專利名稱：蛋白質(zhì)表達的圖析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)和多肽的檢測以及圖析領(lǐng)域，特別是微量蛋白質(zhì)表達的圖析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因組的信息是由脫氧核糖核酸(DNA)攜帶的。一個指定基因組序列的大小和組成決定了其產(chǎn)物有機體的形式和功能。通常來說，基因組的復(fù)雜程度與有機體的復(fù)雜程度成比例。相對簡單的有機體如細菌具有約1-5兆堿基而哺乳動物基因組大約有3000兆堿基?；蚪M通常分成獨立的區(qū)域，也就是公知的染色體。細菌，大腸桿菌(E.coli)含有單個的環(huán)狀染色體，而人類基因組由24種染色體組成。
基因組DNA是以含有由糖-磷酸鹽骨架連接起來的四種DNA堿基(A，G，C和T)的雙鏈多聚體。DNA中堿基的順序是DNA的一級序列結(jié)構(gòu)。一種有機體的基因組既含有蛋白編碼序列又含有非編碼區(qū)域，包括外顯子和內(nèi)含子，啟動子和基因調(diào)節(jié)序列以及非功能性DNA。基因組分析可以提供基因拷貝數(shù)目和染色體數(shù)目的定量測量，還可以測量DNA一級序列中存在的單個堿基差異。遺傳下來的單個堿基變化即為多態(tài)性，而那些在有機體的生存過程中獲得的單個堿基變化則是公知的突變。DNA水平上的基因組分析并不是提供基因表達的測定(也就是說，合成RNA和編碼序列蛋白質(zhì)拷貝的過程)。
指定有機體的所有細胞都被認為含有相同的基因組，而來自相同物種的不同個體的基因組典型地具有約99.9％的同一性。預(yù)期通過對任何兩個人基因組進行完全測序而找到大約3百萬的多態(tài)性，所以個體中0.1％的多態(tài)性比率(Wang等，Science 2801077(1998))是非常重要的。如果單個堿基的變化發(fā)生在蛋白質(zhì)編碼序列中，多態(tài)性將改變蛋白質(zhì)的序列從而改變該蛋白質(zhì)的生物活性。
DNA基因組由不連續(xù)的功能區(qū)構(gòu)成，這些功能區(qū)即為公知的基因。簡單有機體如細菌的基因組含有大約1000個基因(Fleischmann等，Science269496(1995)，而預(yù)計人基因組含有約100,000個基因(Fields等，Nature Genet.7345(1994))。mRNA水平的基因組分析可以作為基因表達的一種測量手段。每個基因的表達水平通過結(jié)合遺傳和環(huán)境因素來測定。遺傳因素包括基因調(diào)節(jié)序列的精確DNA序列，如啟動子，增強子和剪接位點。于是預(yù)期DNA的多態(tài)性能夠在相同物種的不同個體中引起基因表達的區(qū)別。表達水平還能夠被環(huán)境因素所影響，包括溫度，壓力，光照以及導(dǎo)致激素的水平有所改變的信號和其他起信號作用物質(zhì)。因此，RNA分析不僅提供關(guān)于有機體遺傳潛力的信息，還提供關(guān)于功能區(qū)的變化信息(M.Schena and R.W.Davis，DNA MicroarraysA PracticalApproach.(Oxford University Press，New York，1999)1-16.)。
基因表達的第二步是從mRNA合成蛋白質(zhì)。獨特的蛋白質(zhì)是由不同的mRNA編碼的，mRNA的每3個核苷酸編碼該多肽鏈的一個氨基酸，核苷酸的線性順序即代表氨基酸的線性序列。一旦被合成，該蛋白被認為具有獨特的三維結(jié)構(gòu)，該三維結(jié)構(gòu)基本上是由氨基酸的一級結(jié)構(gòu)所決定。蛋白質(zhì)通過運行廣泛的生物活性而執(zhí)行基因組的功能性指令，包括在基因調(diào)節(jié)，代謝，細胞結(jié)構(gòu)和DNA復(fù)制中起作用。
群體中的各個體可由于多態(tài)性而在蛋白質(zhì)的活性上有所不同，多態(tài)性可能改變蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列，也可能通過改變基因表達而影響穩(wěn)定狀態(tài)的蛋白質(zhì)水平。類似于mRNA水平，蛋白質(zhì)水平也可以相應(yīng)于環(huán)境的改變而有所改變；而且，蛋白質(zhì)水平還受翻譯和翻譯后調(diào)控因素的影響，這些因素并不直接影響mRNA水平(Schena and David，1999)。蛋白(proteomics)分析為一個預(yù)測的基因產(chǎn)物實際上何時被翻譯或是否確實被翻譯，其可能經(jīng)受的翻譯后修飾的水平和類型，以及其相較于其他蛋白的相對濃度而提供數(shù)據(jù)(Humphrey-Smith and Blackstock，J.Protein.Chem.16537-544(1997))。當(dāng)DNA被轉(zhuǎn)錄成mRNA，在被翻譯成蛋白質(zhì)之前，外顯子可通過不同方式被拼接起來。通過核糖體對mRNA進行翻譯后，蛋白質(zhì)通常經(jīng)歷翻譯后修飾，添加不同的化學(xué)基團例如糖類、脂類以及磷酸基團，還可以通過蛋白水解分裂特定的肽鍵。這些化學(xué)修飾對于調(diào)節(jié)蛋白功能至關(guān)重要，但其并不是由基因直接編碼。更具體的，mRNA和蛋白質(zhì)被持續(xù)地合成和降解，這樣，蛋白質(zhì)的最后水平并不能通過測定mRNA水平而輕易地測定出來(Patton，J.Chromatogr.722203-223，(1999)；Patton等，J.Biol.Chem.27021404-21410(1995))。所以，當(dāng)通常用推斷mRNA的水平來表示表達蛋白的水平時，豐富的mRNA種類與這些mRNA實際所編碼的蛋白數(shù)目之間幾乎沒有相關(guān)性就在意料之中了(Anderson and Seilhamer，Electrophoresis18533-537；Gygi等，Mol.Cell.Biol.191720-1730(1999)).。
不斷增加的證據(jù)證明在基因和蛋白表達中的改變可能與特定人類疾病的發(fā)生相關(guān)(Schena and Davis，1999)。疾病組織的蛋白分析應(yīng)該能夠鑒定在特定疾病中表達被改變了的蛋白。許多小分子可以在總體水平上改變蛋白的表達。將關(guān)于疾病狀態(tài)下改變了的表達的信息與用小分子進行治療而引起的改變的信息相結(jié)合，可以得到關(guān)于能夠有效對抗特定疾病的分子類型的寶貴信息。于是蛋白分析在諸如前導(dǎo)化合物的篩選和最優(yōu)化、毒性、藥物動力學(xué)和藥效的方法中起作用。
蛋白分析的關(guān)鍵元件是其能夠精確地并且可重復(fù)地定量大多數(shù)蛋白的能力。典型地，蛋白分析引起各種蛋白質(zhì)從生物樣品中同時分離，并且定量在分離過程中溶解的相對豐富的蛋白質(zhì)。蛋白分析通常基本上依靠雙向(2-D)凝膠電泳。但是，使用2-D凝膠而得到關(guān)于總體蛋白表達的信息在技術(shù)上是十分困難的，用半自動的方法進行這個測定還處于初步的研究階段(Patton，Biotechniques 28944-957(2000))。而且，通常在評價2-D凝膠中蛋白表達中使用的染料(例如考馬斯藍、膠體金和銀染料)并不能提供在該方法中有效的必備動力學(xué)范圍。這些染料只在10到40倍的范圍內(nèi)呈線性，而個體蛋白的豐度存在多達4個數(shù)量級的差異(Brush，The Scientist1216-22，1998；Wirth and Romano，J.Chromatogr 698123-143(1995))。另外，低豐度蛋白，例如轉(zhuǎn)錄因子和激酶，其以1-2000拷貝數(shù)每個細胞數(shù)目存在，通常代表具有重要調(diào)節(jié)功能的種類。精確地檢測這些低豐度蛋白是蛋白分析的一個重要的頗具挑戰(zhàn)性的任務(wù)。最近已經(jīng)有關(guān)于通過質(zhì)譜分析直接定量兩種不同樣品中相對蛋白豐度方法的介紹。但是，這些方法的動力學(xué)線性范圍顯示出只有4到10倍(Gygi等1999；Oda等，Proc.Natl.Acad.Sci USA966591-6596(1999))。
最近人們注意到微矩陣技術(shù)的發(fā)展能夠同時地并且異常敏感地測定少量樣品中成百甚至上千種物質(zhì)(Ekins，Clin.Chem.442015-2030(1998))。但是，這種方法難于簡化操作，由于所需的用于在這些微矩陣中產(chǎn)生點的樣品體積相當(dāng)小(約0.5-5nl)，必須采用靈敏度非常高的分析方法。DNA聚合酶驅(qū)動的滾環(huán)擴增(RCA)可以線性或幾何動力學(xué)地在等溫條件下復(fù)制環(huán)狀寡聚核苷酸探針(Lizardi等，Nature Genet.19225-232(1998))。如果使用單一引物，RCA在幾分鐘之內(nèi)產(chǎn)生成百或成千串聯(lián)的靶目標DNA拷貝線狀鏈，這些線狀鏈與靶目標共價偶聯(lián)。通過產(chǎn)生的線狀擴增產(chǎn)物可以對靶目標進行立體結(jié)構(gòu)的辨析以及精確地定量。RCA產(chǎn)生的DNA可以用熒光寡核苷酸標記物標記，該標記物可以與串聯(lián)的DNA序列在多位點雜交。RCA可以結(jié)合熒光基團來設(shè)計多色編碼(Speicher等，Nature Genet.12368-375(1996))，從而顯著地提高可被同時分析的靶目標的數(shù)目。RCA技術(shù)可應(yīng)用在溶液，原位以及微矩陣中。在固相態(tài)中，可在單個分子的水平進行檢測和定量(Lizardi等，1998)。
所以，本發(fā)明的一個目的是提供檢測少量且低濃度分析物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供檢測樣品中多種少量且低濃度分析物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供擴增的待測分析物信號的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供自動測定樣品中多種少量且低濃度分析物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供圖析樣品中多種分析物存在的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供比較在不同樣品中多種分析物存在的圖譜的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供評估化合物與目的分子相互作用的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供檢測少量以及低濃度蛋白和多肽的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供檢測樣品中多種少量和低濃度蛋白和多肽的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供擴增的待測蛋白或多肽的信號的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供自動檢測樣品中多種少量及低濃度蛋白和多肽的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供圖析樣品中多種蛋白和多肽存在的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供對比不同樣品中多種蛋白和多肽存在的圖譜的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供評估化合物與目的蛋白和多肽相互作用的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測少量和低濃度分析物的組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測少量和低濃度蛋白和多肽的組合物。

發(fā)明內(nèi)容
公開了用于檢測少量分析物例如蛋白和多肽的組合物和方法。該方法包括使核酸引物與分析物相連，然后使用引物介導(dǎo)環(huán)狀DNA分子的滾環(huán)復(fù)制。DNA環(huán)的擴增依賴于引物的存在。這樣，本發(fā)明公開的方法通過滾環(huán)擴增從任何目的分析物產(chǎn)生了擴增的信號。擴增是等溫的，并且能夠從每種引物產(chǎn)生大量的核酸。擴增的DNA仍然通過引物與分析物相連，這樣就能夠允許空間檢測分析物。
本發(fā)明公開的方法優(yōu)選用于檢測并分析蛋白和多肽。在優(yōu)選的實施例中，多種蛋白可通過微矩陣來分析，在微矩陣中多種不同蛋白或分析物直接或間接與之相連(如果這些蛋白與分析物存在于受測的樣品中)。然后，滾環(huán)復(fù)制引物通過該引物和特異性結(jié)合分子例如抗體的偶聯(lián)物與各種蛋白相連，該特異性結(jié)合分子是能夠與待測蛋白特異性結(jié)合的。該引物引導(dǎo)的滾環(huán)復(fù)制引起在微矩陣中蛋白被固定的位點生成大量DNA。擴增的DNA作為該蛋白的簡易檢測信號。微矩陣中各種蛋白可以通過幾種方式來區(qū)別。例如，如果不同的蛋白被固定在矩陣中各預(yù)先指定的位置上，那么擴增DNA的定位就指示著相關(guān)的蛋白?；蛘?，每種不同的蛋白可以與不相同的滾環(huán)復(fù)制引物相連，這些引物依次引導(dǎo)不同DNA環(huán)的滾環(huán)復(fù)制。那么每種不同蛋白就可以得到區(qū)別性的擴增DNA?？墒褂萌魏魏线m的基于序列基礎(chǔ)上的核酸檢測技術(shù)區(qū)分出各種不同的擴增DNA。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例涉及對兩種或更多樣品中的表達蛋白進行對比。產(chǎn)生的信息類似于在核酸表達圖譜中收集的信息類型。本發(fā)明的方法可以對任何細胞或組織中表達的蛋白進行高靈敏度且準確的檢測和定量。本發(fā)明的方法還允許在同一個試驗中對來自不同待測樣品的一種或多種相同分析物同時進行檢測。


圖1是免疫RCA試驗實施例的圖表。左上指示子結(jié)合引物，由偶聯(lián)到寡核苷酸的抗體構(gòu)成，與分析物結(jié)合，該分析物通過共價偶聯(lián)或通過分析物捕獲劑而被捕獲到固體表面。右上一個擴增的靶環(huán)與寡核苷酸的互補序列雜交。左下洗滌所獲的偶聯(lián)物以去除過量反應(yīng)物，然后擴增的靶環(huán)通過RCA被擴增。右下擴增產(chǎn)物通過與熒光標記的寡核苷酸雜交而被原位標記。
圖2是蛋白對柱洗脫部分作圖的圖表(毫克/毫升)。如實施例1所述，將偶聯(lián)混合物上陰離子交換柱并用梯度鹽洗脫。收集各洗脫部分并測定蛋白含量。匯總蛋白峰并通過紫外線分光和SDS-PAGE測定抗體/DNA含量。
圖3是吸光值對柱各洗脫部分作圖的圖表(在260nm，吸光值單位X10-3)。如實施例1中描述，收集含有抗體-DNA偶聯(lián)物的陰離子交換層析各洗脫部分，濃縮，然后上大小排阻柱。接下來在260nm，用pH7.5的磷酸鈉，150mM NaCl，1mM EDTA，0.01％ Tween20洗脫DNA。該圖顯示有各種填充/洗脫覆蓋，收集洗脫成份16-20，并測定其純度。
圖4是吸光值(405nm下)對競爭性抗體濃度(nM)作圖的圖表。該圖顯示抗人IgE單克隆抗體的在親和力方面的偶聯(lián)作用。如實施例1中描述，用在DNA-偶聯(lián)物(空心方塊)或未偶聯(lián)的形式(實心圓)中的抗-人IgE抗體，進行競爭性ELISA試驗。
圖5是DNA合成(皮摩爾pmols)對時間作圖。該圖對比了在RCA相互作用中游離的以及與抗體結(jié)合的引物。按實施例1描述，用等摩爾數(shù)量的抗-人IgE-引物2偶聯(lián)物(空心圓)或未偶聯(lián)的引物2進行RCA。
圖6是熒光強度對IgE濃度(ng/ml)作圖。如實施例2所述，該圖以ELISA模式對比了免疫RCA和常規(guī)免疫實驗。實心圓是免疫RCA的人IgEELISA實驗，使用抗人IgE-DNA偶聯(lián)體?？招姆綁K是人IgE的ELISA實驗，使用抗-人IgE-堿性磷酸酶偶聯(lián)物。
圖7是以磁性微粒形式進行的免疫RCA和常規(guī)免疫實驗中見到的熒光條型圖。除了使用的磁性微粒是按實施例3所描述的固態(tài)外，這些實驗是使用和圖6的相同的抗人IgE偶聯(lián)物進行。
圖8是熒光強度對PSA濃度(ng/ml)作圖。該圖顯示通過免疫RCA在微點試驗中進行的PSA檢測。顯微鏡中的熒光圖像按實施例4描述進行定量，并對微點上孵育的PSA濃度作圖。
圖9是熒光強度對IgE濃度(ng/ml)作圖。該圖顯示按實施例5的描述，通過免疫RCA在微矩陣中進行IgE檢測。免疫RCA抗人IgE微矩陣對純化的IgE劑量-感應(yīng)。來自6個微矩陣點的信息對于每個點是平均的，背景信號(無IgE)被減掉。
圖10是點計數(shù)對親和素抗地高辛配基比率作圖的條形圖。該圖顯示使用實施例6所描述的免疫RCA-CACHET的雙抗原檢測?？?抗生物素蛋白和抗-綿羊抗體偶聯(lián)物的RCA產(chǎn)物分別用帶有熒光素和Cy3標記檢測子的寡核苷酸修飾。使用優(yōu)化用于熒光素和Cy3檢測的過濾裝置來分別獲得熒光信號。
圖11是本發(fā)明方法一個實施例圖表，其中通過同一個試驗檢測在兩個不同樣品中(樣品1和樣品2)存在的相同分析物。這可通過使用兩個不同分析物捕獲劑來實現(xiàn)，每種捕獲劑都有不同的捕獲基團(半抗原1和半抗原2)，這樣不同的指示子結(jié)合引物(指示子結(jié)合引物1和2)就會與不同的分析物捕獲劑結(jié)合。每種不同的指示子結(jié)合引物具有不同的滾環(huán)復(fù)制引物，這樣，每種引物介導(dǎo)不同擴增靶環(huán)(擴增靶環(huán)1和2)的滾環(huán)擴增。
圖12是在兩種不同樣品中，Cy5熒光密度與Cy3熒光密度比率對IgE比率作圖的條形圖。該圖顯示如實施例7所述在兩種不同樣品中相同分析物的表達圖譜。用制備的抗IgE抗體孵育固定濃度的IgE，并且用二次制備的抗IgE抗體孵育各種濃度的IgE。將兩個混合物同時應(yīng)用于由抗IgE捕獲抗體構(gòu)成的微矩陣。進行免疫RCA測定每種IgE-抗-IgE偶聯(lián)物的量，該免疫RCA使用針對每種偶聯(lián)物的抗體-DNA偶聯(lián)物，該抗體-偶聯(lián)物含有兩種不同的滾環(huán)復(fù)制引物，并且同時檢測所獲帶有Cy5標記和Cy3標記的檢測子探針的兩種TS-DNA。
圖13是本發(fā)明的一個實施例圖表，其中對相同分析物的兩種不同形式的存在進行檢測。這是通過使用兩種不同的指示子結(jié)合引物(指示子結(jié)合引物1和2)來實現(xiàn)的，每一種都具有一個不相同的特異性結(jié)合分子，該分子與分析物以不同形式結(jié)合(在這個例子中，是該分析物的磷酸化和未磷酸化形式)。各種不同指示子結(jié)合引物具有不同的滾環(huán)復(fù)制引物，這樣每種引物介導(dǎo)不同擴增靶環(huán)(擴增靶環(huán)1和2)的滾環(huán)擴增。
圖14是本發(fā)明方法一個實施例圖表，其中評估了競爭分子的存在，或一種分子與其他兩種分子(分子1和分子3)的相互作用進行競爭的能力，其中一個分子是固定化的。在有效的競爭性分子(分子3)的存在下，其它兩種分子的相互作用有所減少或消除。使用能夠與非固定化分子1起相互作用的指示子結(jié)合引物。如果這兩種分子起相互作用，擴增DNA將會與該分子相連。如果不起相互作用(即是說，當(dāng)競爭性分子阻止了相互作用)擴增的DNA就不會與該固定化的分子相連。分子1、2和3是分析物、分析物捕獲劑、，以及輔助分子，其可為任意順序。
圖15是本發(fā)明公開方法的一個實施例的圖表，其中測定了蛋白與mRNA的相互作用。由引物和與mRNA起相互作用的蛋白構(gòu)成的指示子結(jié)合引物(配基-引物)與mRNA相連，該mRNA/指示子結(jié)合引物偶聯(lián)物(mRNA-多肽)與固定在玻璃載玻片上的分析物捕獲劑(低聚體)雜交。隨后該引物介導(dǎo)滾環(huán)擴增。
圖16是熒光強度對22個患者樣品的一套微矩陣中的過敏原作圖的條形圖。該圖顯示免疫RCA微矩陣檢測患者血清中過敏原特異性IgE。按實施例8所述，將來自患者的血清樣品與用貓毛、狗毛、屋內(nèi)灰塵螨((D.farinae和D.pteronyssinus)以及豌豆提取物點成的微矩陣孵育。按所述掃描矩陣并定量熒光信號。
圖17是抗原比率對來自兩種不同樣品在一個單獨微矩陣上的PSA雙色檢測的信號比率作圖的條形圖。該圖顯示通過免疫RCA在兩種不同樣品中定量PSA抗原，一種是用生物素標記的抗-PSA，另一種是用FITC標記的抗PSA。生物素和FITC樣品被加入到相同的矩陣并使用抗-生物素(引物1)和抗-FITC(引物2)偶聯(lián)物通過免疫RCA檢測。按實施例7所述，用Cy3(引物2)和Cy5(引物1)信號強度的比率作圖，作為兩個樣品中PSA抗原的功能比率。
圖18A和18B是在一個微矩陣中同時多元化地檢測兩種不同細胞素的細胞素數(shù)量條形圖。該圖顯示在含有IL1a和TNF混合物的樣品中，這兩種細胞素的數(shù)量(圖18A)。微矩陣中含有這兩種細胞素的捕獲抗體，該抗體固定在矩陣中的不同位點。使用與引物1偶聯(lián)的抗-生物素通過免疫RCA進行檢測。只含有IL1a的對照樣品產(chǎn)生單一信號，即IL1a的信號，顯示了相互作用的特異性(圖18B)。
具體實施例方式
本發(fā)明公開了用于檢測少量分析物如蛋白和多肽的組合物和方法。該方法將核酸信號的擴增能力應(yīng)用于檢測非核酸分析物。這種分析物的檢測基本上是取決于對足夠數(shù)量的分析物的檢測或高靈敏度標記的應(yīng)用，針對這種分析物還未發(fā)展出與核酸擴增技術(shù)相當(dāng)?shù)臄U增技術(shù)。該標記的應(yīng)用既繁瑣又有限。本發(fā)明公開的方法提供了一種簡單且高靈敏度的方法來產(chǎn)生任何目的分析物的擴增信號。
本發(fā)明公開的方法是RCA的一種形式，其中指示子結(jié)合引物提供了擴增靶環(huán)需要的滾環(huán)復(fù)制引物。本方法基于指示子結(jié)合引物與靶分子(也指分析物)的偶聯(lián)，允許RCA產(chǎn)生一種擴增信號(即是，串聯(lián)DNA序列(TS-DNA))。該特異性引物序列是指示子結(jié)合引物的一部分，其提供指示子結(jié)合引物與分析物的特異性相互作用的偶聯(lián)(通過指示子結(jié)合引物的親合部分)以及RCA。一旦指示子結(jié)合引物與分析物相連，擴增靶環(huán)(ATC)就與指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物序列相連，然后通過RCA擴增ATC。獲得的TS-DNA在一端合并了指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物序列，這樣就可以錨定TS-DNA到分析物的位點。本發(fā)明公開的方法可使用任何分析物進行。優(yōu)選的分析物是核酸，包括擴增的核酸例如TS-DNA和擴增靶環(huán)，抗原和配基。本公開方法的靶分子在此通常指分析物。
本公開方法優(yōu)選用于檢測并分析蛋白和多肽。在優(yōu)選的實施例中，使用微矩陣對多種蛋白進行分析，而各種蛋白是被固定在該微矩陣中的(如果這些蛋白是存在于待測樣品中)。然后滾環(huán)復(fù)制引物通過使用引物和特異性結(jié)合分子的偶聯(lián)物與各種蛋白相連，其中的特異性結(jié)合分子可以例如是抗體，其特異性地結(jié)合待測蛋白。引物引導(dǎo)的滾環(huán)復(fù)制在矩陣中該蛋白被固定的位點產(chǎn)生了大量DNA。擴增的DNA作為該蛋白的簡易檢測信號。矩陣中不同的蛋白可用多種方法區(qū)分。例如，如果不同的蛋白被固定在矩陣中預(yù)先指定的位置上，擴增DNA的定位就可以指示相關(guān)蛋白。或者，每種不同的蛋白可以與不同的滾環(huán)復(fù)制引物相連，這些引物依次引導(dǎo)不同DNA環(huán)的滾環(huán)復(fù)制。這樣從每種蛋白得到不同的擴增DNA。這些不相同的擴增DNA可使用任何合適的基于序列基礎(chǔ)上的核酸檢測技術(shù)而被區(qū)分。
本方法另一優(yōu)選實施例涉及對比在兩種或更多不同樣品中蛋白的表達。產(chǎn)生的信息類似于在核酸表達圖譜中收集到的信息類型。例如，來自不同樣品的相同分析物可以與不同的引物相連，這些引物能夠引導(dǎo)不同DNA環(huán)的復(fù)制從而產(chǎn)生不同的擴增DNA。用這種方法，來自一個樣品的分析物所產(chǎn)生的擴增DNA可以不同于另一不同樣品中相同分析物所產(chǎn)生的擴增DNA。該實施例顯示在圖11中，其中來自兩種不同樣品的同一分析物產(chǎn)生了兩種不同DNA環(huán)的擴增。
甚至，當(dāng)這些樣品在引物與分析物相連之后被混合到一起時，仍然可以獲得這個樣品的特異性檢測(本方法一種優(yōu)選的模式)。例如，在圖中11，分析物捕獲劑(與半抗原1和半抗原2結(jié)合的抗體)可分別與樣品1和樣品2混合。在另一優(yōu)選實施例中，每種樣品中的這些分析物用不同的半抗原直接標記。這樣，不同樣品中相同類型的分析物與不同的半抗原相連。在優(yōu)選實施例中，樣品被混合到一起。分析物可如圖11所示在底物上被捕獲，指示子結(jié)合引物可以與分析物捕獲劑相連，然后DNA環(huán)從滾環(huán)復(fù)制引物擴增。即使來自不同樣品的分析物被捕獲在底物的相同位點(本方法的一個優(yōu)選模式)，該位點出現(xiàn)的每種分析物其來源及數(shù)量可通過將被產(chǎn)生的不同擴增DNA而被測定。
分析物的來源(也就是是說，該分析物來自的樣品)可以被測定，例如，通過對不同的擴增DNA(這些DNA產(chǎn)生自針對不同樣品的引物)使用不同的標記。通過使用當(dāng)與其它標記同時被檢測時可以被區(qū)分的標記(例如具有獨特發(fā)射光譜的熒光標記)，所有的樣品都可以被混合在一起并一起分析。被檢測的標記通過各部分構(gòu)成的鏈標記-擴增的DNA-環(huán)DNA-引物-分析物，而間接地鑒定出分析物的來源在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選形式中，即指免疫RCA，滾環(huán)復(fù)制引物的5’末端與抗體相連。在本方法的一個優(yōu)選形式中，該抗體是直接抗半抗原的。在本方法的另一優(yōu)選實施例中，該抗體是直接抗分析物本身的。在環(huán)狀DNA(指擴增靶環(huán))、DNA聚合酶和核苷酸的存在下，滾環(huán)反應(yīng)導(dǎo)致DNA分子的形成，該分子由環(huán)狀DNA序列(指串聯(lián)DNA序列)的多拷貝構(gòu)成，該DNA序列仍與抗體相連(圖1)。擴增DNA可通過不同方法檢測，包括直接合并半抗原-或熒光-標記的核酸，或者通過與熒光物質(zhì)或酶法標記的互補寡核苷酸探針雜交。盡管RCA反應(yīng)可以線性或幾何動力學(xué)實施(Lizardi等，1998)，本發(fā)明公開的信號產(chǎn)生方法優(yōu)選使用線性RCA。
另一方面，本發(fā)明涉及固定存在于復(fù)雜的生物樣品中的分析物，并且確定和定量其在樣品中的存在情況。在此，這個通過固定來確定和定量分析物的方法是使用含有過敏原的樣品而描述。例如，在生物提取物和體液中存在的過敏原可按實施例8的描述，通過初級選擇性固定將其固定在微矩陣中。然后可以進行免疫RCA微矩陣試驗來檢測并定量。
另一方面，本方法還涉及對一個樣品中存在的不止一種分析物進行多元化檢測和定量。這在實施例9中說明，其中微矩陣含有幾種測試位點，每種測試位點含有一個固定化的捕獲抗體，該位點與含有待測蛋白分析物的混合物的樣品共同孵育。接下來，該微矩陣與含有至少一種抗每種分析物的抗體的混合物孵育，這些抗體是生物素化的。然后進行免疫RCA微矩陣試驗來檢測并定量。
另一方面，免疫RCA可以在16微孔玻璃載玻片上進行，其中每個孔之間都被特氟隆遮蔽膜分隔開。這在實施例8中說明，其中100-400點的微矩陣被點到每個微孔中。這些孔的每一個都被用于試驗不同的樣品以及對照。多孔載玻片16孔的6個孔中被點上抗-IgE捕獲抗體的矩陣。在該多孔形式的過敏原微矩陣上的免疫RCA實驗可以通過例如低廉的BeckmanBioMek液體處理機器人而半自動的進行。
基于微矩陣基礎(chǔ)上的免疫RCA實驗可應(yīng)用于其它多抗體實驗。例如，由特異性IgG4而不是IgE引起的某種免疫反應(yīng)(AAAI Board of Directors，J Allergy Clin Immunol.95652-654(1995))。與互補于DNA環(huán)的DNA引物相連的抗人IgG4的應(yīng)用允許同時測定過敏原特異性的IgG4和IgE，其中的DNA環(huán)序列與互補于偶聯(lián)到抗-IgE的引物的DNA環(huán)不同。這種方法可用在過敏原去敏治療過程中或監(jiān)測對抗IgE反應(yīng)的治療中(Chang NatureBiotech.18157-162(2000))。
微矩陣中免疫RCA的多元化能力，既是空間定位的(即在矩陣中定點多分析物的能力)又是顯色的(即對結(jié)合到分析物上的多抗體類型的檢測以及區(qū)分能力)可用于其它涉及多特異性抗體檢測的臨床診斷實驗中，這些多特異性抗體是例如在懷疑患有系統(tǒng)性自身免疫疾病，關(guān)節(jié)炎，器官特異性自身免疫疾病患者或在組織相容性測試中的自身抗體。其它的應(yīng)用包括用菌株和種特異性IgM和IgG測定的感染疾病診斷，以及在體外測定在懷疑患有初級和次級免疫缺陷疾病的患者體內(nèi)功能性抗體應(yīng)答。最后，這種多元化、自動且高靈敏度的形式除涉及抗體檢測之外還可以應(yīng)用于其它免疫實驗。微矩陣上RCA引導(dǎo)的夾心免疫實驗?zāi)軌虮确治鑫锢缜傲邢傺蹇乖某Ｒ?guī)實驗，將靈敏度提高3到4個對數(shù)。這樣，本方法在診斷和預(yù)測能力上產(chǎn)生了巨大的進步，該能力是通過對于疾病的分子階段，對多種分析物進行同時的檢測而獲得。
由于不同的特異性序列可任意地與每個單個分析物相連，所以核酸是理想的用于多分析物檢測的分子標記。如果每個DNA標記都是獨特的，與DNA直接共價連接可以制備無限制數(shù)目的抗體DNA加合物并可以用任何方式組合(Hendrickson等，Nucleic Acids Res.23522-529(1995))。共價連接對于進行簡單實驗形式也是有利的，因為混合的試劑更少且需要洗滌步驟；而且，裝配在一起的各部分，其化學(xué)計量學(xué)的變率可以避免。在一個優(yōu)選實施例中，本方法在信號擴增策略中使用了共價連接策略，術(shù)語稱為免疫RCA。通過采用幾種合成和純化策略的修飾和改進，可以高產(chǎn)率地產(chǎn)生高純度的這些偶聯(lián)體。
材料A.分析物本發(fā)明公開的方法涉及分析物的檢測?？偟膩碚f，任何化合物，基團或者化合物或偶聯(lián)物的組份都可以作為分析物。優(yōu)選的分析物是多肽，蛋白和其它大分子物質(zhì)，例如脂類、碳水化合偶聯(lián)物、蛋白脂、膜片段和核酸。分析物還可以是較小分子，例如輔助因子、代謝物、酶底物、金屬離子和金屬螯合物。優(yōu)選的分析物分子量為100道爾頓到1,000,000道爾頓。
分析物可以被修飾，包括天然發(fā)生的或在體內(nèi)或體外被誘導(dǎo)的。誘導(dǎo)的修飾包括加成，例如半抗原偶聯(lián)、多聚化，通過與其它化學(xué)基團相互作用得到的偶聯(lián)物，(例如通過蛋白酶)消化或分裂，金屬離子偶聯(lián)或去除。本發(fā)明的方法可用于檢測分析物在修飾狀態(tài)的區(qū)別之處，例如蛋白的磷酸化或糖基化狀態(tài)。
分析物可以直接或間接地與底物相連，優(yōu)選在矩陣中。最優(yōu)選是微矩陣。分析物可以使用分析物捕獲劑被捕獲和/或固定。固定的分析物可用于捕獲其它組份，這些組份在本發(fā)明的方法中作為分析物捕獲劑和指示子結(jié)合引物。
B.指示子結(jié)合引物指示子結(jié)合引物是偶聯(lián)到或連接到寡核苷酸的特異性結(jié)合分子。該特異性結(jié)合分子是指指示子結(jié)合引物的親和部分，而寡核苷酸是指指示子結(jié)合引物的寡核苷酸部分。在本發(fā)明的一個方法中，該寡核苷酸部分作為滾環(huán)復(fù)制引物(相應(yīng)地，指示子結(jié)合物的寡核苷酸部分在此也指滾環(huán)復(fù)制引物)。這允許加入的ATC滾環(huán)復(fù)制，其所得到的TS-DNA與指示子結(jié)合引物相連。因此，該TS-DNA就能夠有效地被固定到分析物的位點。
滾環(huán)復(fù)制引物序列的序列可任意選擇。在使用多指示子結(jié)合引物的多元化試驗中，優(yōu)選每個指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物序列是基本上不相同的，來限制檢測到非特異性靶物質(zhì)的可能性。或者，在一些多元化試驗中，可能期望使用具有相關(guān)序列的滾環(huán)復(fù)制引物序列。這種試驗可以使用一種或幾種ATC來檢測大量分析物。該寡核苷酸部分可以是任何長度，只要這個長度能夠確保在寡核苷酸部分與擴增靶環(huán)的引物互補部分之間能夠特異的穩(wěn)定的雜交。通常這個長度是12到100個核苷酸，但優(yōu)選20到45個核苷酸長度。
在此，特異性結(jié)合分子是與特殊分子或基團特異性相互作用的分子。這個與特異性結(jié)合分子相互作用的分子或基團可以是分析物或其它分子，該分子在特異性結(jié)合分子和分析物之間的相互作用中作為中間體。這種中間體分子的一個優(yōu)選例是分析物捕獲劑。術(shù)語分析物應(yīng)該理解為既包括分離的分子也包括分子的一個部分，例如蛋白的抗原決定部位，這些分子特異性地與特異性結(jié)合分子相互作用?？贵w，不論其是受體/配體部分，以及其它具有特異性親和力的分子都屬于特異性結(jié)合分子，都可用作指示子結(jié)合引物的親和部分。帶有親和部分的指示子結(jié)合引物在此還指指示子抗體，其中該親和部分是抗體。通過將滾環(huán)復(fù)制引物與這種特異性結(jié)合分子相偶聯(lián)，可利用擴增帶有滾環(huán)復(fù)制的ATC來檢測特異性結(jié)合分子與其特異性靶物質(zhì)之間的結(jié)合。這種擴增可以高靈敏度地將相連的非常少量的分析物檢測出來。
特異性地與特殊分析物相互作用的指示子結(jié)合引物應(yīng)該是該分析物特異性的。例如，帶有親和部分是抗體的指示子結(jié)合引物應(yīng)該是對特定抗原具有特異性的，所述抗體與該抗原結(jié)合。該抗原是分析物。
用作指示子結(jié)合引物親和部分的抗體可商業(yè)途徑獲得或使用公知的方法制備。例如，Johnstone和Thorpe，30-85頁，描述了產(chǎn)生多克隆和單克隆的常規(guī)方法。全書描述了抗體在實驗系統(tǒng)中的應(yīng)用中的許多常規(guī)技術(shù)和原理。
在應(yīng)用中，指示子結(jié)合引物不必要絕對純。該指示子結(jié)合引物優(yōu)選具有至少20％的純度，更優(yōu)選至少50％純度，更優(yōu)選至少80％純度，更優(yōu)選至少90％純度。
C.擴增靶環(huán)擴增靶環(huán)(ATC)是環(huán)狀單鏈DNA分子，通常含有40到1000個核苷酸，優(yōu)選大約具有50到150個核苷酸，最優(yōu)選大約具有50到100個核苷酸。ATC的各部分具有特異性功能，使得ATC可用于滾環(huán)復(fù)制(RCA)。這些部分指作為引物的互補部分、檢測標記部分、次級靶序列部分、地址標記部分和啟動子部分。引物的互補部分是擴增靶環(huán)的必備元件。檢測標記部分、次級靶序列部分、地址標記部分、和啟動子部分是任選的。通常，擴增靶環(huán)是單鏈環(huán)狀DNA分子，其含有引物的互補部分。ATC的這些與ATC特異性部分不相關(guān)的部分可以是任選的序列。優(yōu)選ATC不具有自身互補的序列。如果互補區(qū)不超過6個核苷酸、沒有錯配或缺口，才允許出現(xiàn)這種情況。還優(yōu)選含有啟動子部分的ATC不具有任何類似于轉(zhuǎn)錄終止子的序列，例如8個或更多胸腺嘧啶核苷酸群。
當(dāng)擴增靶環(huán)復(fù)制時，會產(chǎn)生含有多重復(fù)序列的長DNA分子，該重復(fù)序列互補于擴增靶環(huán)。這個長DNA分子在此就是指串聯(lián)DND序列(TS-DNA)。TS-DNA含有互補于引物互補部分的序列和擴增靶環(huán)、檢測標記部分、次級靶序列部分、地址標記部分以及啟動子上，如果存在這些元件的話。TS-DNA中的這些序列是指作為引物序列(其匹配于滾環(huán)復(fù)制引物序列)、間隔序列(互補于間隔區(qū))、檢測標記、次級靶序列、地址標記和啟動子序列。擴增靶環(huán)可用作特異性結(jié)合分子的標記。
D.滾環(huán)復(fù)制引物滾環(huán)復(fù)制引物(RCRP)是具有互補于ATC引物互補部分序列的寡核苷酸。該序列是指RCRP的互補部分。RCRP的這個互補部分以及同源的引物互補部分可以具有任何期望的序列，只要它們之間可以互補。通常，RCRP的序列可如此選擇該序列并不明顯互補于任何ATC的其它部分。滾環(huán)復(fù)制引物的互補部分可以是任何長度，只要該長度能夠確保在該引物和該引物互補部分之間特異的穩(wěn)定的雜交。通常是12到100個核苷酸長度，優(yōu)選20到45核苷酸長度。
優(yōu)選滾環(huán)復(fù)制引物還包括額外的序列，該序列在RCRP的5’末端，與ATC的任何部分都不互補。該序列是指作為RCRP的非互補部分。如果存在的話，這個RCRP的非互補部分的作用是在DNA復(fù)制過程中促進鏈的移位。該RCRP的非互補部分可以是任何長度。但通常是1到100個核苷酸長度，優(yōu)選4到8個核苷酸長度。滾環(huán)復(fù)制引物可在鏈移位串聯(lián)擴增中用作三級DNA鏈的移位引物。
在一個優(yōu)選實施例中，滾環(huán)復(fù)制引物(以及其它本發(fā)明所用的引物)可包含間隔子。當(dāng)固定化時，該間隔子可幫助克服來自表面的空間因素，有助于在引物上錨定聚合酶，或者提供其它幫助，例如控制或改變矩陣元素的疏水性。用于本發(fā)明的間隔子包括核甘酸間隔子例如多聚dT或多聚dA；脂肪族連接子例如C18，C12或其多聚體，芳香族間隔子，或RNA，DNA，PNA或其組合。
E.分析物捕獲劑分析物捕獲劑是能夠與分析物相互作用的任何化合物，并且使分析物被固定或與其它化合物和分析物分離。分析物捕獲劑包括分析物相互作用部分。分析物捕獲劑還可以包括捕獲部分。不具有捕獲部分的分析物捕獲劑優(yōu)選被固定到固體支持物上。分析物捕獲劑的分析物相互作用部分是能夠與特定分子或基團特異性相互作用的分子。這個與分析物捕獲劑的分析物相互作用部分特異性相互作用的特定分子或基團可以是分析物或其它在分析物相互作用部分和分析物之間的相互作用中起中間體作用的分子。術(shù)語分析物應(yīng)理解為既指分離的分子又指與分析物相互作用部分特異性相互作用的分子的一部分，例如蛋白的抗原決定部位。抗體，或者受體/配體對中的一個，以及其它具有特異性結(jié)合親和力的分子都是能夠用作分析物捕獲劑的分析物相互作用部分的實例。分析物捕獲劑的這個特異性結(jié)合部分可以是任何能夠與分析物相互作用的化合物或組合物，例如多肽。與特定分析物特異性相互作用的分析物捕獲劑應(yīng)該是該分析物特異性的。例如，分析物捕獲劑帶有分析物相互作用部分，該相互作用部分是結(jié)合特定抗原的抗體，那么該分析物捕獲劑應(yīng)該是該抗原特異性的。該抗原是分析物。
可用作分析物捕獲劑的分析物相互作用部分的分子實例是抗體，例如天然(血清)抗體、純化的抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、抗體片段(例如，F(xiàn)ab片段)；抗體相互作用物質(zhì)，例如蛋白A，碳水化合物結(jié)合蛋白和其它相互作用物；蛋白相互作用物(例如親和素及其衍生物)；多肽；和小分子化合物，例如酶底物、輔助因子、金屬離子/螯合物、和半抗原?？贵w可以是修飾的或化學(xué)處理的從而優(yōu)化其與表面和/或靶物質(zhì)的結(jié)合。
用作分析物捕獲劑的分析物相互作用部分的抗體可以商業(yè)途徑獲得或使用公知的方法制備。例如，Johnstone和Thorpe，30-85頁，描述了產(chǎn)生多克隆和單克隆的常規(guī)方法。全書描述了抗體在實驗系統(tǒng)中的應(yīng)用中的許多常規(guī)技術(shù)和原理。
分析物捕獲劑的捕獲部分是任何可以與其它化合物相連的化合物。優(yōu)選地，捕獲部分是化合物，例如配體或半抗原，其能夠與其它化合物，例如配體結(jié)合分子或抗體結(jié)合或相互作用。這種在捕獲部分和捕獲化合物之間的相互作用還優(yōu)選是特異性相互作用，例如在半抗原和抗體之間或配體和配體結(jié)合分子之間的相互作用。半抗原的實例包括生物素、FITC、地高辛、和二硝基苯酚。捕獲部分可用于從未與分析物捕獲劑相連的化合物或偶聯(lián)物中分離出與分析物捕獲劑相連的化合物或偶聯(lián)物。
將分析物或分析物捕獲劑固定到底物上可以通過幾種方法實施。在一個實施例中，捕獲位點被附著或連接到底物上。捕獲位點是化合物或基團，其能夠通過結(jié)合到分析物捕獲劑(分析物與之偶聯(lián)或?qū)⒁悸?lián))的捕獲部分，或與之相互作用，從而介導(dǎo)分析物的附著。固定在底物上的捕獲位點將分析物捕獲到底物上。這樣捕獲劑提供了一種簡便方法來洗脫可能影響后續(xù)步驟的反應(yīng)組份?；蛘?，分析物捕獲劑可直接被固定到底物上。如果這樣，那么分析物捕獲劑的捕獲部分不再必要。
在一個實施例中，分析物捕獲劑或待固定的捕獲位點是抗雜交瘤抗體。將抗體和其它蛋白質(zhì)固定到底物的方法已完善建立。固定可通過附著完成，例如使用標準的化學(xué)固定方法進行的胺化表面，羧化表面或羥化表面。附著劑的實例是溴化氰、琥珀酰亞胺、醛、甲苯磺酰氯、親和素-生物素、光致交聯(lián)物質(zhì)、環(huán)氧化物和馬來酰亞胺。一個優(yōu)選的附著劑是異雙功能交聯(lián)試劑例如N-[r-馬來酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)。這些和其它附著劑，以及它們在附著中的應(yīng)用方法，在RichardF.Taylor，編輯(M.Dekker，New York，1991)蛋白質(zhì)固定基礎(chǔ)與應(yīng)用，Johnstone和Thorpe，Immunochemistry In Practice(BlackwellScientific Publications，Oxford，England，1987)209-216頁和241-242頁，以及Immobilized Affinity Ligands，Craig T.Hermanson等編輯(Academic Press，New York，1992)中描述。抗體通過將抗體上游離氨基基團化學(xué)交聯(lián)到底物上存在的反應(yīng)性側(cè)基而附著于底物上。例如，使用戊二醛、碳化二亞胺或異雙功能試劑例如GMBS作為交聯(lián)劑，抗體可以化學(xué)交聯(lián)到含有游離氨基、羧基或硫基團的底物上。在該方法中，含有游離抗體的水溶液與固態(tài)底物一起在戊二醛或碳化二亞胺的存在下孵育。為了與戊二醛交聯(lián)，反應(yīng)物可以與2％的戊二醛在一定體積緩沖液例如pH7.4，0.1M二甲基胂酸鈉中孵育。其它常規(guī)的化學(xué)固定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。
分析物捕獲劑的一種有用的形式是多肽。當(dāng)各種多肽被固定到矩陣中，它們可以用作分析物的“誘餌”。例如，不同多肽的矩陣可用作評價樣品中是否含有與這些多肽之中任一相互作用的分析物?？梢员容^不同樣品，通過例如比較不同樣品中分析物與之結(jié)合的多肽的區(qū)別。本方法另一形式中，目的分析物特異性的分析物捕獲劑矩陣可用于評價樣品中是否存在一整套分析物。
在應(yīng)用中，分析物捕獲劑不必要絕對純。優(yōu)選分析物捕獲劑具有至少20％的純度，更優(yōu)選至少50％純度，更優(yōu)選至少80％純度，更優(yōu)選至少90％純度。
F.輔助分子輔助分子是那些影響分析物和特異性結(jié)合分子或分析物捕獲劑之間相互作用的分子。例如，輔助分子可以是與分析物競爭結(jié)合的分析物捕獲劑或特異性結(jié)合分子的分子。競爭性輔助分子的一個形式就是分析物類似物。類似物就是在結(jié)構(gòu)上相類似但是競爭力不同的分子。在此，分析物類似物應(yīng)該是足夠類似以至可與該分析物的分析物捕獲劑或特異性結(jié)合分子相互作用。輔助分子還可以是有助于分析物和特異性結(jié)合分子或分析物捕獲劑之間相互作用，或者是該相互作用必需的分子。這種輔助分子在此指分析物結(jié)合輔助因子。
在本方法的一個形式中，輔助分子可以是化合物，其對分析物結(jié)合的影響有待測定。例如，本方法可用于篩選與特定結(jié)合分子或分析物捕獲劑相互作用的分析物的競爭物(或結(jié)合輔助因子)。如果輔助分子影響了分析物的相互作用，由于指示子結(jié)合引物與分析物的(或者分析物捕獲劑與分析物的)偶聯(lián)會丟失或增強，則RCA的結(jié)果將會改變。圖14說明了競爭分析物和分析物捕獲劑之間相互作用的實例。
在應(yīng)用中，輔助分子不必要絕對純。優(yōu)選輔助分子具有至少20％的純度，更優(yōu)選至少50％純度，更優(yōu)選至少80％純度，更優(yōu)選至少90％純度。
G.檢測標記為幫助使用本方法的核酸擴增的檢測和定量，可以將檢測標記直接并入擴增核酸或者與檢測分子相連。在此，檢測標記是任何能夠直接或間接與擴增核酸相連的分子，其能夠直接或間接產(chǎn)生可測量，可檢測的信號。許多這種可摻入到核酸或與核酸或抗體探針相連的標記都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。適用于RCA的檢測標記的實例有放射性同位素、熒光分子、磷光分子、酶、抗體和配體。
合適的熒光標記的例子包括熒光素(FITC)，5，6羧甲基熒光素，Texasred，硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑-4-基(NBD)，香豆素，丹磺酰氯，若丹明，4’-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，和花青染料Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7。優(yōu)選的熒光標記是熒光素(5-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯)和若丹明(5，6-四甲基若丹明)。優(yōu)選的用于組合多色編碼的熒光標記是FITC和花青染料Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7。這些熒光物質(zhì)的最大吸收波長和發(fā)射波長分別是FITC(490nm；520nm)，Cy3(554nm；568nm)，Cy3.5(581nm；588nm)，Cy5(652nm672nm)，Cy5.5(682nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)，這樣，就可以對它們同時進行檢測。熒光標記可以從不同的商業(yè)途徑獲得，包括Molecular Probes，Eugene，OR and Research Organics，Cleveland，Ohio。
被標記的核苷酸是優(yōu)選的檢測標記形式，因為它們可以在合成時被直接摻入到RCA的產(chǎn)物中?？杀粨饺氲綌U增DNA或RNA的檢測標記的例子包括核苷酸類似物例如BrdUrd(Hoy和Schimke，Mutation Research290217-230(1993))，BrUTP(Wansick等，J.Cell Biology122283-293(1993))和生物素修飾的核苷酸(Langer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786633(1981))或用合適的半抗原例如地高辛修飾的核苷酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205359-364(1992))。合適的熒光標記的核苷酸是熒光素氰酸鹽-dUTP，花青-3dUTP和花青-5-dUTP(Yu等，Nucleic AcidsRes.，223226-3232(1994))。優(yōu)選的DNA核苷酸類似物檢測標記是BrdUrd(BUDR三磷酸，Sigma)，優(yōu)選的RNA核苷酸類似物檢測標記是生物素-16-尿苷5’-三磷酸(生物素-16-dUTP，Boehringher Mannheim)。熒光素，Cy3和Cy5可與dUTP相連作為直接標記。Cy3.5和Cy7可作為抗生素或抗-地高辛偶聯(lián)體，用于生物素-或地高辛-標記探針的二次檢測。
摻入到擴增核酸的檢測標記，例如生物素，可以使用本領(lǐng)域公知的高靈敏度的方法被隨后檢測。例如，可以使用抗生物素蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Tropix，Inc.)檢測生物素，該偶聯(lián)物與生物素相連并隨即通過適當(dāng)?shù)孜?例如，化學(xué)發(fā)光底物CSPD3-(4-甲氧基螺-[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3-2’-(5’-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二鈉；Tropix，Inc.)的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而被檢測出。
用于檢測擴增RNA的優(yōu)選檢測標記是吖啶(acridinium)酯-標記的DNA探針(GenProbe，Inc.，如Arnold等人描述，Clinical Chemistry351588-1594(1989))。吖啶酯-標記的檢測探針可使擴增RNA的檢測無需洗滌，因為未雜交的探針可以用堿消除(Arnold等(1989))。
能夠結(jié)合兩種或更多這些檢測標記的分子也可作為檢測標記。任何已知的檢測標記都可與本發(fā)明的探針、標記以及標記和檢測使用本方法擴增的核酸的方法一起使用。檢測和測量檢測標記所產(chǎn)生的信號的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，放射性同位素可通過閃爍計數(shù)或直接的目測進行測定，熒光分子可用熒光分光光度計檢測；磷光分子可用掃描儀或分光光度計檢測，或用照相機直接目測；酶可以通過對該酶催化的相互作用產(chǎn)物的檢測或目測來檢測；抗體可通過檢測與該抗體相連的次級檢測標記來檢測。這種方法可直接應(yīng)用于本發(fā)明的擴增和檢測的方法。在此，檢測分子是與擴增核酸相互作用的分子，并且一種或多種檢測標記與之相連。
H.檢測探針檢測探針是標記的寡核苷酸，具有互補于TS-DNA上的檢測標記的序列。檢測探針的該互補部分可以是任何長度，只要這個長度能夠確保其特異性以及在檢測探針與檢測標記之間能夠穩(wěn)定的雜交。為此，優(yōu)選10到35個核苷酸長度，最優(yōu)選檢測探針的互補部分具有16到20個核苷酸長度。檢測探針可含有上述的任一檢測標記。優(yōu)選的標記是生物素和熒光分子。特別優(yōu)選的檢測探針是分子燈塔(molecular beacon)。分子燈塔是使用熒光基團標記的檢測探針，其中該熒光基團只有在該檢測探針被雜交時才會發(fā)出熒光(Tyagi和Kramer，Nature Biotechnology14303-308(1996))。因為未雜交的檢測探針不會產(chǎn)生信號，所以這種探針的應(yīng)用排除了在檢測標記以前必須去除未雜交探針的必要。這在多元試驗中尤其有用。如WO97/19193中描述，該TS-DNA可用降解檢測探針降解。降解TS-DNA在下述的組合的多色編碼中尤其有用。
I.DNA鏈移位引物用于次級DNA鏈移位的引物在此是指DNA鏈移位引物。DNA鏈移位引物的一種形式，在此該DNA鏈移位引物指次級DNA鏈移位引物，是寡核苷酸，其具有ATC序列的序列匹配部分。該序列指次級DNA鏈移位引物的匹配部分。次級DNA鏈移位引物的這個匹配部分互補于TS-DNA的序列。該次級DNA鏈移位引物匹配部分可以互補于TS-DNA的任何序列。該次級DNA鏈移位引物匹配部分可以是任何長度，只要這個長度能夠確保其在引物與其互補序列之間的特異穩(wěn)定的雜交。通常是12到35個核苷酸長度，但優(yōu)選18到25個核苷酸長度。
DNA鏈移位引物的另一種形式，在此指三級DNA鏈移位引物，是具有互補于ATC部分序列的序列的寡核苷酸。該序列指作為三級DNA鏈移位引物的互補部分。該三級DNA鏈移位引物互補部分與TS-DNA的序列相匹配。該三級DNA移位引物的互補部分可以互補于ATC的任何序列。該三級DNA移位引物的互補部分可以是任何長度，只要這個長度能夠確保在引物與其互補序列之間特異的并穩(wěn)定的雜交。通常是12到35個核苷酸長度，但優(yōu)選18到25個核苷酸長度。
在USP5,854,033和WO97/19193中更加詳細描述了DNA鏈移位引物及其應(yīng)用。
J.寡核苷酸合成滾環(huán)復(fù)制引物、檢測探針、地址探針、擴增靶環(huán)、DNA鏈移位引物、以及任何其它寡核苷酸都可以用已建立的寡核苷酸合成方法合成。生產(chǎn)或合成寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。這種方法既包括常規(guī)酶法消化后分離核苷酸片段(例如參見Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)5，6章)，又包括高純度合成方法，例如氰乙基亞磷酰胺方法，使用Milligen或Beckman System lPlus DNA合成儀(例如，Milligen-Biosearch的Model 8700自動合成儀，Burlington，MA or PerSeptive Expedite)。用于產(chǎn)生寡核苷酸的合成方法還在Ikuta等人，Ann.Rev.Biochem.53323-356(1984)，(phosphotriester and phosphite-triester methods)，和Narang等人，Methods Enzymol.，65610-620(1980)，(phosphotriester method)中描述。蛋白核酸分子的制備可使用已知方法，例如Nielsen等人在Bioconjug.Chem.53-7(1994)中的描述。
本文描述的許多寡核苷酸是設(shè)計成互補于其它寡核苷酸或核酸的特定部分，使其之間能夠形成穩(wěn)定的雜交。這些雜交的穩(wěn)定性可以通過已知方法計算，例如Lesnick和Freier，Biochemistry3410807-10815(1995)，McGraw等，Biotechniques8674-678(1990)，和Rychlik等人，Nucleic Acids Res.186409-6412(1990)的描述。
K.固體支持物固體支持物是分析物能夠與之相連的固體底物或支持物。分析物可以與團體支持物直接或間接相連。例如，分析物可以被直接固定在固體支持物上。分析物捕獲劑和輔助分子也可以被固定在固體支持物上。固體支持物的一個優(yōu)選形式是矩陣。固體支持物的另一形式是矩陣檢測器。矩陣檢測器是固體支持物，多種不同的地址探針或檢測分子被偶聯(lián)到該固體支持物上的矩陣，格柵或其它有機化模式上。
用作固體支持物的固態(tài)底物可包括寡核苷酸能夠與之相連的任何固體材料。這些材料包括，例如，丙烯酰胺、、瓊脂糖、、纖維素、、硝酸纖維素、、玻璃、、聚苯乙烯、、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚環(huán)氧乙烷、聚硅酸酯、聚碳酸酯、特氟隆、碳氟化合物、尼龍、硅橡膠、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基富馬酸酯、膠原、葡糖胺聚糖和聚氨基酸。固態(tài)底物可以是任何應(yīng)用形式、包括薄膜、膜、瓶、皿、纖維、編織纖維、成型聚合物、顆粒、珠子、微?；蚱浣M合。固態(tài)底物和固體支持物可以是多孔的或無孔。優(yōu)選的固態(tài)底物形式是微量滴定板。最優(yōu)選的微量滴定板形式是標準的96孔板。在一個優(yōu)選實施例中，使用了多孔玻璃載玻片，其中每孔標準地含有一個矩陣。該特征允許更大的分析重現(xiàn)性的對照，提高了物料通過量和樣品處理量，且簡易地自動進行。
不同的分析物、分析物捕獲劑、或輔助分子可作為一整套同時使用。這一套可以是所有或部分分析物、分析物捕獲劑和輔助分子的混合物，其在不同反應(yīng)中分別被使用，或被固定在矩陣中。單獨使用或混合使用的分析物、分析物捕獲劑和輔助分子可通過，例如與固體支持物相連或固定于其上而被物理分離。一個矩陣包括固定在矩陣中已鑒定或預(yù)先指定的位點的多元分析物、分析物捕獲劑、和/或輔助分子。矩陣中每個預(yù)先指定的位點通常具有一個類型的組份(也就是說，在該位點所有的組份都是相同的)。每個位點都具有該組份的多個拷貝。在矩陣中，不同組份的空間分隔保障了分析物的分別檢測和鑒定。
盡管優(yōu)選，但指定的矩陣不必要是單一單元或結(jié)構(gòu)。這套分析物、分析物捕獲劑或輔助分子可以分布在固體支持物上的任一單元。例如，舉一個極端例子，每種探針都可以固定在分離的反應(yīng)試管或容器上，或者在分離的珠子或微粒上。
本發(fā)明方法的不同模式可用固定在固體支持物上的不同組份(例如，分析物、分析物捕獲劑、和輔助分子)實施。例如，圖14說明了本方法的一種實施例，其中在三種分子(分子1，2和3)之間的相互作用是使用了固體支持物評價的。這三種分子的每一種可以代表，例如，分析物捕獲劑、輔助分子或分析物。如果分子2是分析物，那么分子1就是分析物捕獲劑而分子3就是輔助分子。在這種情況下，分析物(分子2)是被固定的。如果分子2是分析物捕獲劑，那么分子1就是分析物而分子3是輔助分子。在這種情況下，分析物捕獲劑(分子2)就是被固定的。本方法的另一實施例中，輔助分子可以是被固定的。
在另一實施例中，RCA是在液體中進行的，并且擴增產(chǎn)物是被捕獲在矩陣中。例如，生物素化的捕獲抗體被加入到含有分析物的樣品中，然后加入能夠結(jié)合分析物不同位點的指示子結(jié)合引物。這些組份—捕獲抗體和指示子結(jié)合引物—可以任何順序加入。然后進行RCA來產(chǎn)生TS-DNA，并在含有抗生物素蛋白鏈菌素的介質(zhì)(例如，抗生物素蛋白鏈菌素珠(Dynal))上進行純化。然后通過雜交到含有寡核苷酸探針的矩陣來檢測或定量TS-DNA，該探針互補于TS-DNA。{0＞Such probes are referredto herein as address probes.＜}0{＞這種探針在此指地址探針。＜0}{0＞By attaching different address probes to different regionsof a solid support，different RCA products can be captured atdifferent，and therefore diagnostic，locations on the solidsupport.＜}0{＞通過在固體支持物的不同區(qū)域附著不同的地址探針，可以在固體支持體上的各不同位點捕獲不同的RCA產(chǎn)物，因為位點不同，所以這些位點具有診斷價值。例如在微量滴定板多元試驗中，對至多96種不同TS-DNA(每種通過不同的引物和ATC進行擴增)具有特異性的地址探針，可被固定到微量滴定板上，每種都在不同的孔中。捕獲和檢測只在矩陣中那些相應(yīng)于TS-DNA的探針元件中進行，這些TS-DNA的對應(yīng)分析物存在于樣品中。
固定寡核苷酸到固態(tài)底物的方法已建立。該核苷酸，包括地址探針和檢測探針，可通過已建立的結(jié)合方法連接到底物上。例如，合適的附著方法如Pease等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11)5022-5026(1994)，和Khrapko等，Mol Biol(Mosk)(USSR)25718-730(1991)的描述。固定3’-氨基寡核苷酸到酪蛋白覆蓋的載玻片上的方法由Stimpson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA926379-6383(1995)描述。優(yōu)選的附著寡核苷酸到固態(tài)底物的方法由Guo等，Nucleic Acids Res.225456-5465(1994)描述。
一些用于RCA試驗的固體支持物帶有附著到固態(tài)底物上的檢測抗體。這種抗體對目的分子具有特異性。然后捕獲的目的分子可通過結(jié)合次級指示子抗體繼而進行RCA而被檢測出?？贵w在固體支持物上的這種應(yīng)用使RCA試驗發(fā)展到用于檢測任何分子，只要該分子能夠產(chǎn)生抗體。固定抗體連接到固態(tài)底物的方法已完善建立。可以使用常規(guī)固定化學(xué)試劑通過附著，例如胺化表面、羧化表面或羥化表面實現(xiàn)固定。附著劑的實例是溴化氰、琥珀酰亞胺、醛、甲苯磺酰氯、親和素-生物素、光致交聯(lián)物質(zhì)、環(huán)氧化物和馬來酰亞胺。一個優(yōu)選的附著劑是異雙功能交聯(lián)試劑例如N-[r-馬來酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)。這些和其它附著劑，以及它們在附著中的應(yīng)用方法，在Richard F.Taylor編輯(M.Dekker，New York，1991)的蛋白固定基礎(chǔ)和應(yīng)用，Johnstone和Thorpe，Immunochemistry In Practice(Blackwell Scientific Publications，Oxford，England，1987)209-216頁和241-242頁，以及ImmobilizedAffinity Ligands，Craig T.Hermanson等編輯(Academic Press，NewYork，1992)中描述?？赏ㄟ^將抗體上游離的氨基化學(xué)偶聯(lián)到固態(tài)底物上存在的反應(yīng)側(cè)基上而將抗體附著到底物上。例如，分別使用戊二醛、碳化二亞胺或異雙功能試劑例如GMBS作為交聯(lián)劑，抗體可化學(xué)交聯(lián)到含有游離氨基、羧基或硫基團的底物上。在該方法中，含有游離抗體的水溶液與固態(tài)底物一起在戊二醛或碳化二亞胺的存在下孵育。
一個優(yōu)選的附著抗體或其他蛋白到固態(tài)底物的方法是用氨基或硫醇-硅烷功能化底物，然后用同雙功能交聯(lián)劑例如雙-橫基-琥珀酰亞胺基辛二酸酯(BS3)或異雙功能交聯(lián)劑例如GMBS，激活該功能化的底物。用GMBS交聯(lián)，玻璃底物的化學(xué)功能化是通過將玻璃底物浸入巰基丙基三甲氧基硅烷溶液(1％體積/體積在95％乙醇中pH5.5)1小時，在95％的乙醇中清洗，并在120℃加熱4小時而實現(xiàn)。硫醇處理的載玻片通過在室溫下，將其浸入0.5 mg/ml GMBS在1％二甲基甲酰胺中的溶液，99％乙醇中1小時而被激活?？贵w或蛋白被直接加入到激活的底物中，然后用含有化學(xué)物質(zhì)例如2％牛血清白蛋白的溶液阻斷，并風(fēng)干。其它常規(guī)的固定化學(xué)試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
固定在底物上的每種組份(分析物捕獲劑、輔助分子、和/或分析物)優(yōu)選被固定在固體支持物上不相同的預(yù)先指定的區(qū)域。每個不相同的預(yù)先指定的區(qū)域可相互之間物理分離。固體支持物的不同預(yù)先指定區(qū)域之間的距離可以是固定的，或者是可變的。例如，在矩陣中，每種組份可設(shè)計成相互之間具有固定的距離，而與珠子相連的組份不會存在固定的空間聯(lián)系。特別是多元固體支持物單元的應(yīng)用(例如多元珠)會產(chǎn)生可變的距離。
組份可以任何密度偶聯(lián)到或固定到固體支持物上。優(yōu)選地，組份以高于400種不同組份每立方厘米的密度被固定到固體支持物上。組份的矩陣可以含有任何數(shù)目的組份。例如，一個矩陣可以含有至少1,000種被固定在固體支持物上的不同組份，至少10,000種被固定在固體支持物上的不同組份，至少100,000種被固定在固體支持物上的不同組份，至少1,000,000種被固定在固體支持物上的不同組份。
L.DNA聚合酶用于RCA滾環(huán)復(fù)制步驟的DNA聚合酶必須能夠催化帶有引物的單鏈環(huán)的滾環(huán)復(fù)制。這種聚合酶在此指滾環(huán)DNA聚合酶。為了能夠滾環(huán)復(fù)制，優(yōu)選DNA聚合酶能夠使互補于模板鏈的鏈移位，即術(shù)語上的鏈移位，且缺乏5’到3’核酸外切酶的活性。鏈移位對于擴增靶環(huán)多串聯(lián)拷貝的合成必不可少。如果存在5’到3’核酸外切酶活性，則可能導(dǎo)致該合成鏈的水解。還優(yōu)選用于本發(fā)明方法的DNA聚合酶是高推進性的。適用于本方法的DNA聚合酶可以通過評價其催化滾環(huán)復(fù)制的能力而被簡易確定。優(yōu)選的滾環(huán)DNA聚合酶是噬菌體Φ29DNA聚合酶(Blanco等人，USP.5,198,543和5,001,050.)，噬菌體M2 DNA聚合酶(Matsumoto等人，Gene84247(1989))，噬菌體ΦPRD1 DNA聚合酶(Jung等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA848287(1987))，VENTR DNA聚合酶(Kong等人，J.Biol.Chem.2681965-1975(1993))，DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen等，Eur.J.Biochem.45623-627(1974))，T5DNA聚合酶(Chatterjee等，Gene9713-19(1991))，PRD1 DNA聚合酶(Zhu和Ito，Biochim.Biophys.Acta.1219267-276(1994))，修飾的T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson，J.Biol.Chem.26215330-15333(1987)；Tabor和Richardson，J.Biol.Chem.2646447-6458(1989)；測序酶TM(Sequenase)(U.S.Biochemicals))，以及T4 DNA聚合酶同工酶(Kaboord和Benkovic，Curr.Biol.5149-157(1995))。最優(yōu)選Φ29DNA聚合酶。
鏈移位可通過使用鏈移位因子推動，例如解螺旋酶。認為任何能夠在鏈移位因子存在下進行滾環(huán)復(fù)制的DNA聚合酶都適用于本發(fā)明的方法，即使該DNA聚合酶在缺乏這種因子時不能進行滾環(huán)復(fù)制。用于RCA的鏈移位因子包括BMRF1聚合酶輔助亞單位(Tsurumi等，J.Virology67(12)7648-7653(1993))，腺病毒DNA-結(jié)合蛋白(Zijderveld和van der Vliet，J.Virology68(2)1158-1164(1994))，單純皰疹病毒蛋白ICP8(Boehmer和Lehman，J.Virology67(2)711-715(1993)；Skaliter和Lehman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(22)10665-10669(1994))，單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB；Rigler和Romano，J.Biol.Chem.2708910-8919(1995))，以及小牛胸腺解螺旋酶(Siegel等，J.Biol.Chem.26713629-13635(1992))。
聚合酶催化滾環(huán)復(fù)制的能力可通過將該聚合酶應(yīng)用于滾環(huán)復(fù)制試驗而測定，如Fire和Xu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA924641-4645(1995)描述。
上述的材料可以任何適當(dāng)?shù)慕M合而包裝到一起，作為用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。例如，試劑盒可包括多元指示子結(jié)合引物和/或多元分析物捕獲劑在試劑盒中該分析物捕獲劑可與固體支持物相連。
方法本方法是RCA的一種形式，其中指示子結(jié)合引物提供了擴增靶環(huán)復(fù)制所用的滾環(huán)復(fù)制引物。本發(fā)明的方法基于指示子結(jié)合引物與分析物的偶聯(lián)，允許RCA產(chǎn)生擴增的信號(那就是說，串聯(lián)DNA序列(TS-DNA))。作為指示子結(jié)合引物的一部分的該特異性引物序列提供了指示子結(jié)合引物與分析物的特異性相互作用(通過指示子結(jié)合引物的親和部分)RCA的偶聯(lián)。為進行RCA，擴增靶環(huán)(ATC)被雜交到指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物序列，然后，通過RCA擴增ATC。獲得的TS-DNA在一端摻入了指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物序列，這樣就將TS-DNA錨定到分析物的位點。本方法可使用任何分析物實施。優(yōu)選的分析物是蛋白和多肽。
本方法尤其適于生成指定樣品中存在的分析物的圖譜。例如，可以評價細胞中各種蛋白是否存在及其數(shù)量，這樣就提供了直接的蛋白表達圖譜。這種分析，蛋白分析的一種形式，類似于核酸存在和表達的基因組分析。多元分析物分析，例如本發(fā)明的蛋白分析形式，優(yōu)選使用分析物捕獲劑的矩陣實施。通過將待評價的所有分析物特異性的分析物捕獲劑容納到該矩陣中，就可以在單一的方法中對全部的分析物進行檢定。本方法的這種形式還可對多種樣品中的同一套分析物進行簡易的對比。
在本方法的一個優(yōu)選實施例中，通過混合不同套的指示子結(jié)合引物和每種樣品，在同一個矩陣中檢定兩種(或更多)不同樣品中的分析物。每套指示子結(jié)合引物具有同一套特異性結(jié)合分子但是不同套的滾環(huán)復(fù)制引物。通過使不同的滾環(huán)復(fù)制引物對不同的擴增靶環(huán)具有特異性，特定的擴增靶環(huán)的擴增就可以指示在哪個樣品中存在相應(yīng)的分析物。
多元分析物的檢定可以基于其同一性，通過使用分析物捕獲劑來捕獲和/或分離分析物進行。例如，固定有分析物捕獲劑的矩陣可以用于將特定的分析物結(jié)合到該矩陣中預(yù)先指定區(qū)域。在該區(qū)域的分析物檢測就可以鑒定該分析物。分析物捕獲劑的一種有效形式是多肽。當(dāng)各種多肽被固定到矩陣中時，它們可用作分析物的“誘餌”。例如，不同多肽的矩陣可用于評價一個樣品中是否含有能與該任一多肽相互作用的分析物。不同樣品的對比可以通過例如，比較多肽的差別而實現(xiàn)，所述多肽與不同樣品中的分析物相連。本發(fā)明的另一實施例中，目的分析物特異性的分析物捕獲劑矩陣可用于評價樣品中是否含有整套分析物。
本發(fā)明方法的另一實施例中，輔助分子可用于影響分析物與特異性結(jié)合分子或分析物捕獲劑之間的相互作用。例如，本方法可用于篩選與特定結(jié)合分子或分析物捕獲劑相互作用的分析物的競爭物(或結(jié)合輔助因子)。如果輔助分子影響了分析物的相互作用，由于指示子結(jié)合引物與分析物(或分析物捕獲劑與分析物)的偶聯(lián)會丟失或增強，則RCA的結(jié)果將會改變。圖14說明了競爭分析物和分析物捕獲劑之間相互作用的實例。
用本發(fā)明的方法還可以檢測不同修飾的分析物形式。例如，可檢測蛋白的磷酸化和糖基化形式。這可通過例如使用指示子結(jié)合引物來實現(xiàn)，該引物具有分析物不同形式特異性的特異性結(jié)合分子。
另一方面，本發(fā)明涉及固定復(fù)雜生物樣品中存在的分析物并且測定和定量其在樣品中存在的情況。這個通過固定來鑒定和定量分析物的方法在這里使用含有過敏原的樣品描述。例如，存在于生物提取物和體液中的過敏原可如實施例8的描述，通過初次選擇性固定，將其固定在在微矩陣上，進行鑒定。然后，可進行免疫RCA微矩陣試驗來檢測和定量。
另一方面，本方法涉及對一個樣品中的不止一種分析物進行多元化的檢測和定量。這在實施例9中描述，其中含有幾種測試位點的微矩陣，每個測試位點含有一種固定的捕獲抗體，將該微矩陣與含有待測蛋白分析物的混合物的樣品共同孵育。然后，將該微矩陣與含有至少一種針對各分析物的抗體的混合物一起孵育，其中的抗體是生物素化的。然后就可以進行免疫RCA微矩陣試驗來鑒定和定量。
另一方面，免疫RCA微矩陣試驗可在16微孔玻璃載玻片上進行，其中每個孔之間都被特氟隆遮蔽膜分隔開。這在實施例8中說明，其中100-400點的微矩陣被點到每個微孔中。這些孔的每一個都被用于測試不同的樣品以及對照。多孔載玻片16孔的6個孔中還被點上抗IgE捕獲抗體的矩陣。在該多孔形式的過敏原微矩陣上的免疫RCA試驗可以通過例如低廉的Beckman BioMek液體處理機器人而半自動的進行。
基于微矩陣基礎(chǔ)上的免疫RCA實驗可應(yīng)用于其它多抗體試驗。例如，由特異性IgG4而不是IgE引起的某種免疫反應(yīng)(AAAI Board of Directors，J Allergy Clin Immunol.95652-654(1995))。與互補于DNA環(huán)的DNA引物相連的抗-人IgG4的應(yīng)用允許同時測定過敏原特異性的IgG4和IgE，其中的DNA環(huán)序列與互補于偶聯(lián)到抗-IgE的引物的DNA環(huán)不同。這種方法可用在過敏原去敏治療過程中或監(jiān)測對抗-IgE相互作用的治療中(Chang，Nature Biotech.18157-162(2000))。
本發(fā)明方法基本包括下述步驟(a)使一種或多種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸，并在能夠促進該特異性結(jié)合分子與分析物之間的反應(yīng)的條件下，孵育分析物樣品與指示子結(jié)合引物。每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子以及一個滾環(huán)復(fù)制引物，其中每種特異性結(jié)合分子與一種分析物直接或間接起相互作用。
(b)在步驟(a)之前，同時或之后，使指示子結(jié)合引物與一種或多種擴增靶環(huán)接觸，并在能夠促進擴增的靶環(huán)與滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育該指示子結(jié)合引物與擴增靶環(huán)。每個擴增靶環(huán)包含一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子包含一個引物互補部分。該引物互補部分與至少一個滾環(huán)復(fù)制引物互補。
(c)在步驟(b)之后，并在步驟(a)之前，同時或其后，在能夠促進擴增靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育指示子結(jié)合引物與擴增靶環(huán)。擴增靶環(huán)的復(fù)制引起串聯(lián)DNA序列的形成，對串聯(lián)DNA序列的檢測代表相應(yīng)分析物的存在。優(yōu)選地，該分析物是在步驟(a)，(b)或(c)之前，同時或之后從分析物樣品中分離出來的。
本方法還包括使至少一種分析物樣品與一種或多種分析物捕獲劑接觸，從分析物樣品中分離出分析物捕獲劑，這樣，就從分析物樣品中分離出分析物。每種分析物捕獲劑與一種分析物直接或間接相互作用，并且至少有一種分析物，如果其存在于樣品中，與至少一種分析物捕獲劑相互作用。該方法還包括使至少一種分析物樣品和至少一種指示子結(jié)合引物與至少一種輔助分子相接觸。該輔助分子能夠影響至少一種分析物和至少一種特異性結(jié)合分子或至少一種分析物捕獲劑之間的相互作用。
本方法還可包括在步驟(a)之后并在使分析物樣品與固體支持物接觸之前，混合一種或多種初級分析物樣品與一種或多種次級分析物樣品。該方法的這種形式中，分析物樣品包括一種或多種初級分析物樣品和一種或多種次級分析物樣品，指示子結(jié)合引物包括一種或多種初級指示子結(jié)合引物和一種或多種次級指示子結(jié)合引物。每種初級指示子結(jié)合引物都有匹配的次級指示子結(jié)合引物，并且與初級指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子相互作用的分析物和與匹配的次級指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子相互作用的分析物相同。同樣，每種不同的指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物也不相同，每種不同的滾環(huán)復(fù)制引物引導(dǎo)不同的擴增靶環(huán)復(fù)制，每種不同的擴增靶環(huán)產(chǎn)生不同的串聯(lián)DNA序列。不同分析物樣品中有或沒有相同分析物的存在，由有或沒有相應(yīng)的DNA串聯(lián)序列來指示。
本方法的另一形式包括，在步驟(a)之前，同時或之后，使一種或多種初級分析物捕獲劑與一種或多種初級分析物樣品接觸，使一種或多種次級分析物捕獲劑與一種或多種次級分析物樣品相接觸，每種初級分析物捕獲劑都包含一個分析物相互作用的部分和捕獲部分，每種初級分析物捕獲劑都有一個匹配的次級分析物捕獲劑。與初級分析物捕獲劑的分析物的相互作用部分相互作用的分析物和與匹配的次級分析物捕獲劑的分析物的相互作用部分相互作用的分析物相同。初級和次級分析物捕獲劑的捕獲部分都與一種或多種指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子起相互作用，與初級分析物捕獲劑的捕獲部分相互作用的特異性結(jié)合分子不同于與相匹配的次級分析物捕獲劑的捕獲部分相互作用的特異性結(jié)合分子。每種不同的特異性結(jié)合分子是指示子結(jié)合引物的不同部分。每種不同的指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物是不相同的，每種不同的滾環(huán)復(fù)制引物引導(dǎo)不同的擴增靶環(huán)復(fù)制，而每種不同的擴增靶環(huán)產(chǎn)生不同的DNA串聯(lián)序列。在不同的分析物樣品中有或沒有分析物的存在由有或沒有相應(yīng)的DNA串聯(lián)序列的存在指示。
本方法還可這樣進行當(dāng)至少一種分析物是另一種分析物的修飾形式時，至少一種指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子直接或間接地與分析物相互作用，該分析物是其它分析物的修飾形式，并且另一指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子直接或間接地與其它分析物相互作用。
本方法的另一實施例基本上包括下述步驟(a)使一種或多種分析物樣品與一種或多種分析物捕獲劑接觸，并在能夠促進分析物捕獲劑和分析物相互作用的條件下，孵育該分析物樣品和分析物捕獲劑。每種分析物捕獲劑直接或間接地與一種分析物相互作用，并且至少有一種分析物，如果其存在于分析物樣品中，會與至少一種分析物捕獲劑相互作用。
(b)在步驟(a)之前，同時或之后，使至少一種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸，并在能夠促進特異性結(jié)合分子與分析物捕獲劑相互作用的條件下，孵育該分析物樣品與指示子結(jié)合引物。每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子和一個滾環(huán)復(fù)制引物，每種特異性結(jié)合分子與一種分析物捕獲劑直接或間接地相互作用。
(c)在步驟(a)或(b)之前，同時或之后，使指示子結(jié)合引物和一種或多種擴增靶環(huán)接觸，并在能夠促進擴增靶環(huán)和滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育該指示子結(jié)合引物和擴增靶環(huán)。這些擴增靶環(huán)的每一個都含有一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子含有一個引物互補部分，并且該引物互補部分互補于至少一種滾環(huán)復(fù)制引物。
(d)在步驟(c)之后并且在步驟(a)或(b)之前，同時或之后，在能夠促進擴增靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育指示子結(jié)合引物和擴增靶環(huán)。擴增靶環(huán)的復(fù)制引起DNA串聯(lián)序列的生成，并且串聯(lián)DNA序列的檢出指示相應(yīng)分析物的存在。
本方法的另一實施例基本上包括下述步驟
(a)處理一種或多種分析物樣品，使一種或多種分析物被修飾。
(b)使至少一種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸，并在能夠促進特異性結(jié)合分子與被修飾的分析物之間相互作用的條件下，孵育該分析物樣品與指示子結(jié)合引物。每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子和一個滾環(huán)復(fù)制引物，每個特異性結(jié)合分子直接或間接地與修飾的分析物相互作用。
(c)在步驟(a)或(b)之前，同時或之后，使指示子結(jié)合引物和一種或多種擴增靶環(huán)接觸，并在能夠促進擴增靶環(huán)和滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育該指示子結(jié)合引物和擴增靶環(huán)。這些擴增靶環(huán)的每一個都含有一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子含有一個引物互補部分，并且該引物互補部分互補于至少一種滾環(huán)復(fù)制引物。
(d)在步驟(c)之后并且在步驟(a)或(b)之前，同時或之后，在能夠促進擴增靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育指示子結(jié)合引物和擴增靶環(huán)。擴增靶環(huán)的復(fù)制引起DNA串聯(lián)序列的生成，串聯(lián)DNA序列的檢出就指示相應(yīng)分析物的存在。
本方法的另一形式基本上包括下述步驟(a)使一種或多種分析物樣品與一種或多種矩陣接觸。每種矩陣包含一套分析物捕獲劑，一套輔助分子，或其二者，并且每種分析物捕獲劑直接或間接地與一種分析物相互作用。
(b)在步驟(a)之前，同時或之后，使至少一種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸。每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子和一個滾環(huán)復(fù)制引物，每種特異性結(jié)合分子與一種分析物直接或間接地相互作用，每種輔助分子能夠影響至少一種分析物與至少一種特異性結(jié)合分子或至少一種分析物捕獲劑之間的相互作用。
(c)在步驟(a)和/或(b)，同時或之后，在能夠促進特異性結(jié)合分子，分析物，分析物捕獲劑和輔助分子之間相互作用的條件下，孵育分析物樣品，矩陣和指示子結(jié)合引物。
(d)在步驟(b)之前，同時或之后，使指示子結(jié)合引物和一種或多種擴增靶環(huán)接觸，并在能夠促進擴增靶環(huán)與滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育指示子結(jié)合引物和擴增靶環(huán)。這些擴增靶環(huán)的每一個都含有一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子含有一個引物互補部分，并且該引物互補部分互補于至少一種滾環(huán)復(fù)制引物。
(e)在步驟(d)之后并且在步驟(a)，(b)或(c)之前，同時或之后，在能夠促進擴增靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育指示子結(jié)合引物和擴增靶環(huán)。擴增靶環(huán)的復(fù)制引起串聯(lián)DNA序列的生成，串聯(lián)DNA序列的檢出指示相應(yīng)分析物的存在。
擴增靶環(huán)作為滾環(huán)復(fù)制的底物。這種反應(yīng)需要加入兩種反應(yīng)物(a)滾環(huán)復(fù)制引物，其互補于ATC的引物互補部分，和(b)滾環(huán)DNA聚合酶。該DNA聚合酶催化在滾環(huán)聚合反應(yīng)過程中引物延伸以及鏈移位，該反應(yīng)時間可按需要控制，該反應(yīng)能產(chǎn)生多達100,000個核苷酸或更大的分子，含有多達約1000個串聯(lián)的序列拷貝，該序列互補于擴增靶環(huán)。優(yōu)選的滾環(huán)DNA聚合酶是噬菌體Φ29的DNA聚合酶。
RCA的許多不同形式可以用于本方法，其中大多數(shù)都在USP.5,854,033和WO97/19193中描述。例如，線性滾環(huán)擴增(LRCA)涉及擴增靶環(huán)的基礎(chǔ)滾環(huán)復(fù)制來形成TS-DNA鏈。指數(shù)的滾環(huán)擴增(ERCA)涉及通過鏈移位復(fù)制進行TS-DNA的復(fù)制，該鏈移位復(fù)制起始于TS-DNA的大量重復(fù)序列。在TS-DNA的兩個鏈上進行的多元引導(dǎo)導(dǎo)致擴增靶環(huán)中的序列指數(shù)擴增，如果需要，如WO97/19193的描述，可將TS-DNA降解成緊密型結(jié)構(gòu)用于檢測。
在滾環(huán)復(fù)制過程中，還可額外包括放射性或修飾的核苷酸，例如溴代脫氧尿苷三磷酸，來標記反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA。或者，可以包括合適的前體，該前體能夠提供結(jié)合基團，例如生物素化核苷酸(Langer等(1981))。
可使用本方法分析和檢測的蛋白的例子包括IL-1α，IL-1β，IL-1RA，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-6R，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，GROα，MIP-lα，MIP-1β，MCP，RANTES，MIF，G-CSF，GM-CSF，M-CSF，EGF，酸性FGF，堿性FGF，IGF-1，IGF-2，IFN-γ，TGF-β，TNF-α，TNF-β，TNF-RI，TNF-RII，ICAM-1，ICAM-2，IL-2Ra，IL-4R，IL-5，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IP-10，F(xiàn)GF-4，F(xiàn)GF-6，MCP-2，和MCP-3。
1. 擴增產(chǎn)物的檢測目前的檢測技術(shù)產(chǎn)生RCA的二次循環(huán)，而在許多情況下，這是不必要的。這樣，可以直接檢測RCA的初次循環(huán)產(chǎn)物。如下所述，檢測可以通過初級標記或次級標記來實現(xiàn)。
(a)初級標記初級標記由在RCA中滾環(huán)復(fù)制過程中摻入的標記基團構(gòu)成，例如，熒光核苷酸生物素化核苷酸，含地高辛核苷酸，或溴代脫氧尿苷。例如，可以4個類似物對每100個核苷酸的頻率摻入花青染料UTP類似物(Yu等，(1994))。檢測在原位擴增的核酸的優(yōu)選方法是在擴增過程中用BrdUrd標記DNA，然后使生物素化的抗-BUDR抗體與摻入的BUDR結(jié)合(Zymed Labs，San Francisco，CA)，然后使親和素過氧化酶(Life Sciences，Inc.)與生物素基團結(jié)合，并且最后用熒光-酪胺(DuPont de Nemours & Co.，Medical Products Dept.)產(chǎn)生熒光。
(b)用檢測探針進行次級標記次級標記是使用合適的分子探針進行，即指檢測探針，來檢測擴增DNA或RNA。例如，擴增靶環(huán)可被設(shè)計成含有幾個重復(fù)的已知人工序列，即指檢測標記。次級雜交步驟可用于結(jié)合檢測探針和檢測標記。這些檢測探針可按上述，用例如酶，熒光基團或放射性同位素標記。通過對每個擴增靶環(huán)使用三個檢測標記，對每個檢測探針使用四個熒光信號，可以從每個TS-DNA中重復(fù)的擴增靶環(huán)得到多達12個熒光信號，對于每個從RCA中擴增的擴增靶環(huán)產(chǎn)生至多12,000個熒光基團。
(c)多元化和雜交矩陣檢測使用多套不同的擴增靶環(huán)可以簡易的進行多元化RCA，每套都含有不同的靶探針序列，該序列是為結(jié)合獨特靶目標而設(shè)計。應(yīng)注意到，盡管為每個靶目標設(shè)計的靶探針序列不相同，但引物互補部分仍可維持不變，這樣滾環(huán)復(fù)制的引物對所有靶目標都是相同的。RCA產(chǎn)生的TS-DNA分子具有高分子量且低復(fù)雜性；擴增靶環(huán)的長度就是其復(fù)雜性。有兩種方法可將指定的TS-DNA捕獲到固體支持物上的固定位點。一種是在擴增靶環(huán)的間隔區(qū)域包含一個獨特的地址標記序列，該序列是針對每個特別的擴增靶環(huán)。然后指定擴增靶環(huán)產(chǎn)生的TS-DNA就含有相應(yīng)于特定地址標記序列的序列。第二種，也是優(yōu)選的方法是使用TS-DNA上的靶序列作為地址標記。
(d)組合的多色編碼(Combinatorial Multicolor Coding)多元檢測的一個優(yōu)選形式涉及應(yīng)用各種標記的組合，這些標記或者是在不同波長下產(chǎn)生熒光，或者是不同顏色。使用熒光檢測雜交探針的一個益處是可以同時目測到一個相同樣品中的幾種靶物質(zhì)。使用組合的策略，比用光譜分辨熒光所區(qū)分的靶物質(zhì)數(shù)目多很多。組合標記提供最簡單的方法以多元化方式標記探針，由于探針熒光或者是完全不存在的(-)，或者是以單位數(shù)量存在的(+)；這樣，圖像分析更利于自動化控制處理，許多實驗假象，例如熒光的差異光漂白以及光譜發(fā)射源功率的改變等，都是可以避免的。
標記的組合建立了用于鑒定不同檢測探針的編碼體系，繼而，可用于檢測與這些檢測探針相連的不同分析物。這個標記體系是指組合多色編碼(CMC)。這種編碼體系由Speicher等人描述，Nature Genetics12368-375(1996)。如果組合的標記可以被分別檢測，那么任何數(shù)目的標記的任何數(shù)都可用于組合多色編碼體系。優(yōu)選組合使用2，3，4，5，或6個標記。最優(yōu)選使用6個標記。所用標記的數(shù)目決定了唯一的標記組合的數(shù)目，可根據(jù)公式2N-1推算這個數(shù)目，其中N是標記的數(shù)目。根據(jù)這個公式，2個標記可形成3種標記組合，3個標記可形成7種標記組合，4個標記可形成15種標記組合，5個標記形成3 1種標記組合，6個標記可形成63種標記組合。
Speicher等人描述了一組熒光物質(zhì)和相應(yīng)的在光譜350-770nm區(qū)間間隔的濾光片，其能夠高靈敏度的區(qū)分所有可能的熒光對。這組熒光物質(zhì)，其優(yōu)選用于組合多色編碼體系，由4’-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，熒光素(FITC)，和花青染料Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5 and Cy7構(gòu)成。如果需要更少組合的話，可以應(yīng)用任何該組熒光物質(zhì)的亞組。這些熒光物質(zhì)的吸收和發(fā)射最大值分別是DAPI(350nm；456nm)，F(xiàn)ITC(490nm；520nm)，Cy3(554nm；568nm)，Cy3.5(581nm；588nm)，Cy5(652nm；672nm)，Cy5.5(682nm；703nm)以及Cy7(755nm；778nm)。這些熒光物質(zhì)的激發(fā)和發(fā)射光譜，消光系數(shù)以及量子產(chǎn)量由Ernst等，Cytometry 103-10(1989)，Mujumdar等，Cytometry1011-19(1989)，Yu，Nucleic Acids Res.223226-3232(1994)，和Waggoner，Meth.Enzymology246362-373(1995)描述。這些熒光物質(zhì)可用75W氙弧激發(fā)。
2.進一步擴增次級DNA鏈移位是擴增TS-DNA的另一種方法。次級DNA鏈移位通過使次級DNA鏈移位引物與TS-DNA雜交，并且允許DNA聚合酶從這些引導(dǎo)的位點合成DNA來實現(xiàn)。該次級DNA鏈移位產(chǎn)物指次級DNA或者TS-DNA-2串聯(lián)序列。次級DNA鏈移位和串聯(lián)擴增在USP5,854,033and WO97/19193中描述。
實施例實施例1該實施例說明了抗體DNA偶聯(lián)物的構(gòu)建及其特征，該偶聯(lián)物用作指示子結(jié)合引物(Reporter Binding Primers)寡核苷酸。所有使用的寡核苷酸都由Perseptive生物體系快速DNS合成儀合成并通過反相HPLC純化。環(huán)狀DNA如前所述(4)構(gòu)建。偶聯(lián)物滾環(huán)復(fù)制引物5’-巰基-GTA CCA TCA TAT ATG TCC GTG CTA GAA GGA AACAGT TAC A-3’；擴增靶環(huán)DNA5’-TAG CAC GGA CAT ATA TGA TGG TAC CGCAGT ATG AGT ATC TCC TAT CAC TAC TAA GTG GAA GAA ATG TAA CTG TTTCCT TC-3’；檢測探針-5’Cy3 TAT ATG ATG GTA CCG CAG Cy3 3’，5’Cy3TGA GTA TCT CCT ATG ACT Cy33’，5’Cy3 TAA GTG GAA GAA ATG TAA Cy33。
抗體-DNA偶聯(lián)物。通過PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)層析，抗體被緩沖交換到50mM磷酸鈉pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA的緩沖液中。脫鹽的抗體(41納摩爾(nmoles))用10倍摩爾過量的硫代-GMBS(Pierce)在氮氣下黑暗中，37℃處理30分鐘(min)，然后在室溫處理30min。過PD-10柱，層析去除未反應(yīng)的硫代-GMBS，該柱用pH 7.5的磷酸鈉，150mM NaCl平衡。然后在4℃在Centricon YM-30中濃縮抗體。每個抗體上馬來酰亞胺的數(shù)目這樣測定應(yīng)用Ellman試劑(Pierce)測量巰基，然后通過激活抗體來滴定β-巰基乙醇。28.1nmoles硫代-GMBS激活抗體，142nmoles5硫醇寡核苷酸在825微升體積內(nèi)在室溫下，偶聯(lián)2小時，然后4℃過夜。偶聯(lián)到寡核苷酸的抗體在Q-Sepharose(AmershamPharmacia Biotech)上，使用鹽梯度，通過陰離子交換層析，進行純化(圖2)。收集含有偶聯(lián)物的洗脫部分并在4℃，在Superdex200(Pharmacia)上進行大小排阻層析去除游離的寡核苷酸(圖3)。
實施競爭性ELISA試驗，評價該偶聯(lián)物結(jié)合同源抗原的能力。在這些試驗中，平行測定匹配的未偶聯(lián)和DNA-結(jié)合的抗體與指示子抗體競爭結(jié)合抗原的能力。大致為用2微克/ml在0.1M Na2CO3中的捕獲抗體(BiosPacific山羊多克隆抗-IgE)覆蓋多孔板(Nunc Maxisorp)，37℃過夜。用背景阻斷溶液(在TBS中的5％脫脂奶粉/0.05％ NaN3)替換該抗體溶液，并在37℃孵育1小時。用TBS/0.05％ Tween20清洗4遍去除阻斷劑，并加入500ng/ml在TBS中的(從Fitzgerald多發(fā)性骨髓瘤細胞中)純化的人IgE，37℃孵育30分鐘。用TBS/0.05％ Tween20清洗4遍去除IgE，然后加入預(yù)先制備的抗IgE混合物，該混合物由競爭劑(未偶聯(lián)的抗-IgE或DNA-抗-IgE偶聯(lián)物)和指示子(生物素化的抗-IgE，PharMingen)構(gòu)成。控制該生物素化的抗-IgE在一個固定水平，而競爭劑抗IgF則以各種水平存在。該抗-IgE混合物在孔內(nèi)37℃孵育30分鐘。接下來，用TBS/0.05％Tween20清洗3遍，通過與NeutrAvidin-堿性磷酸酶(Pierce Chemical Co.)37℃孵育30分鐘，來檢測存留的生物素化的抗-IgE。然后用TBS/0.05％Tween 20清洗3遍孔并與堿性磷酸酶底物(對磷酸硝基苯試劑盒，PierceChemical Co.)孵育。使其進行顏色反應(yīng)15分鐘，在BioMek FL600平板閱讀儀(plate reader)上，讀取405nm下的吸收值。結(jié)合的抗體，每個偶聯(lián)約3個寡核苷酸每分子蛋白，并顯示出與未結(jié)合的形式抗原近似的抗體親抗原性(圖4)。
實施RCA反應(yīng)評價偶聯(lián)物作為引物起作用的能力。RCA反應(yīng)含有5nM引物或引物-偶聯(lián)的抗體，10nM環(huán)，200ng大腸桿菌SSB(Promega)，0.125單位T7聚合酶(USB)，dATP，dTTP，dGTP各0.4mM，0.4mM[α-32P]TTP(300-600cpm/pmol)在25μl緩沖液中(pH7.9)，該緩沖液含有20mM Tris-醋酸，10mM醋酸鎂，50mM醋酸鉀，和1mM DTT。添加在冰上進行，然后轉(zhuǎn)到37℃。通過點到DE81過濾器來定量指定時間內(nèi)的RCA產(chǎn)物。在互補環(huán)狀DNA存在下，抗體-引物偶聯(lián)體比等摩爾量的未偶聯(lián)引物產(chǎn)生更多的RCA反應(yīng)產(chǎn)物(圖5)，與觀察到的每個抗體被偶聯(lián)到不止一個引物相一致。在缺乏互補環(huán)狀DNA存在或僅存在非互補環(huán)的情況下，沒有任何一種形式的引物能夠產(chǎn)生可測量的產(chǎn)物。
實施例2該實施例說明了應(yīng)用指示子抗體引物/抗體-DNA偶聯(lián)物在ELISA試驗中檢測分析物。相較于使用常規(guī)抗體-酶偶聯(lián)物，免疫RCA檢測顯示出高靈敏度和良好動力學(xué)范圍。
ELISA試驗。在37℃，用山羊多克隆抗-人IgE以100μl 2mg/ml每孔的量覆蓋96孔板2小時，然后4℃過夜。用100μl TBS/0.05％ Tween20清洗3遍板，然后用5％脫脂奶粉在37℃阻斷2小時。再用TBS/0.05％ Tween20清洗板，然后以在100μl體積內(nèi)的各種濃度加入IgE分析物。37℃孵育30min后，用100μl TBS/0.05％ Tween20清洗板3次。在常規(guī)的ELISA試驗中，抗-人IgE-堿性磷酸酶偶聯(lián)物被加入到每孔中，并在37℃孵育30min。在用TBS/0.05％Tween20清洗板后，加入堿性磷酸酶底物MUP，并在20分鐘后，在BioMek FL600板式閱讀儀上，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長460nm，閱讀熒光水平。在該免疫RCA方法中，抗-人IgE-DNA結(jié)合體(5ng/μl)以60μl體積被加入到每個孔中，并37℃孵育30min。用100μlTBS/0.05％Tween20清洗板3次后，在60μlΦ29緩沖液(250mM Tris-HCl，pH7.5，50mM MgCl2，1mg/ml BSA，1mM dATP，dCTP，dGTP，0.75mM dTTP，0.25mM FITC-12-dUTP)中的環(huán)2DNA(170nM)被加入到每孔中，并在37℃孵育30min。通過加入1.5μl Φ29DNA聚合酶(0.4U/μl)起始RCA反應(yīng)，在37℃持續(xù)30min。加入抗FITC-堿性磷酸酶偶聯(lián)物檢測RCA產(chǎn)物。在37℃孵育30min后，用100μl TBS/0.05％ Tween20清洗板3次，加入MUP底物，20min后閱讀熒光水平。如圖6所示，該免疫RCA試驗比常規(guī)試驗在更大范圍內(nèi)給出劑量反應(yīng)。例外，在免疫RCA試驗中，即使在其較小的擴增線性模式，仍可檢測到比那些通過常規(guī)ELISA試驗檢測到的IgE水平低2個數(shù)量級的IgE水平。
實施例3該實施例說明了應(yīng)用指示子抗體引物/抗體-DNA偶聯(lián)物檢測微粒形式的分析物。仍選擇人IgE作為測試分析物，但是這個夾心試驗使用抗生物素蛋白包被的磁化微粒和生物素化多克隆抗-人IgE捕獲抗體進行。大致上，用在TBS中的16μg/ml生物素化的多克隆抗-人IgE(Pharmingen)溶液覆蓋抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的磁化珠(Bangs Laboratories)，用TBS/0.05％ Tween20清洗3次，用2mg/ml BSA阻斷過夜。在TBS中，室溫下，該珠與人IgE(25ng/ml)共同孵育20min，并用TBS/0.05％ Tween20清洗3次。使用常規(guī)抗-IgE-DNA偶聯(lián)物或免疫RCA偶聯(lián)物的IgE檢測按以上對ELISA試驗的描述進行實施。在圖7中，可以看出，在有中等濃度的IgE偶聯(lián)到微粒的情況下，用抗-IgE-DNA偶聯(lián)物的免疫RCA可以給出很強信號。當(dāng)投入相同數(shù)量IgE(25ng IgE/ml)時，用抗-IgE-堿性磷酸酶偶聯(lián)物的檢測給出的信號比免疫RCA試驗的信號大約低75倍。
實施例4該實施例說明使用前列腺特異性抗原(PSA)作為模型體系的檢測，免疫RCA應(yīng)用于在微點上固相檢測的適用性。為完成該目的，免疫RCA被設(shè)計成間接夾心試驗形式。用小鼠單克隆抗-PSA抗體構(gòu)成該免疫夾心復(fù)合物的二級部分。該復(fù)合物用多克隆兔抗-小鼠IgG抗體檢測，該抗體與含有引導(dǎo)RCA反應(yīng)的序列的寡核苷酸相連。
制備微點。將潔凈的玻璃載玻片浸入巰基丙基三甲氧基硅烷(1％體積/體積在95％乙醇中pH5.5)1小時以獲得化學(xué)功能。載玻片在95％乙醇中清洗2min，氮氣下干燥，然后在120℃加熱4小時使其固化。硫醇處理的載玻片通過在室溫下浸入在1％二甲基甲酰胺，99％乙醇中的0.5mg/ml異雙功能交聯(lián)硫代GMBS(Pierce)中1小時而被激活。用乙醇清洗載玻片，在氮氣下干燥，并儲存在干燥器內(nèi)待用。山羊抗-PSA多克隆抗體(BioSpacifics)在載玻片上的點陣是用吸量管將0.2μl的0.5mg/ml溶液點成柵格形式。手工點制的矩陣用2％BSA(不含蛋白酶)阻斷，干燥，在4℃下氮氣存在下保存，待用。在即將使用前，室溫下，將矩陣在50ml PBS中再水化2min。
抗原捕獲。純化的人PSA(BioSpacifics)在PBS中稀釋到期望濃度。10μl PSA被點到蓋玻片(Hybrislip，Grace)上，然后將該載玻片翻轉(zhuǎn)覆蓋到載玻片上矩陣的區(qū)域。在濕潤容器內(nèi)，在37℃孵育載玻片30min，在PBS/0.05％ Tween20中2分鐘清洗2遍，將水控凈干燥。將10μl 1∶5,000倍在PBS中稀釋的單克隆抗-PSA抗體液加入到該矩陣。在濕潤容器內(nèi)，在37℃孵育載玻片30min，在PBS/0.05％ Tween20中清洗2分鐘，清洗2遍，將水控凈干燥。最后，兔抗-小鼠IgG-DNA聯(lián)偶聯(lián)物(10ng/μl在PBS中)被加入到該矩陣中。在濕潤容器內(nèi)，在37℃孵育載玻片30min，在PBS/0.05％ Tween 20中清洗2分鐘，清洗2遍，將水控凈干燥。
RCA反應(yīng)。在10μl Φ29緩沖液(250mM Tris-HCl，pH7.5，50mMMgCl2，和1mg/ml BSA)中的環(huán)狀DNA1(200nM)被加入到該矩陣中，在45℃孵育30min。10μl RCA反應(yīng)混合物(2mM dATP，dCTP，dGTP，1.5mM dTTP，0.5mM生物素-16-dUTP dNTPs，Φ29緩沖液，0.4U/μl Φ29聚合酶)被加入到該矩陣并在37℃孵育30min。37℃，將載玻片在2X SSC/0.05％Tween20中清洗2遍，2分鐘，室溫下在2X SSC/0.05％ Tween20中清洗2遍，2分鐘，將水控凈干燥。然后將在2X SSC，0.05％ Tween20中的10微升檢測子低聚混合物加入該矩陣并在37℃孵育30min。在2X SSC，0.1％Tween20中清洗清洗4次1分鐘。向矩陣中加入10μl CACHET溶液(1mg/mlNeutravidin，2X SSC，0.1％ Tween20，0.5mg/ml BSA，0.5mg/ml超聲波處理的鯡魚精子DNA)并在37℃孵育15min。室溫下在2X SSC，0.05％Tween20中振蕩清洗載玻片5min，然后在2X SSC中清洗一遍。在氮氣下干燥載玻片，并且載玻片上矩陣的位置用延長抗衰減溶液(ProlongAntifade)(分子探針)覆蓋。在裝配有CCD成像系統(tǒng)和100X物鏡的Zeiss落射熒光顯微鏡上進行熒光成像。使用IP實驗室軟件進行熒光定量。裝配有CCD鏡頭的顯微鏡顯示的熒光定量指示在至少PSA濃度的2個對數(shù)以上，信號是線性的(圖8)，并且即使像0.1pg/ml PSA(300zeptomoles)這么低的量都可以檢測出來。這個檢測水平比常規(guī)PSA免疫試驗的靈敏度約高3個數(shù)量級。本實施例中用作偶聯(lián)物的抗體是兔抗-小鼠IgG多克隆抗體；該反應(yīng)物可作為“萬能”偶聯(lián)物來高靈敏度地檢測任何小鼠單克隆抗體。
實施例5本實施例說明在多克隆山羊抗-人IgE抗體的微矩陣上進行的夾心形式免疫RCA，這些抗體是使用針-工具形式微矩陣自動機械點在玻璃載玻片上。在這些微矩陣中，每個點上大約有0.5nl抗體溶液，這些點的直徑大約為200μm，并且點與點之間的距離是250μm。該抗-IgE微矩陣與人IgE一起孵育，與生物素化的抗人IgE抗體以及與抗-生物素單克隆抗體相連的抗原被檢測出來，該抗-生物素單克隆抗體已經(jīng)與含有RCA引物序列的寡核苷酸相連。
微矩陣的制備。用硫醇硅烷功能化的玻璃載玻片如上述制備。硫醇處理的載玻片通過在室溫下浸入在1％二甲基甲酰胺，99％乙醇中的0.5mg/ml硫代GMBS(Pierce)中1小時而被激活。用乙醇清洗載玻片，在氮氣下干燥，并儲存在干燥器內(nèi)待用。多克隆山羊抗-人IgE溶液(BioSpacifics 0.5mg/ml)使用針-工具型微矩陣儀(GeneMachines)點到載玻片上。用2％BSA(不含蛋白酶)阻斷矩陣，干燥，在4℃下氮氣存在下保存，待用。
抗原捕獲。通過加入50μl體積在50mM甘氨酸(pH9.0)中的2mg/mlBSA溶液來阻斷每個微矩陣，并在濕潤容器內(nèi)，37℃孵育1小時。阻斷后，清洗載玻片2次，通過將載玻片浸入含有1x PBS/0.05％ Tween20的科普林缸并清洗載玻片2分鐘然后用1x PBS清洗1分鐘。立即向每個微矩陣加入10μl體積人血清，并在濕潤容器內(nèi)，37℃孵育30min。然后如上述用PBS/Tween20和PBS清洗。
免疫RCA。使用BiotinTag Micro Biotinylation Kit(Sigma)標記山羊抗-人IgE(BiosPacific，Inc.)。2.5ng/μl在PBS，0.05％ Tween20，1mM EDTA中的該抗體10μl被應(yīng)用于每個矩陣并在濕潤容器內(nèi)，37℃孵育30min。在PBS，0.05％ Tween20中清洗蓋玻片2分鐘，清洗2次。與引物1相連的小鼠單克隆抗-生物素抗體用50nM環(huán)1在PBS，0.05％ Tween20，1mM EDTA中，37℃退火30分鐘。10μl被應(yīng)用于每個矩陣并在濕潤容器內(nèi)37℃孵育30分鐘，然后該載玻片被清洗兩次。將20 l含有T7天然DNA聚合酶(0.01單位/μl)，1mM dNTPs，0.04mg/ml of SSB，20mM TrisHCl(pH7.4)，10mM MgCl2和25mM NaCl的反應(yīng)溶液加入每個微矩陣。該載玻片在37℃孵育45min，然后通過在室溫下在2X SSC/0.05％ Tween20中清洗該載玻片而停止反應(yīng)。20μl 0.5M DNA修飾劑被加入到每個矩陣并在37℃使其與RCA產(chǎn)物雜交30min。在室溫下，在2X SSC中清洗載玻片并甩干。在General Scanning Luminomics 5000微矩陣掃描儀上掃描載玻片，使用QuantArray軟件定量熒光。
結(jié)果(圖9)顯示，免疫RCA具有高靈敏度(低至1pg/ml)，廣泛動力學(xué)范圍(5對數(shù))并且點對點的再現(xiàn)性極好。最近，有基于微矩陣基礎(chǔ)的免疫試驗的報道，該試驗使用堿性磷酸酶偶聯(lián)物和熒光底物ELF進行檢測(Mendoza等，Biotechniques 27778-788(1999))。ELF基礎(chǔ)上的試驗需要特殊構(gòu)建的基于CCD的鏡頭來閱讀信號，且獲得約為10ng/ml的靈敏度。在另一項報道中，用近紅外染料標記的抗體用于在微矩陣中檢測IgG亞類(Silzel等，Clin.Chem.442036-2043(1998))；該系統(tǒng)也需要特殊設(shè)計的成像系統(tǒng)，檢測限度約為15ng/ml。相反，免疫擴增的信號擴增產(chǎn)生的靈敏度在pg/ml范圍內(nèi)并且可用尋常可獲得的微矩陣掃描儀閱讀試驗結(jié)果。免疫RCA還可用于在微矩陣中檢測各種過敏原特異性的IgE，其具有極好的臨床靈敏度和特異性。為此用作偶聯(lián)物的抗體是單克隆抗-生物素抗體。該反應(yīng)物還可用于檢測任何生物素化的多克隆或單克隆抗體，以及任何其它蛋白，核酸或能夠被生物素化的小分子。
實施例6該實施例說明以本發(fā)明方法的單-分子-計數(shù)模式同時檢測兩種蛋白。
捕獲載玻片的制備。用4-氨基丁基二甲基甲氧基硅烷覆蓋載玻片，并用1，4一亞苯基-二異硫氰酸酯處理?？股锼氐鞍撞东@試劑、寡核苷酸5’-NH2-GG18G-生物素-3’、以及抗-地高辛IgG捕獲試劑、地高辛-琥珀酰-ε-氨基己酸氫化物的混合物，其中每種物質(zhì)的濃度為5μM，該混合物以矩陣的形式被點到激活的載玻片表面(8-10點/矩陣)。繼續(xù)進行化學(xué)偶聯(lián)2小時。該載玻片在pH9.5的0.5mM甘氨酸中清洗2次，然后，在37℃置于甘氨酸溶液中30min，來阻斷未反應(yīng)的功能基團。該載玻片繼續(xù)在37℃，在50mM甘氨酸(ph9.5)，0.15M NaCl，3％牛血清白蛋白，0.1％超聲波處理的鯡魚精子DNA，0.2％ NaN3中孵育1小時，然后在室溫下，在PBS，0.1％ Tween20中清洗3min。然后干燥該載玻片并儲存在4℃待用。
抗原與載玻片相連。各種濃度的抗生物素蛋白和綿羊抗地高辛IgG，或者單獨的，或者按一定摩爾比率，摻入到正常人血清中。被摻入的血清應(yīng)(1.0μl)用于捕獲矩陣，然后載玻片在保濕室中，在37℃孵育30min。然后在PBS/Tween20中清洗并風(fēng)干。5μl的7.5nM兔抗-抗生物素蛋白-引物-1偶聯(lián)物和7.5nM兔-抗綿羊IgG抗體-引物-2偶聯(lián)物的偶聯(lián)物應(yīng)用于每個矩陣的點并在37℃孵育2.5小時。清洗載玻片8次(每次1min)并風(fēng)干。5μl在2xSSC，0.1％ Tween20，3％ BSA，0.1％超聲波處理的鯡魚精子DNA中的0.2μM兩個環(huán)狀探針(環(huán)1和環(huán)2)溶液應(yīng)用于每個點。在37℃雜交20min后，在37℃，用2xSSC，0.1％ Tween20清洗載玻片5min，并風(fēng)干。
RCA-CACHET反應(yīng)。5μl RCA反應(yīng)混合物(50mM NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.2)，5mM MgCl2，0.5mM of每種dNTP，1mM DTT，SSB和0.5單位/μl測序酶)應(yīng)用于每個點，然后在37℃孵育載玻片15min。清洗載玻片后，風(fēng)干載玻片，然后5μl含有0.25μM雙標記(熒光+2，4 DNP)檢測探針的溶液應(yīng)用于每個矩陣。在37℃，在保濕室內(nèi)孵育載玻片30min，然后清洗5遍并風(fēng)干。為將RCA產(chǎn)物降解成熒光點源，這樣單一抗原-抗體偶聯(lián)物可以被計數(shù)，5μl在PBS中的33nM綿羊-抗-DNP IgM被加入到每個矩陣點，在37℃孵育載玻片45min，在室溫下在2xSSC中清洗3min，然后風(fēng)干。延長抗衰減溶液(分子探針)應(yīng)用于載玻片，然后用20 x 20mm蓋玻片覆蓋載玻片。使用63X物鏡透鏡捕獲分離的FITC和Cy3熒光基團顯微鏡成像，并人工計數(shù)每個區(qū)域內(nèi)個體RCA產(chǎn)物。FITC和Cy3成像用電子儀器合并，RNA信號擬呈現(xiàn)綠色和紅色。分散的熒光信號或者是具有純熒光或者具有純Cy3的光譜，混合的光譜(黃色)下，沒有信號指示通過單一抗體-抗原偶聯(lián)物產(chǎn)生的每個點?？股锼氐鞍?淺灰)和綿羊抗-地高辛IgG(深灰)信號的定量說明了淺/深信號比率與已知的兩種蛋白抗原的投入比率緊密對應(yīng)(圖10)，進一步暗示抗體-抗原偶聯(lián)物與信號之間的一一對應(yīng)。
該實施例說明免疫RCA理想地適用于微矩陣。在整個等溫RCA反應(yīng)中，獲得的擴增DNA分子維持著與抗體-抗原偶聯(lián)物的共價連接。在微矩陣中，該方法產(chǎn)生的可檢測熒光信號比非擴增信號檢測方法的提高約3個對數(shù)。RCA的一個顯著特征是能夠精確地定位單一DNA指示分子產(chǎn)生的信號，這樣能夠目測固體表面目的各個識別作用。當(dāng)RCA的長單鏈DNA產(chǎn)物通過雜交到許多互補寡核苷酸而被修飾時，其中這些寡核苷酸是用指示熒光基團和半抗原標記的，例如2，4-二硝基酚，所有的熒光基團都可以降解成點光源。當(dāng)分子信號的數(shù)目非常高時，在微矩陣上來自某個點的信號可通過總計熒光來閱讀。但是，當(dāng)表面結(jié)合的抗原數(shù)目較小時，該信號可按分散的單一分子計數(shù)作為其分數(shù)，分析物的subattomole可以目測。這樣，微矩陣上進行的免疫RCA提供了極寬動力學(xué)范圍的試驗方法；結(jié)合單一分子計數(shù)和總熒光輸出量指示著6到7對數(shù)的動力學(xué)范圍。
實施例7該實施例說明測量兩個樣品中模型蛋白(IgE)的相對濃度。
為通過線性RCA獲得IgE的雙色表達水平圖譜，用多克隆山羊抗-人IgE(0.5mg/ml，BiosPacific)捕獲抗體在載玻片上點制微矩陣，該載玻片是被硫醇硅烷激活的并用GMBS處理過。構(gòu)建MAb抗-IgE(BiosPacific，clone#A37020047P)的兩種偶聯(lián)物。構(gòu)建第一個偶聯(lián)物，抗體用硫代GMBS激活，然后與5’硫醇Pr2(GTA CCA TCA TAT ATG TCC GTG CTA GAA GGAAAC AGT TACA)相互作用。構(gòu)建第二個偶聯(lián)物，抗體用EZ-偶聯(lián)硫代NHSLC-生物素(Pierce Chemical Co.)生物素化。還構(gòu)建MAb抗-生物素(Jackson Immunochemicals)，通過硫代GMBS激活抗體，然后與5’硫醇Prl(AAA AAA AAA AAA AAA CAC AGC TGA GGA TAG GAC AT)反應(yīng)?？贵w-抗原偶聯(lián)物通過在室溫下，在一個試管中用50ng/ml IgE孵育生物素-MAb抗-IgE1小時而在第二個試管中用500，50，5，和0ng/ml IgE孵育Pr2-MAb抗-IgE 1小時，在分離的反應(yīng)中預(yù)先制備。然后混合適量的抗體-抗原偶聯(lián)物，20μl混合物應(yīng)用于每個矩陣。在37℃捕獲預(yù)先制備的偶聯(lián)物30min。然后，10μl含有200nM環(huán)1，200nM環(huán)2，和2.5ng/μl Prl-抗-生物素混合物的混合物應(yīng)用于每個矩陣并在37℃孵育30min。然后在lxPBS/0.05％ Tween 20中清洗載玻片兩次，每次2min。然后，10μl線性RCA反應(yīng)混合物(20mM Tris-Cl，10mM MgCl2，25mM NaCl，1mM每種dNTP，0.5μM Cy5-標記的環(huán)1檢測探針和Cy3-標記的環(huán)2檢測探針，29.1ng/μl大腸桿菌SSB(Promega)，0.01U/μl T7 Native DNA聚合酶(USB)，和8％DMSO)應(yīng)用于每個矩陣并在37℃孵育45min。然后在lxPBS/0.05％ Tween20和lxPBS中清洗載玻片，風(fēng)干并掃描。如圖12所示，Cy5熒光強度與Cy3熒光強度的比率反應(yīng)了兩種樣品中IgE的比率。
兩種樣品中蛋白相對濃度的測量通過使用前列腺-特異性抗原(PSA)作為模型而進一步例示。各種濃度PSA(Biospacifics)與在PBS/0.05％Tween20中的5ng/μl生物素或FITC標記的單克隆抗-PSA在37℃孵育30min。然后混合該PSA/FITC抗-PSA和PSA/生物素化抗-PSA偶聯(lián)物，20μl該混合物在微矩陣上37℃孵育30min。用PBS/0.05％ Tween20清洗載玻片2min，清洗2次。該載玻片與2.5ng/μl抗-生物素-引物1偶聯(lián)物，抗-FITC-引物2偶聯(lián)物，或這兩種反應(yīng)物的混合物一起孵育。通過將山羊多克隆抗-PSA抗體(Biospacifics，0.3mg/ml)固定在GMBS激活的硫醇硅烷玻璃載玻片上而制備微矩陣，并如所述阻斷。使用抗體標記的試劑盒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MI)，用FITC或生物素標記單克隆抗-PSA抗體(Biospacifics)。
在微矩陣上，37℃，在50nM每種Cy5-標記的環(huán)1和Cy3-標記的環(huán)2修飾物存在下，用T7 Native DNA聚合酶進行45min線性RCA。用2XSSC/0.05％Tween20清洗載玻片2min，清洗2次，用1XSSC清洗1min，風(fēng)干，并在GSI Lumonics GSA5000掃描儀上，分別以適于Cy3和Cy5熒光基團的設(shè)置進行掃描。如圖17所示，Cy5熒光強度與Cy3熒光強度的比率反應(yīng)了兩種樣品中PSA的比率。
實施例8本實施例說明用于固定來自復(fù)雜生物樣品的分析物的方法和組合物，以及使用本發(fā)明方法檢測并定量其在樣品中的存在。在此使用含有過敏原的樣品進行本方法的例示。
過敏原微矩陣。如實施例4所述，潔凈的載玻片用硫醇處理。貓毛，狗毛，屋內(nèi)灰塵螨(D.farinae和D.pterorzyssinus)和豌豆(ALK-Abello)的提取物過PD-10柱(Pharmacia)，分離到各洗脫部分，然后在CentriconYM-3過濾器(Millipore)上進行超濾濃縮。使用針-工具型微矩陣儀(GeneMachines)將提取物點到激活的載玻片上。點制人IgE和5’-氨基修飾的RCA引物作為陽性對照。用2％BSA(無蛋白酶)阻斷矩陣，風(fēng)干，氮氣下4℃儲存待用。
免疫RCA。通過加入50μl體積的在50mM甘氨酸(pH9.0)中的2mg/mlBSA溶液來阻斷每個微矩陣，并在濕潤容器內(nèi)37℃孵育1小時。阻斷后，載玻片用PBS，0.05％ Tween 20清洗2分鐘，2次，然后再用PBS進行1min清洗。立即向每個矩陣加入10μl人血清，在濕潤容器內(nèi)37℃孵育30min，并用PBS，0.05％ Tween 20清洗2次。小鼠單克隆抗-IgE抗體DNA偶聯(lián)物與50nM環(huán)狀DNA(序列5’-TAG CAC GGA CAT ATA TGA TGG TAC CGC AGT ATGAGT ATC TCC TAT CAC TAC TAA GTG GAA GAA ATG TAA CTG TTT CCT TC)一起，在PBS，0.05％ Tween 20，1mM EDTA中，37℃退火30min。10μl應(yīng)用于每個矩陣并在濕潤容器內(nèi)37℃孵育30min。載玻片用PBS，0.05％Tween20進行2次2分鐘的清洗。如實施例5所述進行RCA反應(yīng)和檢測。
該免疫RCA微矩陣試驗在16微孔-玻璃載玻片上進行，每孔之間由特氟隆遮蔽膜分隔。每個微孔中點制100-400μm點的微矩陣；這些微孔中每一個都用于不同樣品或者陰性或陽性對照的試驗。多孔載玻片還在16個孔中的6個孔內(nèi)點制抗IgE捕獲抗體的矩陣。該多孔形式過敏原微矩陣上的半自動免疫RCA試驗可由低廉的Beckman BioMek液體處理機器人進行。
實施例9本實施例說明本發(fā)明方法用于多元分析一種樣品中不止一種分析物，如應(yīng)用于檢測細胞素的特殊情況。
如實施例5所述，用硫醇-硅烷/GMBS化學(xué)物質(zhì)在10孔Erie載玻片上制備微矩陣。大致上，將識別5種細胞素的多克隆抗體(抗-bNGF，抗-ILlb，抗-TNFa，抗-IL6和抗-ILla)(R&D Systems，Minneapolis，MN)以0.5mg/ml溶解于PBS并用于在多孔載玻片上制備微矩陣。阻斷該微矩陣，并與含有20ng/ml在PBS/0.5％ Tween中的細胞素樣品一起在37℃孵育30min。清洗該微矩陣并與含有2.5μg/ml生物素化的單克隆抗體(R&DSystems)的溶液孵育。如所述，通過用α-生物素/引物1偶聯(lián)物進行RCA來檢測這些點。
如圖18所示，當(dāng)存在TNF和ILla的抗體時，可在微矩陣上同時檢測這兩種細胞素。當(dāng)僅僅加入一種抗體時，只有一種同類信號出現(xiàn)，通過這種現(xiàn)象說明信號的特異性。
應(yīng)該理解，由于其可變性，本發(fā)明并不限于特定方法，方案和試劑。還應(yīng)理解，此處所用術(shù)語僅為描述特定實施例而不應(yīng)限制本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明保護范圍由附加的權(quán)利要求書限定。
正如此處和權(quán)利要求書中所使用的，必須注意單數(shù)形式“一”，″該″包括復(fù)數(shù)形式，除非文中明確表述其不包括。這樣，例如，“一個宿主細胞”包括這種宿主細胞的復(fù)數(shù)形式，“該抗體”指一個或多個抗體以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其同功物，如此等等。
除非另有說明，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的含義。盡管可以將類似于或等同于此處所述的方法和材料用于實踐或測試本發(fā)明，但是優(yōu)選的方法，設(shè)備和材料如所述。此處引用的出版物以及其引用的材料并入本發(fā)明作為參考。此處本發(fā)明的注釋應(yīng)解釋為本發(fā)明未授權(quán)由于在前發(fā)明而提前公開本發(fā)明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見地能夠?qū)⑦@些常規(guī)試驗，眾多同功物應(yīng)用于本發(fā)明此處所述的特定實施例。這些同功物質(zhì)也屬于隨后的權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.檢測一種或多種分析物的方法，該方法包括(a)使一種或多種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸，其中每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子以及一個滾環(huán)復(fù)制引物，其中每種特異性結(jié)合分子與一種分析物直接或間接地相互作用，以及在促進所述特異性結(jié)合分子與分析物的相互作用的條件下，孵育所述分析物樣品和指示子結(jié)合引物，(b)在步驟(a)之前、同時或之后，使所述指示子結(jié)合引物與一種或多種擴增的靶環(huán)接觸，其中每個擴增的靶環(huán)包含一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子包含一個引物互補部分，其中該引物互補部分與至少一個滾環(huán)復(fù)制引物互補，以及在促進擴增的靶環(huán)與滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育所述指示子結(jié)合引物與擴增的靶環(huán)，(c)在步驟(b)之后，并在步驟(a)之前、同時或其后，在促進擴增的靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育所述指示子結(jié)合引物和擴增的靶環(huán)，其中所述擴增的靶環(huán)的復(fù)制引起串聯(lián)的DNA序列的形成，其中檢測出串聯(lián)的DNA序列表明相應(yīng)的分析物的存在，其中所述分析物是在步驟(a)、(b)或(c)之前，同時或之后從分析物樣品中分離出來的。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中多元指示子結(jié)合引物與一種或多種分析物樣品接觸。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中多元分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種分析物是蛋白質(zhì)或多肽。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種分析物是脂、糖脂或蛋白多糖。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種分析物來自人類。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種分析物是來自非人類來源。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中所述分析物不是核酸。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中所述分析物通過如下分離使至少一種分析物樣品與一種或多種分析物捕獲劑接觸，其中每種分析物捕獲劑與一種分析物直接或間接地相互作用，其中至少一種分析物，如果存在于樣品中，與至少一種分析物捕獲劑相互作用，并從分析物樣品中分離出分析物捕獲劑，這樣分析物就從所述分析物樣品中被分離出來。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中至少一種分析物捕獲劑與固體支持物相連，其中分析物捕獲劑與固體支持物相連，而分析物與分析物捕獲劑相互作用從而與固體支持物相連。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中每種分析物捕獲劑定位于固體支持物上預(yù)先指定的不同區(qū)域。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中所述固體支持物上各預(yù)先指定的不同區(qū)域之間的距離是固定的。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中所述固體支持物包括薄膜、膜、瓶、皿、纖維、編織纖維、成型的聚合物、顆粒、珠、微?；蚱浣M合。
14.如權(quán)利要求11的方法，其中所述固體支持物上至少兩種不同的預(yù)先指定的區(qū)域之間的距離不相同。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中所述固體支持物包括至少一種薄膜、膜、瓶、皿、纖維、編織纖維、成型的聚合物、顆粒、珠、或微粒。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中所述固體支持物包括至少兩種薄膜、膜、瓶、皿、纖維、編織纖維、成型的聚合物、顆粒、珠、微?；蚱浣M合。
17.如權(quán)利要求11的方法，其中所述串聯(lián)的DNA序列在固體支持物上的位置指示在分析物樣品中，相應(yīng)于在固體支持物上所述位置的分析物捕獲劑的分析物的存在。
18.如權(quán)利要求10的方法，其中所述固體支持物包括多元分析物捕獲劑，該分析物捕獲劑定位于固體支持物上預(yù)先指定的不同多元區(qū)域內(nèi)，其中分析物捕獲劑共同地相應(yīng)于多元分析物。
19.如權(quán)利要求10的方法，其中所述固體支持物包括薄膜、膜、瓶、皿、纖維、編織纖維、成型的聚合物、顆粒、珠、微粒或其組合。
20.如權(quán)利要求10的方法，其中所述固體支持物包括丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚環(huán)氧乙烷、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、特氟隆、氟代烴、尼龍、硅膠、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基富馬酸酯、膠原、氨基葡聚糖或聚氨基酸。
21.如權(quán)利要求10的方法，其中所述固體支持物是多孔的。
22.如權(quán)利要求9的方法，該方法進一步包括使至少一種分析物樣品和至少一種指示子結(jié)合引物與至少一種輔助分子接觸，其中該輔助分子影響至少一種分析物與至少一種特異性結(jié)合分子或至少一種分析物捕獲劑的相互作用。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中在步驟(a)之前、同時或之后，使輔助分子與至少一種分析物樣品、至少一種指示子結(jié)合引物或其兩者相接觸。
24.如權(quán)利要求22的方法，其中至少一種分析物捕獲劑與固體支持物相連，其中所述輔助分子與所述固體支持物相連。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中所述輔助分子通過在步驟(a)之前、同時或之后使輔助分子與固體支持物接觸從而使輔助分子與固體支持物相連。
26.如權(quán)利要求22的方法，其中所述輔助分子是蛋白激酶、蛋白磷酸酶、酶或化合物。
27.如權(quán)利要求22的方法，其中所述輔助分子是目的分子，其中一種或多種分析物是測試分子，其中檢測測試分子與目的分子的相互作用。
28.如權(quán)利要求22的方法，其中至少一種分析物是目的分子，所述輔助分子是測試分子，其中檢測測試分子與目的分子的相互作用。
29.如權(quán)利要求9的方法，其中所述分析物樣品包括一種或多種初級分析物樣品，和一種或多種次級分析物樣品，其中所述指示子結(jié)合引物包括一種或多種初級指示子結(jié)合引物和一種或多種次級指示子結(jié)合引物，該方法進一步包括在步驟(a)之后并在使分析物樣品與固體支持物接觸之前，混合一種或多種所述初級分析物樣品與一種或多種次級分析物樣品，其中每種初級指示子結(jié)合引物都有匹配的次級指示子結(jié)合引物，其中與初級指示子的特異性結(jié)合分子相互作用的分析物和與匹配的次級指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子相互作用的分析物相同，其中每種不同的指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物不相同，其中每種不同的滾環(huán)復(fù)制引物引導(dǎo)不同的擴增靶環(huán)的復(fù)制，其中每種不同的擴增靶環(huán)產(chǎn)生不同的串聯(lián)DNA序列，其中在不同的分析物樣品中有或沒有相同分析物的存在由有或沒有相應(yīng)的串聯(lián)DNA序列來指示。
30.如權(quán)利要求29的方法，其中相應(yīng)于所述分析物之一的并與初級指示子結(jié)合引物相關(guān)聯(lián)產(chǎn)生的串聯(lián)DNA序列在固體支持物上的位置與相應(yīng)于相同的分析物的并與所述匹配的次級指示子結(jié)合引物相關(guān)聯(lián)產(chǎn)生的串聯(lián)DNA序列在所述固體支持物上的位置相同，其中在不同的分析物樣品中有或沒有相同分析物是通過有或沒有相應(yīng)的串聯(lián)DNA序列的存在來指示的。
31.如權(quán)利要求9的方法，其中至少一種分析物捕獲劑是目的分子，一種或多種分析物是測試分子，其中檢測測試分子與目的分子的相互作用。
32.如權(quán)利要求9的方法，其中至少一種分析物是目的分子，一種或多種分析物捕獲劑是測試分子，其中檢測測試分子與目的分子的相互作用。
33.如權(quán)利要求1的方法，該方法進一步包括在步驟(a)之前、同時或之后，使一種或多種初級分析物捕獲劑與一種或多種初級分析物樣品接觸，使一種或多種次級分析物捕獲劑與一種或多種次級分析物樣品相接觸，其中每種分析物捕獲劑包含一種分析物的相互作用部分和捕獲部分，其中每種初級分析物捕獲劑都有一個匹配的次級分析物捕獲劑，其中與初級分析物捕獲劑的分析物相互作用部分發(fā)生作用的分析物和與匹配的次級分析物捕獲劑的分析物相互作用部分發(fā)生作用的分析物相同，其中所述初級和次級分析物捕獲劑的捕獲部分都與一種或多種指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子發(fā)生作用，其中與所述初級分析物捕獲劑的捕獲部分發(fā)生作用的特異性結(jié)合分子不同于與相匹配的次級分析物捕獲劑的捕獲部分發(fā)生作用的特異性結(jié)合分子，其中每種不同的特異性結(jié)合分子是指示子結(jié)合引物的一個不同部分，每種不同的指示子結(jié)合引物的滾環(huán)復(fù)制引物是不相同的，其中每種不同的滾環(huán)復(fù)制引物引起不同的擴增靶環(huán)的復(fù)制，每種不同的擴增靶環(huán)產(chǎn)生不同的串聯(lián)DNA序列，其中在不同的分析物樣品中有或沒有相同的分析物的存在由有或沒有相應(yīng)的串聯(lián)DNA序列的存在指示。
34.如權(quán)利要求33的方法，該方法進一步包括混合一種或多種初級分析物樣品和一種或多種次級分析物樣品。
35.如權(quán)利要求33的方法，該方法進一步包括混合一種或多種初級分析物捕獲劑和一種或多種次級分析物捕獲劑。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中所述混合一種或多種初級分析物捕獲劑和一種或多種次級分析物捕獲劑的步驟是通過使一種或多種初級分析物捕獲劑以及一種或多種次級分析物捕獲劑與相同的固體支持物同時或順序連接而實現(xiàn)的。
37.如權(quán)利要求33的方法，其中相應(yīng)于分析物之一的并與初級分析物捕獲劑相關(guān)聯(lián)產(chǎn)生的串聯(lián)DNA序列與相應(yīng)于相同分析物的并與所述匹配的次級分析物捕獲劑相關(guān)聯(lián)產(chǎn)生的串聯(lián)DNA序列在相同位置，并且被同時檢測，其中在不同分析物樣品中相同分析物的存在或不存在是由相應(yīng)的串聯(lián)DNA序列的存在或不存在來指示的。
38.如權(quán)利要求33的方法，其中每種初級分析物捕獲劑的捕獲部分相同，其中相應(yīng)于初級分析物捕獲劑的指示子結(jié)合引物相同，其中相應(yīng)于初級分析物捕獲劑的擴增靶環(huán)相同，其中每種次級分析物捕獲劑的捕獲部分相同，其中相應(yīng)于次級分析物捕獲劑的指示子結(jié)合引物相同，其中相應(yīng)于次級分析物捕獲劑的擴增靶環(huán)相同。
39.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種特異性結(jié)合分子是對至少一種分析物具有特異性的抗體。
40.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種特異性結(jié)合分子是特異性結(jié)合至少一種分析物的分子。
41.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種特異性結(jié)合分子是與一種輔助分子聯(lián)合而特異性結(jié)合至少一種分析物的分子。
42.如權(quán)利要求1的方法，其中所述特異性結(jié)合分子和分析物通過彼此直接或間接地結(jié)合而相互作用。
43.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種輔助分子與至少一種分析物樣品和至少一種指示子結(jié)合引物接觸，其中所述輔助分子影響至少一種分析物與至少一種特異性結(jié)合分子或至少一種分析物捕獲劑的相互作用。
44.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子競爭至少一種特異性結(jié)合分子或至少一種分析物捕獲劑的相互作用。
45.如權(quán)利要求44的方法，其中所述輔助分子是至少一種分析物的類似物。
46.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子促進至少一種特異性結(jié)合分子或至少一種分析物捕獲劑的相互作用。
47.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子在步驟(a)之前、同時或之后，與至少一種分析物樣品、至少一種指示子結(jié)合引物或其二者相接觸。
48.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子是蛋白激酶、蛋白磷酸酶、酶或化合物。
49.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子具有至少20％的純度。
50.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子具有至少50％的純度。
51.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子具有至少80％的純度。
52.如權(quán)利要求43的方法，其中所述輔助分子具有至少90％的純度。
53.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種分析物與固體支持物相連。
54.如權(quán)利要求53的方法，其中與固體支持物相連的每種分析物在不同的預(yù)先指定的區(qū)域與固體支持物相連。
55.如權(quán)利要求53的方法，其中至少一種與固體支持物相連的分析物與固體支持物間接相連。
56.如權(quán)利要求55的方法，其中與固體支持物相連的分析物與分析物捕獲劑相互作用，其中分析物捕獲劑與固體支持物相連從而使分析物與固體支持物間接相連。
57.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種特異性結(jié)合分子與至少一種分析物間接地相互作用。
58.如權(quán)利要求57的方法，其中所述分析物與一種分析物捕獲劑相互作用，其中所述特異性結(jié)合分子與所述分析物捕獲劑相互作用，從而使特異性結(jié)合分子與分析物間接地相連。
59.如權(quán)利要求1的方法，其中至少一種分析物是另一種分析物的修飾形式，其中至少一種指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子與所述分析物直接或間接地相互作用，所述的分析物是所述其它分析物的修飾形式，其中另一指示子結(jié)合引物的特異性結(jié)合分子直接或間接地與其它分析物相互作用。
60.如權(quán)利要求59的方法，其中所述分析物是蛋白，其中所述其它分析物的修飾形式的修飾是翻譯后的修飾。
61.如權(quán)利要求60的方法，其中所述修飾是磷酸化或糖基化。
62.如權(quán)利要求1的方法，其中所述串聯(lián)DNA序列的檢測是在促進該串聯(lián)DNA序列與檢測探針之間雜交的條件下，通過混合一套檢測探針和該串聯(lián)DNA序列而完成。
63.如權(quán)利要求62的方法，其中多元的不同串聯(lián)DNA序列通過多元檢測被分別且同時檢測。
64.如權(quán)利要求63的方法，其中所述一套檢測探針使用組合的多色編碼標記。
65.如權(quán)利要求1的方法，該方法進一步包括，與步驟(c)同時、或在其后，使次級DNA鏈移位引物和串聯(lián)DNA序列接觸，并在促進(i)所述串聯(lián)DNA序列與所述次級DNA鏈移位引物之間雜交，以及(ii)所述串聯(lián)DNA序列復(fù)制的條件下孵育，其中所述串聯(lián)DNA序列的復(fù)制引起次級串聯(lián)DNA序列的形成。
66.如權(quán)利要求1的方法，其中所述指示子結(jié)合引物具有至少20％的純度。
67.如權(quán)利要求1的方法，其中所述指示子結(jié)合引物具有至少50％的純度。
68.如權(quán)利要求1的方法，其中所述指示子結(jié)合引物具有至少80％的純度。
69.如權(quán)利要求1的方法，其中所述指示子結(jié)合引物具有至少90％的純度。
70.檢測一種或多種分析物的方法，該方法包括(a)使一種或多種分析物樣品與一種或多種分析物捕獲劑接觸，其中每種分析物捕獲劑直接或間接地與一種分析物相互作用，其中至少有一種分析物，如果其存在于分析物樣品中，與至少一種分析物捕獲劑相互作用，在促進分析物捕獲劑和分析物相互作用的條件下，孵育所述分析物樣品和分析物捕獲劑，(b)在步驟(a)之前、同時或之后，使至少一種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸，其中每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子和一個滾環(huán)復(fù)制引物，其中每種特異性結(jié)合分子與一種分析物捕獲劑直接或間接地相互作用，以及在促進特異性結(jié)合分子與分析物捕獲劑相互作用的條件下，孵育所述分析物樣品與指示子結(jié)合引物，(c)在步驟(a)或(b)之前、同時或之后，使指示子結(jié)合引物和一種或多種擴增的靶環(huán)接觸，其中所述擴增的靶環(huán)的每一個都含有一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子含有一個引物互補部分，其中該引物互補部分互補于至少一種滾環(huán)復(fù)制引物，以及在促進擴增的靶環(huán)和滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育所述指示子結(jié)合引物和擴增的靶環(huán)，(d)在步驟(c)之后并且在步驟(a)或(b)之前、同時或之后，在促進擴增的靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育指示子結(jié)合引物和擴增的靶環(huán)，其中所述擴增的靶環(huán)的復(fù)制引起串聯(lián)DNA序列的生成，檢測出串聯(lián)DNA序列指示相應(yīng)的分析物的存在。
71.檢測一種或多種分析物的方法，該方法包括(a)處理一種或多種分析物樣品，使一種或多種分析物被修飾，(b)使至少一種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸，其中每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子和一個滾環(huán)復(fù)制引物，其中每個特異性結(jié)合分子直接或間接地與修飾的分析物相互作用，以及在促進特異性結(jié)合分子與被修飾的分析物之間相互作用的條件下，孵育所述分析物樣品與指示子結(jié)合引物，(c)在步驟(a)或(b)之前、同時或之后，使指示子結(jié)合引物和一種或多種擴增的靶環(huán)接觸，其中這些擴增的靶環(huán)的每一個都含有一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子含有一個引物互補部分，其中該引物互補部分互補于至少一種滾環(huán)復(fù)制引物，以及在促進擴增的靶環(huán)和滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育所述指示子結(jié)合引物和擴增的靶環(huán)，(d)在步驟(c)之后并且在步驟(a)或(b)之前、同時或之后，在促進擴增的靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育所述指示子結(jié)合引物和擴增的靶環(huán)，其中擴增的靶環(huán)的復(fù)制引起串聯(lián)DNA序列的生成，串聯(lián)DNA序列的檢出指示相應(yīng)的分析物的存在。
72.如權(quán)利要求71的方法，其中所有分析物是通過將修飾基團與分析物相連而被修飾，其中所有分析物的修飾基團都相同，其中所有的特異性結(jié)合分子都與該修飾基團相互作用。
73.檢測一種或多種分析物的方法，該方法包括(a)使一種或多種分析物樣品與一種或多種矩陣接觸，其中每種矩陣包含一套分析物捕獲劑、一套輔助分子、或其二者，其中每種分析物捕獲劑直接或間接地與一種分析物相互作用，(b)在步驟(a)之前、同時或之后，使至少一種分析物樣品與一種或多種指示子結(jié)合引物接觸，其中每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子和一個滾環(huán)復(fù)制引物，其中每種特異性結(jié)合分子與一種分析物直接或間接地相互作用，其中每種輔助分子能夠影響至少一種分析物與至少一種特異性結(jié)合分子或至少一種分析物捕獲劑之間的相互作用，(c)在步驟(a)或(b)之前、同時或之后，在促進特異性結(jié)合分子、分析物、分析物捕獲劑和輔助分子相互作用的條件下、孵育分析物樣品、矩陣和指示子結(jié)合引物，(d)在步驟(b)之前、同時或之后，使指示子結(jié)合引物和一種或多種擴增的靶環(huán)接觸，其中這些擴增靶環(huán)的每一個都含有一個單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子含有一個引物互補部分，其中該引物互補部分互補于至少一種滾環(huán)復(fù)制引物，以及在促進擴增靶環(huán)與滾環(huán)復(fù)制引物之間雜交的條件下，孵育所述指示子結(jié)合引物和擴增的靶環(huán)，(e)在步驟(d)之后并且在步驟(a)、(b)或(c)之前、同時或之后，在促進擴增靶環(huán)復(fù)制的條件下，孵育所述指示子結(jié)合引物和擴增的靶環(huán)，其中擴增的靶環(huán)的復(fù)制引起串聯(lián)DNA序列的生成，串聯(lián)DNA序列的檢出指示相應(yīng)的分析物的存在。
74.如權(quán)利要求73的方法，其中每個矩陣含有一套分析物捕獲劑，其中每種分析物捕獲劑被固定在固體支持物上的不同的預(yù)先指定的區(qū)域內(nèi)。
75.如權(quán)利要求74的方法，其中所述固體支持物上不同的預(yù)先指定的區(qū)域之間的距離是固定的。
76.如權(quán)利要求75的方法，其中所述固體支持物包括薄膜、膜、瓶、皿、纖維、編織纖維、成型的聚合物、顆粒、珠子、微?；蚱浣M合。
77.如權(quán)利要求74的方法，其中至少兩個固體支持物上的不同的預(yù)先指定的區(qū)域之間的距離是可變的。
78.如權(quán)利要求74的方法，其中所述分析物捕獲劑以高于400種不同的分析物捕獲劑每立方厘米的密度固定在固體支持物上。
79.如權(quán)利要求74的方法，其中所述分析物捕獲劑是多肽。
80.如權(quán)利要求79的方法，其中每種不同的多肽具有至少4個氨基酸長度。
81.如權(quán)利要求80的方法，其中每種不同的多肽具有大約4個到大約20個氨基酸長度。
82.如權(quán)利要求80的方法，其中每種不同的多肽具有至少10個氨基酸長度。
83.如權(quán)利要求80的方法，其中每種不同的多肽具有至少20個氨基酸長度。
84.如權(quán)利要求74的方法，其中至少一個矩陣含有至少1000種固定在所述固體支持物上的不同的分析物捕獲劑。
85.如權(quán)利要求74的方法，其中至少一個矩陣含有至少10,000種固定在所述固體支持物上的不同的分析物捕獲劑。
86.如權(quán)利要求74的方法，其中至少一個矩陣含有至少100,000種固定在所述固體支持物上的不同的分析物捕獲劑。
87.如權(quán)利要求74的方法，其中至少一個矩陣含有至少1,000,000種固定在所述固體支持物上的不同的分析物捕獲劑。
88.如權(quán)利要求74的方法，其中每個不同的預(yù)先指定的區(qū)域與每種其它不同的區(qū)域物理分離。
89.如權(quán)利要求74的方法，其中所述固體支持物包括薄膜、膜、瓶、皿、纖維、編織纖維、成型的聚合物、顆粒、珠子、微?；蚱浣M合。
90.如權(quán)利要求74的方法，其中所述固體支持物包括丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚環(huán)氧乙烷、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、特氟隆、氟代烴、尼龍、硅膠、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基富馬酸酯、膠原，氨基葡聚糖或聚氨基酸。
91.如權(quán)利要求74的方法，其中所述固體支持物是多孔的。
92.如權(quán)利要求74的方法，其中在不同的預(yù)先指定的區(qū)域內(nèi)的分析物捕獲劑具有至少20％的純度。
93.如權(quán)利要求74的方法，其中在不同的預(yù)先指定的區(qū)域內(nèi)的分析物捕獲劑具有至少50％的純度。
94.如權(quán)利要求74的方法，其中在不同的預(yù)先指定的區(qū)域內(nèi)的分析物捕獲劑具有至少80％的純度。
95.如權(quán)利要求74的方法，其中在不同的預(yù)先指定的區(qū)域內(nèi)的分析物捕獲劑具有至少90％的純度。
96.一種試劑盒，含有(a) 多元指示子結(jié)合引物，其中每種指示子結(jié)合引物包含一個特異性結(jié)合分子和一個滾環(huán)復(fù)制引物，其中每種特異性結(jié)合分子與一種分析物直接或間接地相互作用，(b)多元分析物捕獲劑，其中每種分析物捕獲劑都與分析物直接或間接地相互作用。
97.如權(quán)利要求96的試劑盒，其中所述分析物捕獲劑與固體支持物相連。
全文摘要
公開了用于檢測少量分析物如蛋白質(zhì)和多肽的組合物和方法。該方法涉及將引物與分析物相連，然后利用引物介導(dǎo)環(huán)狀DNA分子的滾環(huán)復(fù)制。DNA環(huán)的復(fù)制依賴于引物的存在。這樣，本發(fā)明公開的方法通過滾環(huán)復(fù)制可以從任何目的分析物產(chǎn)生出擴增的信號。擴增的DNA通過引物仍與分析物相連，這樣就可以對分析物進行立體的檢測。本發(fā)明的方法可用于檢測并分析蛋白質(zhì)或多肽。通過微矩陣可以分析多種蛋白質(zhì)，其中各種蛋白質(zhì)被固定到該微矩陣上。這樣，利用引物和能夠特異性地結(jié)合待測蛋白質(zhì)的分子的偶聯(lián)物，滾環(huán)復(fù)制引物與各種蛋白質(zhì)相連。引物的滾環(huán)復(fù)制會在矩陣中該蛋白質(zhì)被固定的位點產(chǎn)生大量的DNA產(chǎn)物。該擴增的DNA可作為該蛋白質(zhì)的簡易檢測的信號。本發(fā)明的方法還可以用于比較在兩種或更多樣品中表達的蛋白質(zhì)。所得到的信息與在核酸表達體系中收集到的信息類型相似。本發(fā)明的方法可以對在任何細胞或組織中表達的蛋白質(zhì)進行靈敏、準確的檢測并定量測定。
文檔編號C12Q1/68GK1446050SQ01811542
公開日2003年10月1日 申請日期2001年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月20日
發(fā)明者斯蒂芬·肯斯默, 吉里什·納勒, 巴里·施韋策 申請人:分子分級公司