%，去氧膽酸鈉0.5%，PMSFlmmol/L，leupeptin10pg/ml，aprotitin30pg/ml)，在冰上多次反復吹打30min，4°C13000xg離心30min獲得上清即為總蛋白，Lowry試劑盒法(DC蛋白檢測試劑盒，Bio-Rad，CA,US)對蛋白濃度進行定量，分裝后凍存?zhèn)溆谩DS-PAGE，蛋白免疫印記和膠片光密度分析方法按常規(guī)操作。蛋白上樣量為80pg/道。SDS-PAGE后將蛋白電轉膜至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，一抗以1:1000稀釋度加于用0.05。/。吐溫PBS溶解的5%脫脂奶中，搖床上室溫孵育2h或4'C孵育過夜。用含0.05。/。吐溫的PBS洗膜3次，以除去非特異性結合一抗。繼續(xù)孵育二抗l-2h，二抗稀釋度為1:5000。相同條件下洗膜三次，用ECL試劑顯色，暗室中用X光膠片曝光，全自動沖片機沖洗膠片。膠片上蛋白條帶經(jīng)掃描后進行光密度分析。本實驗中以GAPDH作為管家蛋白。結果顯示，選擇驗證的幾個蛋白泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)，肌球蛋白輕鏈2異構體(MLC-2a),蛋白酶體a2亞基(PAMA2)，晶體蛋白aB(AB-CRY)，經(jīng)WESTERNBLOT方法檢測的蛋白表達水平趨勢和雙向電泳結果基本一致。結果參見圖3。無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發(fā)明。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種心肌細胞蛋白質差異表達圖譜的構建方法，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)(1)建立藥物誘導干細胞定向分化為心肌細胞模型ES細胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，加入藥物ICA誘導其定向分化為心肌細胞；(2)制備二維電泳蛋白質樣品收集上述不同分化時相的分化細胞，加入裂解緩沖液混勻，液氮中反復凍融3次，加50μg/mlRNase及200μg/mlDNase，在4℃放置15分鐘，16100轉離心，棄上清，再用1％二硫蘇糖醇預冷丙酮洗兩遍，室溫干燥1小時，水化液溶解后測蛋白濃度，上述裂解緩沖液組成含10％三氯乙酸丙酮冷溶液和1％二硫蘇糖醇，水化液組成含8mol/L尿素，4％CHAPS和0.001％溴酚藍；(3)雙向凝膠電泳分別取步驟(2)的蛋白質各100μg與溶脹液混合，加入IPG持膠槽中進行等電聚焦，結束后膠條在平衡液中平衡20分鐘，將膠條移至SDS-PAGE分離膠上，以恒流方式電泳得凝膠，上述溶脹液組成含8mol/L尿素，4％CHAPS，65mmol/LDTT，0.2％Bio-Lyte和0.001％溴酚藍；(4)圖像采集分析上述所得凝膠經(jīng)染色后，掃描得到的圖像用PDQUEST軟件進行分析，ES細胞自發(fā)分化為心肌細胞蛋白質的雙向電泳圖譜為參考膠，ICA誘導組的雙向電泳圖譜與之進行配比，獲得ICA誘導分化的差異表達蛋白質，上述凝膠染色采用銀染法；(5)同步驟(3)獲得凝膠，然后采用考馬氏亮藍法染色，差異蛋白質經(jīng)膠內酶切后，通過質譜，鑒定并篩選出差異蛋白；(6)明確差異蛋白后，其生物學功能即可確定，或作蛋白印跡進一步驗證。2.根據(jù)權利要求1方法構建的心肌細胞蛋白質差異表達圖譜在制備高效低毒型促進干細胞分化誘導劑中的應用，其特征是運用比較蛋白質圖譜篩選鑒定出ICA誘導ES細胞定向分化為心肌細胞的差異表達蛋白，利用差異表達蛋白作為藥物作用靶位，在制備高效低毒型促進干細胞分化誘導劑中的應用。全文摘要本發(fā)明提供藥物誘導干細胞定向分化時蛋白質差異表達圖譜的構建方法，具體構建了ICA誘導干細胞定向分化為心肌細胞的蛋白質差異表達圖譜，通過建立藥物誘導干細胞定向分化為心肌細胞模型，制備二維電泳蛋白質樣品，雙向凝膠電泳，圖像采集分析，明確差異蛋白。運用比較蛋白質圖譜篩選鑒定出ICA誘導ES細胞定向分化為心肌細胞的差異表達蛋白，利用差異表達蛋白作為藥物作用靶位，在制備高效低毒新型促進干細胞分化誘導劑中的應用。文檔編號G01N27/64GK101329300SQ20081012008公開日2008年12月24日申請日期2008年7月18日優(yōu)先權日2008年7月18日發(fā)明者周立民,張翔南,朱丹雁,歡李,梁星光,樓宜嘉申請人:浙江大學