專利名稱：抗李斯特菌細(xì)菌素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)(更具體的說是清酒乳桿菌2512)的細(xì)菌素、編碼該細(xì)菌素的核苷酸序列、和該細(xì)菌素在食品制作中作為針對(duì)致病或非期望菌群的活性劑的工業(yè)用途。
乳酸菌被廣泛用于食品發(fā)酵，不僅用于改進(jìn)食品的味道和質(zhì)地，而且尤其用于延長(zhǎng)它們的保存期。事實(shí)上，許多乳酸菌能夠抑制某些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(包括致病菌株，諸如單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))的生長(zhǎng)，這要?dú)w功于拮抗分子(包括肽化合物)地分泌。這些肽化合物(稱為細(xì)菌素)因而具有潛在價(jià)值，可用于保持發(fā)酵食品的品質(zhì)和衛(wèi)生。
作為這種細(xì)菌素的范例，特別要提到那些構(gòu)成稱為抗李斯特菌細(xì)菌素的多肽亞型的細(xì)菌素、IIa型細(xì)菌素(S.Ennahar等人，2000，F(xiàn)EMSMicrobiol.Rev.，2485-106)和cystibiotic細(xì)菌素(R.Jack等人，1995，Microbiol.Rev.，59(2)171-200)。最近人們已經(jīng)注意到了這些IIa型細(xì)菌素之一即divercin V41用于在熏魚中防止單核細(xì)胞增生李斯特菌生長(zhǎng)的潛在用途(F.Duffes等人，1999，J.FoodProt.，62(12)1394-1403)。
這些多肽的序列在N端部分顯示強(qiáng)相似性，特別是存在二硫鍵。疏水C端部分的差異要大得多，但是這些細(xì)菌素中的某些即所謂的片球菌素型細(xì)菌素(片球菌素PA-1、腸菌素A和divercin V41)特征為殘基數(shù)目超過40且C端存在第二個(gè)二硫鍵。
本發(fā)明的作者發(fā)現(xiàn)了由清酒李斯特菌特定菌株生成的新的IIa型細(xì)菌素，經(jīng)證明對(duì)抑制李斯特菌(尤其是單核細(xì)胞增生李斯特菌)的生長(zhǎng)特別有效。
與J.R.Tagg等人，1976，Bacteriol.Rev.，40722-756一致，術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌素”在本發(fā)明的范圍內(nèi)指由能夠特異抑制其它細(xì)菌生長(zhǎng)的微生物通過核糖體合成而生成的多肽。
本發(fā)明因而首先涉及由清酒乳桿菌2512菌株衍生的、具有細(xì)菌素活性的多肽。
清酒乳桿菌2512菌株已于2000年5月25日保藏于國(guó)家微生物培養(yǎng)物收藏中心(Collection Nationale des Cultures deMicroorganismes)，保藏物編號(hào)I-2479。
已將本發(fā)明所涉及的細(xì)菌素命名為sakacin G。該多肽的分子量是3700-3900，優(yōu)選大約3834Da(通過質(zhì)譜測(cè)定)。它的細(xì)菌抑制譜與IIa型細(xì)菌素非常相似。因此，經(jīng)證明它對(duì)除清酒乳桿菌2512以外的其它清酒乳桿菌、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、全體李斯特菌、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和耐久腸球菌(Enterococcus durans)特別有效。相反，經(jīng)證明它對(duì)乳桿菌的其它種諸如德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium)的一種菌株無活性。
與片球菌素型抗李斯特菌細(xì)菌素一樣，sakacin G在其肽結(jié)構(gòu)中有利的具有兩個(gè)二硫鍵。
關(guān)于幾種IIa型細(xì)菌素的遺傳決定因子的分析顯示，參與其生成、轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫的基因被組織成一個(gè)或多個(gè)操縱子型結(jié)構(gòu)。這些操縱子通常位于質(zhì)粒中，而且通常具有至少兩種編碼與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助蛋白同源的蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)可能參與細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)。
包含sakacin G基因的核苷酸片段的克隆揭示了存在三個(gè)完整的開放讀碼框即skgA1(SEQ ID NO1)、skgA2(SEQ ID NO3)和skgDc(SEQ ID NO13)(包括截短的讀碼框skgD(SEQ ID NO7))及一個(gè)截短的讀碼框即skgI(SEQ ID NO5)，

圖1顯示了它們的示意圖。核苷酸片段是雙鏈的，SEQ ID NO15顯示了它的5’-3’單鏈。
基因skgA1和skgA2的產(chǎn)物(稱為前細(xì)菌素)可經(jīng)歷成熟，在此過程中，在第18與19位殘基之間切除各自的前導(dǎo)肽，從而釋放有活性的sakacin G(第19-55位殘基)。
SEQ ID NO9顯示了包含skgA1、skgA2、skgD和skgI的5’-3’單鏈核苷酸片段。
本發(fā)明因而還涉及對(duì)應(yīng)于細(xì)菌素的分離多肽，特征為它包含SEQID NO2和/或SEQ ID NO4。成熟細(xì)菌素的序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO12，且包含于SEQ ID NO2和SEQ ID NO4之中。
讀碼框skgI編碼52個(gè)殘基的蛋白質(zhì)。該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列的比較顯示SkgI與所謂的免疫蛋白之間存在強(qiáng)相似性。它可能編碼可保護(hù)sakacin G生產(chǎn)細(xì)菌的免疫蛋白。
本發(fā)明還延伸至包含對(duì)應(yīng)于讀碼框skgI的SEQ ID NO6的分離多肽。
關(guān)于最后一個(gè)基因skgDc，它編碼與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的蛋白質(zhì)(更具體的說是片球菌素PA-1的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)同源的蛋白質(zhì)?；騭kgDc可能編碼對(duì)sakacin G特異的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
本發(fā)明還延伸至包含對(duì)應(yīng)于所謂skgD基因的SEQ ID NO8的分離多肽，以及包含對(duì)應(yīng)于所謂skgDc基因的SEQ ID NO14的分離多肽。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還包括同源序列，定義如下1)與序列SEQ ID NO2、4、6、8、12或14至少70％相似的序列；或2)由下文定義的同源核酸序列編碼的序列，即在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與序列SEQ ID NO1、3、5、7、9、13或15或其互補(bǔ)序列發(fā)生雜交的核酸序列。
同樣，術(shù)語(yǔ)“相似”指進(jìn)行比較的同源序列氨基酸之間的完全類似性或同一性，還包括不完全類似性，稱為相似性。多肽序列中的這種相似性搜索考慮到了保守替代，即相同類型氨基酸的替代，諸如側(cè)鏈不帶電荷的氨基酸(諸如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸)、側(cè)鏈堿性的氨基酸(諸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、側(cè)鏈酸性的氨基酸(諸如天冬氨酸和谷氨酸)、側(cè)鏈非極性的氨基酸(諸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸)之中的替代。
因此，更一般的說，“同源氨基酸序列”應(yīng)理解為因一個(gè)氨基酸或少數(shù)氨基酸的替代、刪除和/或插入(尤其是在這些修飾不會(huì)顯著影響分離多肽(優(yōu)選sakacin G)的生物學(xué)活性的位置中用非天然氨基酸或假氨基酸替代天然氨基酸)而與SEQ ID NO2、4、6、8、12或14不同的任何氨基酸序列。
這種同源氨基酸序列優(yōu)選與序列SEQ ID NO2、4、6、8、12或14的至少85％相似，優(yōu)選至少95％。
通常使用序列分析軟件(例如威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組的序列分析軟件包，威斯康星州麥迪遜市大學(xué)路1710號(hào)，53705)來測(cè)定同源性。比對(duì)相似的氨基酸序列，以獲得最大同源程度(即同一性或相似性，見上文定義)。為此目的，可能必需在序列中人工導(dǎo)入缺口。一旦完成最佳比對(duì)，如下計(jì)算同源程度記錄比較的兩種序列中氨基酸相同的所有位置，并除以位置總數(shù)。
分離多肽(更具體的說是sakacin G)的生物學(xué)活性指其抑制致病和/或非期望細(xì)菌菌株(優(yōu)選李斯特菌，更具體的說是單核細(xì)胞增生李斯特菌)生長(zhǎng)的能力。
本發(fā)明還涉及編碼上述多肽的分離核酸。
更準(zhǔn)確的說，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO3的分離核酸。
已經(jīng)測(cè)定了參與sakacin G表達(dá)的區(qū)域的完整核苷酸序列(3055bp)。它是雙鏈DNA，SEQ ID NO15顯示了它的5’-3’鏈。圖2顯示了它的3’-5’鏈。本發(fā)明還涉及包含這種序列的核酸。
如上所述，該序列具有三個(gè)完整的開放讀碼框即skgA1、skgA2和skgDc及一個(gè)截短的讀碼框即skgI。假設(shè)基因skgA1(SEQ ID NO1)、skgA2(SEQ ID NO3)和skgI(SEQ ID NO5)在其中的取向與skgDc(SEQ ID NO13)相反。
本發(fā)明的范圍還要求包含SEQ ID NO5的核酸、包含SEQ ID NO13的核酸和包含SEQ ID NO17的核酸。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還包括同源序列，定義如下1)與序列SEQ ID NO1、3、5、7、9、1 3或1 5至少70％相似的序列；2)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與序列SEQ ID NO1、3、5、7、9、13或15或其互補(bǔ)序列發(fā)生雜交的序列；或3)編碼上述稱為sakacin G的多肽的序列。
依照本發(fā)明的同源核苷酸序列優(yōu)選與序列SEQ ID NO1、3、5、7、9、13、或15至少75％相似，優(yōu)選至少85％或至少90％相似。
這種同源核苷酸序列優(yōu)選能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列SEQ ID NO1、3、5、7、9、13或15的互補(bǔ)序列發(fā)生特異雜交。定義嚴(yán)謹(jǐn)條件的參數(shù)取決于50％的配對(duì)鏈分開的溫度(Tm)。
對(duì)于包含超過30個(gè)堿基的序列，Tm由如下方程定義(Sambrook等人，1989，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)
Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6Log(陽(yáng)離子濃度)
-0.63(％甲酰胺)-(600/堿基數(shù)目)
對(duì)于長(zhǎng)度小于30個(gè)堿基的序列，Tm由如下方程定義
Tm＝4(G+C)+2(A+T)
在適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)條件(在此條件下非特異序列不發(fā)生雜交)下，雜交溫度可優(yōu)選比Tm低5-10℃，而且所用雜交緩沖液優(yōu)選高離子強(qiáng)度溶液，諸如6xSSC溶液。
上文所用表述“相似序列”指進(jìn)行比較的核苷酸之間的完全類似性或同一性，還包括不完全類似性，稱為相似性。核酸序列中的這種相似性搜索將區(qū)分例如嘌呤和嘧啶。
具有SEQ ID NO1、3、5、7、9、13或15中所示開放讀碼框的同源核苷酸序列包括因一個(gè)或多個(gè)堿基的突變、插入、刪除或替代或者遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與序列SEQ ID NO1、3、5、7、9、13或15不同、但編碼下文定義的具有sakacin G生物學(xué)活性的多肽的任何核苷酸序列。
這種同源序列包括編碼sakacin G的、除乳桿菌以外的其它細(xì)菌的基因序列。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何方法來合成本發(fā)明的多肽。可以通過例如化學(xué)合成技術(shù)(諸如Merrifield型合成)來合成本發(fā)明的多肽，就純度、抗原特異性、不含非期望次級(jí)產(chǎn)物且易于生產(chǎn)而言，這種方法是有利的。
本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)重組多肽的方法，其中將包含依照本發(fā)明的核酸的載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，并將其在容許表達(dá)依照本發(fā)明的多肽或由依照本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
還可以通過如下方法來生產(chǎn)重組細(xì)菌素，其中將載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，并將其在容許表達(dá)相應(yīng)多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所述載體包含依照本發(fā)明的核苷酸序列(優(yōu)選序列SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO3或其同源序列)的核酸。然后可以回收并純化生成的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道所用的純化方法?？梢詥为?dú)或聯(lián)合使用諸如分級(jí)分離、層析法、使用特異單克隆或多克隆抗體的免疫親和技術(shù)等方法，由裂解物和細(xì)胞提取物、培養(yǎng)物上清液開始，純化生成的重組多肽。
可以將編碼sakacin G的目的核酸序列插入表達(dá)載體，在其中以可操作方式連接容許調(diào)控其表達(dá)的元件，諸如(尤其是)啟動(dòng)子、激活子和/或轉(zhuǎn)錄終止子。根據(jù)所用宿主細(xì)胞來選擇控制核苷酸序列表達(dá)的信號(hào)(啟動(dòng)子、激活子、這種序列、等)。為此目的，可以將依照本發(fā)明的核苷酸序列插入能夠在所選宿主中自主復(fù)制的載體或可整合到所選宿主中的載體內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常規(guī)使用的方法來制備這種載體，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法(諸如電穿孔或磷酸鈣沉淀)將由此生成的克隆導(dǎo)入合適的宿主。
包含依照本發(fā)明的核苷酸序列的上述克隆和/或表達(dá)載體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還涉及經(jīng)那些表達(dá)載體暫時(shí)或永久轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。可以如下獲得這些細(xì)胞將插入上述載體的核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞(優(yōu)選原核宿主細(xì)胞)，然后在容許轉(zhuǎn)移的核苷酸序列復(fù)制和/或表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
宿主細(xì)胞的范例具體包括諸如乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌和酵母。
本發(fā)明的核苷酸序列可以是合成或天然來源的。它們可以是使用基于序列SEQ ID NO1、3、5、7、9、13和/或15而生成的探針篩選序列文庫(kù)而得到的DNA或RNA序列?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)來制備這種文庫(kù)。
還可以通過化學(xué)合成法或者通過混合法來制備依照本發(fā)明的核苷酸序列，所述混合法包括對(duì)通過篩選文庫(kù)而得到的序列進(jìn)行化學(xué)或酶促修飾。
本發(fā)明還涉及在可能是或不是食品環(huán)境且易于受到單核細(xì)胞增生李斯特菌污染的環(huán)境中抑制李斯特菌(尤其是單核細(xì)胞增生李斯特菌)生長(zhǎng)的方法。
單核細(xì)胞增生李斯特菌是致病微生物，是人類和動(dòng)物嚴(yán)重疾病的根源，尤其易于通過污染食品進(jìn)行傳播，更具體的說是通過肉類、肉制品、海產(chǎn)品、奶類及由其衍生的產(chǎn)品。本發(fā)明因而提出了在有可能包含單核細(xì)胞增生李斯特菌作為污染物的食品中抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌生長(zhǎng)的方法，所述方法包括以足以抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌生長(zhǎng)的數(shù)量在所述食品中添加依照本發(fā)明的多肽。
優(yōu)選以每克食品1-100,000任意單位(AU)細(xì)菌素的數(shù)量將依照本發(fā)明的細(xì)菌素用于任何食品系統(tǒng)。
一個(gè)AU的細(xì)菌素定義為在瓊脂培養(yǎng)基上，相對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的對(duì)照菌株，5μl最高稀釋度的培養(yǎng)物上清液導(dǎo)致確定的生長(zhǎng)抑制圈。
雖然食品最受單核細(xì)胞增生李斯特菌污染的影響，但是獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品也可能受到這類細(xì)菌的污染，化妝品或相似產(chǎn)品也一樣。
依照本發(fā)明的細(xì)菌素(更具體的說是sakacin G)因而可用于在這些產(chǎn)品中抑制這類病原體的生長(zhǎng)。
因此，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的細(xì)菌素在食品制作中作為針對(duì)致病或非期望菌群的活性劑的用途，更準(zhǔn)確的說是在食品中抑制李斯特菌(更具體的說是單核細(xì)胞增生李斯特菌)的生長(zhǎng)和繁殖。
可以如此將多肽摻入討論的食品，或者可以在其中由清酒乳桿菌2512生成該多肽。
因此，本發(fā)明還涉及清酒乳桿菌2512菌株在食品中生成依照本發(fā)明的細(xì)菌素多肽的用途。
本發(fā)明還涉及細(xì)菌素組合物，特征為它包含至少一種依照本發(fā)明(即由清酒乳桿菌2512菌株衍生或包含序列SEQ ID NO2、4、12或14)的多肽或清酒乳桿菌2512菌株。
本發(fā)明還延伸至清酒乳桿菌2512菌株意欲在食品中生成上文定義的多肽以用于抑制李斯特菌(更具體的說是單核細(xì)胞增生李斯特菌)的生長(zhǎng)和繁殖的用途，及包含該菌株的組合物。
給出下文實(shí)施例和圖作為范例，而非限制本發(fā)明的主題。
圖
圖1參與sakacin G生成的基因座的示意圖。
圖2對(duì)應(yīng)于參與sakacin G表達(dá)的區(qū)域的完整核苷酸序列的3’-5’互補(bǔ)鏈，它的5’-3’鏈顯示于SEQ ID NO15。
材料和方法細(xì)菌菌株和培養(yǎng)基
在MRS培養(yǎng)基(DIFCO Laboratories)(于110℃滅菌12分鐘)中于30℃培養(yǎng)清酒乳桿菌2512。在BHI培養(yǎng)基(腦心浸液；DIFCOLaboratories)中于37℃培養(yǎng)指示菌株。活性測(cè)試
在將添加10g/L瓊脂的BHI培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿之前，以1％接種量接種處于靜止期的指示菌株預(yù)培養(yǎng)物。用打孔器在冷卻后的瓊脂中打孔，并加入50μl sakacin G。于37℃保溫過夜后，細(xì)菌素通過孔周圍出現(xiàn)的抑菌圈而顯現(xiàn)其活性。蛋白質(zhì)分析
使用配備了離子噴射電離源的Perkin-Elmer Sciex API 165設(shè)備通過質(zhì)譜分析sakacin G。凍干后，用含0.1％甲酸的乙腈/水溶液(1∶1)溶解有活性的HPLC級(jí)分，然后以5μl/min的流速注入。
使用BCA試劑盒(Sigma)，依照制造商的指示，通過二金雞寧酸法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
使用可以由瑞士生物信息研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)的ExPASy服務(wù)器獲得的BLAST(1)程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比較。分子克隆和轉(zhuǎn)化
分別依照先前由Sambrook等人，1989，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室及Muriana和Klaenhammer，1987，Appl.Environ.Microbiol.，53553-560描述的方法，由大腸桿菌和清酒乳桿菌2512提取和純化質(zhì)粒。
依照供應(yīng)商(Gibco-BRL)的指示使用DNA限制酶和修飾酶。依照由Sambrook等人，1989，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室描述的方法，在Tris/硼酸/EDTA緩沖液(pH8.3)中進(jìn)行分析性和制備性瓊脂糖凝膠電泳。使用“制備基因”試劑盒(Bio-Rad)由瓊脂糖凝膠純化消化得到的DNA片段。依照供應(yīng)商的建議在質(zhì)粒pGEM-T(Promega)和pZERO2(Invitrogen)中進(jìn)行克隆。依照Sambrook等人，1989，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室的方法，在尼龍膜(Hybond-N+，Amersham)上進(jìn)行Southern型轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，使用借助“隨機(jī)引物DNA標(biāo)記系統(tǒng)”試劑盒(Gibco-BRL)通過32P標(biāo)記得到的放射性探針進(jìn)行雜交。依照Hanahan，1983，J.Mol.Biol.，166557-580的方法，使大腸桿菌處于感受態(tài)和進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
依照供應(yīng)商的建議使用Taq聚合酶(Gibco-BRL)。使用“基因擴(kuò)增9700”裝置(Perkin-Elmer)進(jìn)行編碼sakacin G的DNA片段的擴(kuò)增，條件如下35個(gè)循環(huán)，變性94℃30sec、雜交45℃30sec、延伸72℃60sec；1個(gè)額外的延伸，72℃5min。
使用ABI Prism 310自動(dòng)測(cè)序儀(Perkin-Elmer)和“大染料終止劑”測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)及適當(dāng)?shù)暮塑账嵋飳?duì)攜帶sakacin G基因座的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例實(shí)施例1sakacin G的分離和純化
將100ml清酒乳桿菌2512的16小時(shí)培養(yǎng)物以6000g離心15分鐘。然后將培養(yǎng)物上清液于70℃加熱20分鐘。用1倍體積的水稀釋冷卻后的上清液(稀釋后溶液的pH必須低于6，如果需要就加入1M HCl)，然后流過裝有陽(yáng)離子交換樹脂(羧甲基纖維素；Cellufine C-200，Amicon)并經(jīng)水平衡的層析柱(2.5×18cm)。先用100ml水、后用150ml 0.1M NaCl連續(xù)清洗后，用200ml 0.5M NaCl洗脫sakacin G。所有溶液的pH必須低于6。然后將活性級(jí)分在固相提取柱(Sep-pak+C18，Waters)(用水平衡)上沉積。用5ml含0、10、20和30％乙腈的20mM醋酸銨連續(xù)清洗后，用10ml含80％乙腈的20mM醋酸銨洗脫sakacin G。凍干后，將提取物溶于1ml 40％乙腈水溶液，然后注射到C8反相分析HPLC柱(Kromasil，5μm，100，4.6×250mm，A.I.T.)上。在包括Perkin-Elmer系列200LC泵且連接Perkin-Elmer 785A檢測(cè)器的裝置上進(jìn)行HPLC。記錄220nm的吸收色譜。以0.8ml/min流速進(jìn)行分離，梯度如下溶劑A＝水/0.1％三氟乙酸；溶劑B＝乙腈/水/0.07％三氟乙酸。用20％的溶劑B清洗5分鐘后，以如下梯度進(jìn)行洗脫20-40％溶劑B 10min；40-55％溶劑B 20min。
對(duì)應(yīng)于第23分鐘峰的級(jí)分經(jīng)證明對(duì)伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)BUG 496有活性，并通過“離子噴射”電離質(zhì)譜進(jìn)行分析。該分子表現(xiàn)為至少95％純，且具有分子量3834.32±0.31Da。由此純化的sakacin G的質(zhì)量估計(jì)是100ml培養(yǎng)物得到120μg。純化產(chǎn)量估計(jì)是所發(fā)現(xiàn)活性的55％。
通過微量測(cè)序測(cè)定了sakacin G的部分一級(jí)序列，并由該序列確定了兩種簡(jiǎn)并寡核苷酸。實(shí)施例2參與sakacin G生成的基因座的克隆
通過反求遺傳學(xué)，選擇兩種簡(jiǎn)并寡核苷酸即SakG01(5’-AARTATTATGGNAAYGGNGT-3’)(SEQ ID NO10)和SakG02S(5’-ACATGATGNCCNCCRTTNGC-3’)(SEQ ID NO11)，用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于成熟sakacin G結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO15)的DNA片段。將由此獲得的、近似大小100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pGEM-T中，形成質(zhì)粒pJMBYC01。在為了將結(jié)構(gòu)基因在清酒乳桿菌2512基因組上定位而進(jìn)行的Southern型轉(zhuǎn)移過程中，將由pJMBYC01衍生的、包含插入片段的560bp PvuII限制性片段用作雜交探針。由經(jīng)限制酶HindIII和EcoRI消化的清酒乳桿菌2512質(zhì)粒提取物開始，探針分別揭示了近似大小2.1和9kb的片段。純化2.1kb的HindIII片段，然后插入載體pZER02，生成質(zhì)粒pJMBYC02。通過使用引物SakG01和SakG02的PCR擴(kuò)增及插入pJMBYC02中的片段的核苷酸測(cè)序，證明了pJMBYC02中存在sakacin G的結(jié)構(gòu)基因。將相似策略用于測(cè)定基因skgD的完整序列。用XbaI消化清酒乳桿菌2512的質(zhì)粒提取物。將消化產(chǎn)物插入質(zhì)粒pBluescript SK+。使用寡核苷酸SakG03(5’-CCTTGGTCAGGCTATCG-3’)(SEQ ID NO16)和SakG04(5’-ATCACCTTTTTGAATTACCC-3’)(SEQID NO17)在質(zhì)粒pJMBYC02上通過PCR制備放射性探針，并將其用于揭示攜帶目的序列的克隆。
對(duì)該區(qū)域完整核苷酸序列(3051bp)的分析揭示了存在三個(gè)完整的開放讀碼框即skgA1、skgA2和skgDc及一個(gè)截短的讀碼框即skgI。假設(shè)基因skgA1、skgA2和skgI的取向與skgDc相反。
每個(gè)開放讀碼框的前面都有一個(gè)潛在的核糖體結(jié)合位點(diǎn)?；騭kgA1和skgA2都編碼具有55個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，它們的第19-55位序列完全相同。第19-52位序列對(duì)應(yīng)于通過微量測(cè)序得到的sakacinG序列。值得注意的是第9、14和24位和C末端存在4個(gè)半胱氨酸。此外，該肽的計(jì)算分子量是3838.2Da，與測(cè)量分子量(3834.32Da)相差4Da，顯示在sakacin G中存在兩個(gè)二硫鍵，正如其它抗李斯特菌細(xì)菌素早就證明的。
蛋白質(zhì)SkgA1和SkgA2的第1-18位序列只差3個(gè)殘基，而且與II型細(xì)菌素的“前導(dǎo)”肽具有強(qiáng)同源性，所述前導(dǎo)肽參與那些肽通過特異ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。具體而言，末端GG單位是這些前導(dǎo)序列的特征，并構(gòu)成這些細(xì)菌素的成熟位點(diǎn)?；騭kgA1和skgA2的核苷酸序列比較還顯示基因中編碼成熟細(xì)菌素的部分的序列同一性超過95％。
稱為skgI的不完整開放讀碼框編碼52個(gè)殘基的蛋白質(zhì)。該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列的比較顯示SkgI與所謂免疫蛋白LccI和MesI之間存在強(qiáng)同源性。已經(jīng)證明了MesI參與針對(duì)腸膜菌素Y105的保護(hù)?？梢约僭O(shè)skgI編碼sakacin G免疫蛋白。
最后一種基因skgDc編碼727個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。依照數(shù)據(jù)庫(kù)，SkgDc與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的蛋白質(zhì)高度同源，尤其是與片球菌素PA-1PedD或PapD(Marugg等人，1992，Appl.Environ.Microbiol.，582360-2367；Motlagh等人，1994，Lett.Appl.Microbiol.，18305-312)、sakacin PSppT(Huhne等人，1996，Microbiology，1421437-1448)、sakacin ASapT(Axelsson和Holck，1995，J.Bacteriol.，1772125-2137)和腸膜菌素Y105MesD(Fremaux等人，1995，Microbiology，1411637-1645)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高度同源。實(shí)施例3抑制譜
通過孔試法(見材料和方法)測(cè)試了17種細(xì)菌菌株對(duì)sakacin G的敏感性。下文表1顯示了結(jié)果。
這種細(xì)菌素的抑制譜顯得相當(dāng)窄，而且對(duì)于乳酸菌僅限于菌株清酒乳桿菌和啤酒片球菌。與其它IIa型細(xì)菌素一樣，這種肽顯得對(duì)測(cè)試的所有李斯特菌菌株以及糞腸球菌和耐久腸球菌有活性，而對(duì)屎腸球菌無活性。序列表<110>RHODIA CHIMIE<120>抗李斯特菌細(xì)菌素<130><140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>196<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(187)<400>1ttaacaggag gtattcaaa atg aag aat aca cgt agc tta acg atc caa gaa 52
Met Lys Asn Thr Arg Ser Leu Thr Ile Gln Glu
1 5 10ata aaa tcc atc aca ggt ggt aaa tac tat ggt aat ggt gtt agc tgt 100Ile Lys Ser Ile Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys
15 20 25aac tct cat ggt tgt tca gta aat tgg ggg caa gca tgg act tgt ggg 148Asn Ser His Gly Cys Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly
30 35 40gta aat cat cta gct aat ggc ggt cat ggg gtt tgt taa ttatttaaa 196Val Asn His Leu Ala Asn Gly Gly His Gly Val Cys
45 50 55<210>2<211>55<212>PRT<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>2Met Lys Asn Thr Arg Ser Leu Thr Ile Gln Glu Ile Lys Ser Ile Thr 1 5 10 15Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys
20 25 30Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala
35 40 45Asn Gly Gly His Gly Val Cys
50 55<210>3<211>196<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(187)<400>3taatttggag atgttcttt atg aaa aac gca aaa agc cta aca att caa gaa 52
Met Lys Asn Ala Lys Ser Leu Thr Ile Gln Glu
1 5 10atg aaa tct att Aca ggt ggt aaa tac tat ggt aat ggc gtt agc tgt 100Met Lys Ser Ile Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys
15 20 25aac tct cac ggc tgt tca gta aat tgg ggg caa gca tgg act tgt gga 148Asn Ser His Gly Cys Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly
30 35 40gta aac cat cta gct aat ggc ggt cat gga gtt tgt taa ttaccagat 196Val Asn His Leu Ala Asn Gly Gly His Gly Val Cys
45 50 55<210>4<211>55<212>PRT<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>4Met Lys Asn Ala Lys Ser Leu Thr Ile Gln Glu Met Lys Ser Ile Thr 1 5 10 15Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys
20 25 30Ser Val Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala
35 40 45Asn Gly Gly His Gly Val Cys
50 55<210>5<211>181<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(24)..(179)<400>5ttaaaaaagg agacgtgatt aaa atg gca aac aaa gac aat att aaa act gaa 53
Met Ala Asn Lys Asp Asn Ile Lys Thr Glu
1 5 10tct aaa aac aac atc gaa gct ctc ttg cac tta cta gaa aag cgt cct 101Ser Lys Asn Asn Ile Glu Ala Leu Leu His Leu Leu Glu Lys Arg Pro
15 20 25gta aaa tcc agt gaa tta ctc gat att att gac gtt ctt tcc caa gtt 149Val Lys Ser Ser Glu Leu Leu Asp Ile Ile Asp Val Leu Ser Gln Val
30 35 40tat agc aaa att gat ata gct aag aat ccc ga181Tyr Ser Lys Ile Asp Ile Ala Lys Asn Pro
45 50<210>6<211>52<212>PRT<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>6Met Ala Asn Lys Asp Asn Ile Lys Thr Glu Ser Lys Asn Asn Ile Glu 1 5 10 15Ala Leu Leu His Leu Leu Glu Lys Arg Pro Val Lys Ser Ser Glu Leu
20 25 30Leu Asp Ile Ile Asp Val Leu Ser Gln Val Tyr Ser Lys Ile Asp Ile
35 40 45Ala Lys Asn Pro
50<210>7<211>1203<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(1201)<400>7aaattaggag acttatata ttg ttt aat ctg ttg aga tac aaa aaa tta tat 52
Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr
1 5 10tgt tca caa gtg gat gaa gat gat tgt gga atc gca gct ttg aat atg 100Cys Ser Gln Val Asp Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met
15 20 25att ttt aaa aat ttt ggt tcc gaa tat tca cta tca aaa ttg cga ttc 148Ile Phe Lys Asn Phe Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe
30 35 40tta gca aaa acc agt caa caa ggg act act att ttt gga ctg ata aag 196Leu Ala Lys Thr Ser Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys
45 50 55gct gca gag gaa cta aat tta gaa gcg aat gca tta caa gct gat atg 244Ala Ala Glu Glu Leu Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met 60 65 70 75ggc atc ttt aaa gat gaa aat tta atg cta cca atc att gca cat gtt 292Gly Ile Phe Lys Asp Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val
80 85 90tta aag caa gga aaa gtt ctg cat tac tac gtt gta ttt gat gtt tcg 340Leu Lys Gln Gly Lys Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser
95 100 105aaa gac ttt tta att att ggt gac cca gac cca aca ata gga att acg 388Lys Asp Phe Leu Ile Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr
110 115 120gaa atc tcc aaa aag gat ttt gaa aat gaa tgg acg ggt aat ttc ata 436Glu Ile Ser Lys Lys Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile
125 130 135aca ttt tca aaa gga aag aac ttt gtt tca gag aag cag aga aat aac 484Thr Phe Ser Lys Gly Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn140 145 150 155agt tta ctc aag ttt att cct att ttg aga cag caa aaa tcc cta ata 532Ser Leu Leu Lys Phe Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile
160 165 170ttc tgg ata gct ttc gcc gca ata cta ttg atg ata att agt att gca 580Phe Trp Ile Ala Phe Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala
175 180 185gga tca ctt ttt tta gaa caa ctt gta gat ata tat ata cca cac aaa 628Gly Ser Leu Phe Leu Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys
190 195 200aat atg gat aca ttg ggg att atc tcg att tgc tta att gga gcc tat 676Asn Met Asp Thr Leu Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr
205 210 215ctt tta cag gcc gta atg acg tat ttt cag aat ttt tta cta act ata 724Leu Leu Gln Ala Val Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile220 225 230 235ttt gga caa aat ctt tct aga aaa att att tta aat tat att aat cac 772Phe Gly Gln Asn Leu Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His
240 245 250ctt ttt gaa tta ccc atg tct ttc ttc tca aca cgt aga gtt ggc gaa 820Leu Phe Glu Leu Pro Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu
255 260 265ata gtc tct cgg ttt aca gat gca agc aag att ata gat gct ttg gca 868Ile Val Ser Arg Phe Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala
270 275 280agt acg att ttg act ctc ttt tta gat gtt tgg atg ttg gtt aca atc 916Ser Thr Ile Leu Thr Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile
285 290 295tca atc gtt ctc gta ttt tta aat aca aag tta ttt atg att tct ctg 964Ser Ile Val Leu Val Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu300 305 310 315gta tct ata ccg gtg tac tca gtt ata att tat gcg ttt aaa aat aca 1012Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr
320 325 330ttt aat ggc ctg aac cat aaa tca atg gaa aat gca gca tta ttg aat 1060Phe Asn Gly Leu Asn His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn
335 340 345tct gca ata atc gaa aac gta act ggc ata gaa act gta aaa tca tta 1108Ser Ala Ile Ile Glu Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu
350 355 360act tca gaa gaa ttt tcc tac aat caa atc act gat aga ttc gaa aat 1156Thr Ser Glu Glu Phe Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn
365 370 375ttt ctt aac agt tcc tta cgg tat acg ata gct gac caa gga cag ca1203Phe Leu Asn Ser Ser Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln380 385 390<210>8<211>394<212>PRT<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>8Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr Cys Ser Gln Val Asp 1 5 10 15Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met Ile Phe Lys Asn Phe
20 25 30Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Ala Lys Thr Ser
35 40 45Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys Ala Ala Glu Glu Leu
50 55 60Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met Gly Ile Phe Lys Asp 65 70 75 80Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val Leu Lys Gln Gly Lys
85 90 95Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser Lys Asp Phe Leu Ile
100 105 110Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr Glu Ile Ser Lys Lys
115 120 125Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile Thr Phe Ser Lys Gly
130 135 140Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn Ser Leu Leu Lys Phe145 150 155 160Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile Phe Trp Ile Ala Phe
165 170 175Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser Leu Phe Leu
180 185 190Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys Asn Met Asp Thr Leu
195 200 205Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Val
210 215 220Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile Phe Gly Gln Asn Leu225 230 235 240Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His Leu Phe Glu Leu Pro
245 250 255Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu Ile Val Ser Arg Phe
260 265 270Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Thr
275 280 285Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile Ser Ile Val Leu Val
290 295 300Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu Val Ser Ile Pro Val305 310 315 320Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr Phe Asn Gly Leu Asn
325 330 335His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Ile Ile Glu
340 345 350Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Phe
355 360 365Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn Phe Leu Asn Ser Ser
370 375 380Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln385 390<210>9<211>2042<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>9agcttcggga ttcttagcta tatcaatttt gctataaact tgggaaagaa cgtcaataat 60atcgagtaat tcactggatt ttacaggacg cttttctagt aagtgcaaga gagcttcgat 120gttgttttta gattcagttt taatattgtc tttgtttgcc attttaatca cgtctccttt 180tttatagtaa taaaaaaaac acaattaaat tagtgctttt ttatctggta attaacaaac 240tccatgaccg ccattagcta gatggtttac tccacaagtc catgcttgcc cccaatttac 300tgaacagccg tgagagttac agctaacgcc attaccatag tatttaccac ctgtaataga 360tttcatttct tgaattgtta ggctttttgc gtttttcata aagaacatct ccaaattata 420ttttttagtg attcttgaag ttctgttgta acgcagaatt ttggaagaat gagtacttgt 480tagaaatttg ccgatttaaa taattaacaa accccatgac cgccattagc tagatgattt 540accccacaag tccatgcttg cccccaattt actgaacaac catgagagtt acagctaaca 600ccattaccat agtatttacc acctgtgatg gattttattt cttggatcgt taagctacgt 660gtattcttca ttttgaatac ctcctgttaa ataattttta cacgatcagt gtagttctaa 720tgtgaaattg tgtcaagttt agcaaatata tattttaggc atggaaaaac ttgcttttaa 780ttcgacttga ctataacggt ataatactgg tattactata tttgtttagc ttcacaaaaa 840aattaggaga cttatatatt gtttaatctg ttgagataca aaaaattata ttgttcacaa 900gtggatgaag atgattgtgg aatcgcagct ttgaatatga tttttaaaaa ttttggttcc 960gaatattcac tatcaaaatt gcgattctta gcaaaaacca gtcaacaagg gactactatt 1020tttggactga taaaggctgc agaggaacta aatttagaag cgaatgcatt acaagctgat 1080atgggcatct ttaaagatga aaatttaatg ctaccaatca ttgcacatgt tttaaagcaa 1140ggaaaagttc tgcattacta cgttgtattt gatgtttcga aagacttttt aattattggt 1200gacccagacc caacaatagg aattacggaa atctccaaaa aggattttga aaatgaatgg 1260acgggtaatt tcataacatt ttcaaaagga aagaactttg tttcagagaa gcagagaaat 1320aacagtttac tcaagtttat tcctattttg agacagcaaa aatccctaat attctggata 1380gctttcgccg caatactatt gatgataatt agtattgcag gatcactttt tttagaacaa 1420cttgtagata tatatatacc acacaaaaat atggatacat tggggattat ctcgatttgc 1500ttaattggag cctatctttt acaggccgta atgacgtatt ttcagaattt tttactaact 1560atatttggac aaaatctttc tagaaaaatt attttaaatt atattaatca cctttttgaa 1620ttacccatgt ctttcttctc aacacgtaga gttggcgaaa tagtctctcg gtttacagat 1680gcaagcaaga ttatagatgc tttggcaagt acgattttga ctctcttttt agatgtttgg 1740atgttggtta caatctcaat cgttctcgta tttttaaata caaagttatt tatgatttct 1800ctggtatcta taccggtgta ctcagttata atttatgcgt ttaaaaatac atttaatggc 1860ctgaaccata aatcaatgga aaatgcagca ttattgaatt ctgcaataat cgaaaacgta 1920actggcatag aaactgtaaa atcattaact tcagaagaat tttcctacaa tcaaatcact 1980gatagattcg aaaattttct taacagttcc ttacggtata cgatagctga ccaaggacag 2040ca2042<210>10<211>20<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>10aartattatg gnaayggngt 20<210>11<211>20<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>11acatgatgnc cnccrttngc20<210>12<211>37<212>PRT<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>12Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Asn Ser His Gly Cys Ser Val 1 5 10 15Asn Trp Gly Gln Ala Trp Thr Cys Gly Val Asn His Leu Ala Asn Gly
20 25 30Gly His Gly Val Cys
35<210>13<211>2214<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<220><221>CDS<222>(20)..(2200)<400>13aaattaggag acttatata ttg ttt aat ctg ttg aga tac aaa aaa tta tat 52
Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr
1 5 10tgt tca caa gtg gat gaa gat gat tgt gga atc gca gct ttg aat atg 100Cys Ser Gln Val Asp Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met
15 20 25att ttt aaa aat ttt ggt tcc gaa tat tca cta tca aaa ttg cga ttc 148Ile Phe Lys Asn Phe Gly Ser Glu Tyr Ser Leu ger Lys Leu Arg Phe
30 35 40tta gca aaa acc agt caa caa ggg act act att ttt gga ctg ata aag 196Leu Ala Lys Thr Ser Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys
45 50 55gct gca gag gaa cta aat tta gaa gcg aat gca tta caa gct gat atg 244Ala Ala Glu Glu Leu Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met 60 65 70 75ggc atc ttt aaa gat gaa aat tta atg cta cca atc att gca cat gtt 292Gly Ile Phe Lys Asp Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val
80 85 90tta aag caa gga aaa gtt ctg cat tac tac gtt gta ttt gat gtt tcg 340Leu Lys Gln Gly Lys Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser
95 100 105aaa gac ttt tta att att ggt gac cca gac cca aca ata gga att acg 388Lys Asp Phe Leu Ile Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr
110 115 120gaa atc tcc aaa aag gat ttt gaa aat gaa tgg acg ggt aat ttc ata 436Glu Ile Ser Lys Lys Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile
125 130 135aca ttt tca aaa gga aag aac ttt gtt tca gag aag cag aga aat aac 484Thr Phe Ser Lys Gly Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn140 145 150 155agt tta ctc aag ttt att cct att ttg aga cag caa aaa tcc cta ata 532Ser Leu Leu Lys Phe Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile
160 165 170ttc tgg ata gct ttc gcc gca ata cta ttg atg ata att agt att gca 580Phe Trp Ile Ala Phe Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala
175 180 185gga tca ctt ttt tta gaa caa ctt gta gat ata tat ata cca cac aaa 628Gly Ser Leu Phe Leu Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys
190 195 200aat atg gat aca ttg ggg att atc tcg att tgc tta att gga gcc tat 676Asn Met Asp Thr Leu Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr
205 210 215ctt tta cag gcc gta atg acg tat ttt cag aat ttt tta cta act ata 724Leu Leu Gln Ala Val Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile220 225 230 235ttt gga caa aat ctt tct aga aaa att att tta aat tat att aat cac 772Phe Gly Gln Asn Leu Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His
240 245 250ctt ttt gaa tta ccc atg tct ttc ttc tca aca cgt aga gtt ggc gaa 820Leu Phe Glu Leu Pro Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu
255 260 265ata gtc tct cgg ttt aca gat gca agc aag att ata gat gct ttg gca 868Ile Val Ser Arg Phe Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala
270 275 280agt acg att ttg act ctc ttt tta gat gtt tgg atg ttg gtt aca atc 916Ser Thr Ile Leu Thr Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile
285 290 295tca atc gtt ctc gta ttt tta aat aca aag tta ttt atg att tct ctg 964Ser Ile Val Leu Val Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu300 305 310 315gta tct ata ccg gtg tac tca gtt ata att tat gcg ttt aaa aat aca 1012Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr
320 325 330ttt aat ggc ctg aac cat aaa tca atg gaa aat gca gca tta ttg aat 1060Phe Asn Gly Leu Asn His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn
335 340 345tct gca ata atc gaa aac gta act ggc ata gaa act gta aaa tca tta 1108Ser Ala Ile Ile Glu Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu
350 355 360act tca gaa gaa ttt tcc tac aat caa atc act gat aga ttc gaa aat 1156Thr Ser Glu Glu Phe Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn
365 370 375ttt ctt aac agt tcc tta cgg tat acg ata gct gac caa gga cag caa 1204Phe Leu Asn Ser Ser Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln Gln380 385 390 395gct tta aaa gtg ggt ttg aag cta att ctt ata gtc ttt atc tta tgg 1252Ala Leu Lys Val Gly Leu Lys Leu Ile Leu Ile Val Phe Ile Leu Trp
400 405 410gct gga gca atc caa gtt atg agg ggg aat ctc aca gtc gga aga tta 1300Ala Gly Ala Ile Gln Val Met Arg Gly Asn Leu Thr Val Gly Arg Leu
415 420 425ttg gct ttt aat gct tta gta aca tac ttt tta aat ccc tta gag aat 1348Leu Ala Phe Asn Ala Leu Val Thr Tyr Phe Leu Asn Pro Leu Glu Asn
430 435 440att att aat tta caa cca aag cta caa act gca aga gtc gct aat att 1396Ile Ile Asn Leu Gln Pro Lys Leu Gln Thr Ala Arg Val Ala Asn Ile
445 450 455aga cta aat gaa gta tta tta gtg gat tct gag ttt aat agg ggg gga 1444Arg Leu Asn Glu Val Leu Leu Val Asp Ser Glu Phe Asn Arg Gly Gly460 465 470 475cgc gac agc tca aca aac tta aat ggg gat atc gta ttt caa gat gta 1492Arg Asp Ser Ser Thr Asn Leu Asn Gly Asp Ile Val Phe Gln Asp Val
480 485 490gaa ttt agt tat ggt tac gga tcg aac gta ttg cac aac atc aat ata 1540Glu Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Ser Asn Val Leu His Asn Ile Asn Ile
495 500 505aaa ata caa aag aat agt agt aca acg att gtt ggt atg agc ggt tct 1588Lys Ile Gln Lys Asn Ser Ser Thr Thr Ile Val Gly Met Ser Gly Ser
510 515 520ggg aaa tcc aca tta gca aaa tta atg gtt ggt ttc tat caa gcc gga 1636Gly Lys Ser Thr Leu Ala Lys Leu Met Val Gly Phe Tyr Gln Ala Gly
525 530 535tca gga caa ata tta tta aat ggt aaa tta atc gat aac att gat cgt 1684Ser Gly Gln Ile Leu Leu Asn Gly Lys Leu Ile Asp Asn Ile Asp Arg540 545 550 555cat gcc ctg aga caa tcg att acg tat gta cca cag gaa ccg gta atg 1732His Ala Leu Arg Gln Ser Ile Thr Tyr Val Pro Gln Glu Pro Val Met
560 565 570ttc gca ggt aca att tta gaa aat ctt att atg cag aat aaa aga aat 1780Phe Ala Gly Thr Ile Leu Glu Asn Leu Ile Met Gln Asn Lys Arg Asn
575 580 585tta tct att gat aaa gtg aaa gag gca tgt agg ata gcc gaa att gat 1828Leu Ser Ile Asp Lys Val Lys Glu Ala Cys Arg Ile Ala Glu Ile Asp
590 595 600aaa gat ata gaa aat ttt cct atg ggg tat gat aca gat att tcc gaa 1876Lys Asp Ile Glu Asn Phe Pro Met Gly Tyr Asp Thr Asp Ile Ser Glu
605 610 615cat ggg agt tca atc tca gta ggt caa aaa caa aga ctt tct att gca 1924His Gly Ser Ser Ile Ser Val Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ser Ile Ala620 625 630 635aga tca ctg ctg aca gag tct aat gtt tta ctg ttt gat gaa tca acc 1972Arg Ser Leu Leu Thr Glu Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp Glu Ser Thr
640 645 650agt agt ttg gac act att act gag cag cga ata att gaa aac cta ttg 2020Ser Ser Leu Asp Thr Ile Thr Glu Gln Arg Ile Ile Glu Asn Leu Leu
655 660 665aat tta aat gac aaa aca tta ata ttc gtt gca cat cga ttg tca gtt 2068Asn Leu Asn Asp Lys Thr Leu Ile Phe Val Ala His Arg Leu Ser Val
670 675 680gct aag caa act gaa aat att atc gtt atg gat cac ggt gga att gtt 2116Ala Lys Gln Thr Glu Asn Ile Ile Val Met Asp His Gly Gly Ile Val
685 690 695gaa aca ggt tcg cat gat aaa tta ata ttg gaa aat gga tat tat aaa 2164Glu Thr Gly Ser His Asp Lys Leu Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Tyr Lys700 705 710 715gaa tta tgt act gtg aag acg aag aaa aaa gaa ttt tagataaaac aaaa 2214Glu Leu Cys Thr Val Lys Thr Lys Lys Lys Glu Phe
720 725<210>14<211>727<212>PRT<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>14Leu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr Cys Ser Gln Val Asp 1 5 10 15Glu Asp Asp Cys Gly Ile Ala Ala Leu Asn Met Ile Phe Lys Asn Phe
20 25 30Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Arg Phe Leu Ala Lys Thr Ser
35 40 45Gln Gln Gly Thr Thr Ile Phe Gly Leu Ile Lys Ala Ala Glu Glu Leu
50 55 60Asn Leu Glu Ala Asn Ala Leu Gln Ala Asp Met Gly Ile Phe Lys Asp 65 70 75 80Glu Asn Leu Met Leu Pro Ile Ile Ala His Val Leu Lys Gln Gly Lys
85 90 95Val Leu His Tyr Tyr Val Val Phe Asp Val Ser Lys Asp Phe Leu Ile
100 105 110Ile Gly Asp Pro Asp Pro Thr Ile Gly Ile Thr Glu Ile Ser Lys Lys
115 120 125Asp Phe Glu Asn Glu Trp Thr Gly Asn Phe Ile Thr Phe Ser Lys Gly
130 135 140Lys Asn Phe Val Ser Glu Lys Gln Arg Asn Asn Ser Leu Leu Lys Phe145 150 155 160Ile Pro Ile Leu Arg Gln Gln Lys Ser Leu Ile Phe Trp Ile Ala Phe
165 170 175Ala Ala Ile Leu Leu Met Ile Ile Ser Ile Ala Gly Ser Leu Phe Leu
180 185 190Glu Gln Leu Val Asp Ile Tyr Ile Pro His Lys Asn Met Asp Thr Leu
195 200 205Gly Ile Ile Ser Ile Cys Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Val
210 215 220Met Thr Tyr Phe Gln Asn Phe Leu Leu Thr Ile Phe Gly Gln Asn Leu225 230 235 240Ser Arg Lys Ile Ile Leu Asn Tyr Ile Asn His Leu Phe Glu Leu Pro
245 250 255Met Ser Phe Phe Ser Thr Arg Arg Val Gly Glu Ile Val Ser Arg Phe
260 265 270Thr Asp Ala Ser Lys Ile Ile Asp Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Thr
275 280 285Leu Phe Leu Asp Val Trp Met Leu Val Thr Ile Ser Ile Val Leu Val
290 295 300Phe Leu Asn Thr Lys Leu Phe Met Ile Ser Leu Val Ser Ile Pro Val305 310 315 320Tyr Ser Val Ile Ile Tyr Ala Phe Lys Asn Thr Phe Asn Gly Leu Asn
325 330 335His Lys Ser Met Glu Asn Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Ile Ile Glu
340 345 350Asn Val Thr Gly Ile Glu Thr Val Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Phe
355 360 365Ser Tyr Asn Gln Ile Thr Asp Arg Phe Glu Asn Phe Leu Asn Ser Ser
370 375 380Leu Arg Tyr Thr Ile Ala Asp Gln Gly Gln Gln Ala Leu Lys Val Gly385 390 395 400Leu Lys Leu Ile Leu Ile Val Phe Ile Leu Trp Ala Gly Ala Ile Gln
405 410 415Val Met Arg Gly Asn Leu Thr Val Gly Arg Leu Leu Ala Phe Asn Ala
420 425 430Leu Val Thr Tyr Phe Leu Asn Pro Leu Glu Asn Ile Ile Asn Leu Gln
435 440 445Pro Lys Leu Gln Thr Ala Arg Val Ala Asn Ile Arg Leu Asn Glu Val
450 455 460Leu Leu Val Asp Ser Glu Phe Asn Arg Gly Gly Arg Asp Ser Ser Thr465 470 475 480Asn Leu Asn Gly Asp Ile Val Phe Gln Asp Val Glu Phe Ser Tyr Gly
485 490 495Tyr Gly Ser Asn Val Leu His Asn Ile Asn Ile Lys Ile Gln Lys Asn
500 505 510Ser Ser Thr Thr Ile Val Gly Met Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu
515 520 525Ala Lys Leu Met Val Gly Phe Tyr Gln Ala Gly Ser Gly Gln Ile Leu
530 535 540Leu Asn Gly Lys Leu Ile Asp Asn Ile Asp Arg His Ala Leu Arg Gln545 550 555 560Ser Ile Thr Tyr Val Pro Gln Glu Pro Val Met Phe Ala Gly Thr Ile
565 570 575Leu Glu Asn Leu Ile Met Gln Asn Lys Arg Asn Leu Ser Ile Asp Lys
580 585 590Val Lys Glu Ala Cys Arg Ile Ala Glu Ile Asp Lys Asp Ile Glu Asn
595 600 605Phe Pro Met Gly Tyr Asp Thr Asp Ile Ser Glu His Gly Ser Ser Ile
610 615 620Ser Val Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ser Ile Ala Arg Ser Leu Leu Thr625 630 635 640Glu Ser Asn Val Leu Leu Phe Asp Glu Ser Thr Ser Ser Leu Asp Thr
645 650 655Ile Thr Glu Gln Arg Ile Ile Glu Asn Leu Leu Asn Leu Asn Asp Lys
660 665 670Thr Leu Ile Phe Val Ala His Arg Leu Ser Val Ala Lys Gln Thr Glu
675 680 685Asn Ile Ile Val Met Asp His Gly Gly Ile Val Glu Thr Gly Ser His
690 695700Asp Lys Leu Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Tyr Lys Glu Leu Cys Thr Val705 710 715 720Lys Thr Lys Lys Lys Glu Phe
725<210>15<211>3055<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>15agcttcggga ttcttagcta tatcaatttt gctataaact tgggaaagaa cgtcaataat 60atcgagtaat tcactggatt ttacaggacg cttttctagt aagtgcaaga gagcttcgat 120gttgttttta gattcagttt taatattgtc tttgtttgcc attttaatca cgtctccttt 180tttatagtaa taaaaaaaac acaattaaat tagtgctttt ttatctggta attaacaaac 240tccatgaccg ccattagcta gatggtttac tccacaagtc catgcttgcc cccaatttac 300tgaacagccg tgagagttac agctaacgcc attaccatag tatttaccac ctgtaataga 360tttcatttct tgaattgtta ggctttttgc gtttttcata aagaacatct ccaaattata 420ttttttagtg attcttgaag ttctgttgta acgcagaatt ttggaagaat gagtacttgt 480tagaaatttg ccgatttaaa taattaacaa accccatgac cgccattagc tagatgattt 540accccacaag tccatgcttg cccccaattt actgaacaac catgagagtt acagctaaca 600ccattaccat agtatttacc acctgtgatg gattttattt cttggatcgt taagctacgt 660gtattcttca ttttgaatac ctcctgttaa ataattttta cacgatcagt gtagttctaa 720tgtgaaattg tgtcaagttt agcaaatata tattttaggc atggaaaaac ttgcttttaa 780ttcgacttga ctataacggt ataatactgg tattactata tttgtttagc ttcacaaaaa 840aattaggaga cttatatatt gtttaatctg ttgagataca aaaaattata ttgttcacaa 900gtggatgaag atgattgtgg aatcgcagct ttgaatatga tttttaaaaa ttttggttcc 960gaatattcac tatcaaaatt gcgattctta gcaaaaacca gtcaacaagg gactactatt 1020tttggactga taaaggctgc agaggaacta aatttagaag cgaatgcatt acaagctgat 1080atgggcatct ttaaagatga aaatttaatg ctaccaatca ttgcacatgt tttaaagcaa 1140ggaaaagttc tgcattacta cgttgtattt gatgtttcga aagacttttt aattattggt 1200gacccagacc caacaatagg aattacggaa atctccaaaa aggattttga aaatgaatgg 1260acgggtaatt tcataacatt ttcaaaagga aagaactttg tttcagagaa gcagagaaat 1320aacagtttac tcaagtttat tcctattttg agacagcaaa aatccctaat attctggata 1380gctttcgccg caatactatt gatgataatt agtattgcag gatcactttt tttagaacaa 1440cttgtagata tatatatacc acacaaaaat atggatacat tggggattat ctcgatttgc 1500ttaattggag cctatctttt acaggccgta atgacgtatt ttcagaattt tttactaact 1560atatttggac aaaatctttc tagaaaaatt attttaaatt atattaatca cctttttgaa 1620ttacccatgt ctttcttctc aacacgtaga gttggcgaaa tagtctctcg gtttacagat 1680gcaagcaaga ttatagatgc tttggcaagt acgattttga ctctcttttt agatgtttgg 1740atgttggtta caatctcaat cgttctcgta tttttaaata caaagttatt tatgatttct 1800ctggtatcta taccggtgta ctcagttata atttatgcgt ttaaaaatac atttaatggc 1860ctgaaccata aatcaatgga aaatgcagca ttattgaatt ctgcaataat cgaaaacgta 1920actggcatag aaactgtaaa atcattaact tcagaagaat tttcctacaa tcaaatcact 1980gatagattcg aaaattttct taacagttcc ttacggtata cgatagctga ccaaggacag 2040caagctttaa aagtgggttt gaagctaatt cttatagtct ttatcttatg ggctggagca 2100atccaagtta tgagggggaa tctcacagtc ggaagattat tggcttttaa tgctttagta 2160acatactttt taaatccctt agagaatatt attaatttac aaccaaagct acaaactgca 2220agagtcgcta atattagact aaatgaagta ttattagtgg attctgagtt taataggggg 2280ggacgcgaca gctcaacaaa cttaaatggg gatatcgtat ttcaagatgt agaatttagt 2340tatggttacg gatcgaacgt attgcacaac atcaatataa aaatacaaaa gaatagtagt 2400acaacgattg ttggtatgag cggttctggg aaatccacat tagcaaaatt aatggttggt 2460ttctatcaag ccggatcagg acaaatatta ttaaatggta aattaatcga taacattgat 2520cgtcatgccc tgagacaatc gattacgtat gtaccacagg aaccggtaat gttcgcaggt 2580acaattttag aaaatcttat tatgcagaat aaaagaaatt tatctattga taaagtgaaa 2640gaggcatgta ggatagccga aattgataaa gatatagaaa attttcctat ggggtatgat 2700acagatattt ccgaacatgg gagttcaatc tcagtaggtc aaaaacaaag actttctatt 2760gcaagatcac tgctgacaga gtctaatgtt ttactgtttg atgaatcaac cagtagtttg 2820gacactatta ctgagcagcg aataattgaa aacctattga atttaaatga caaaacatta 2880atattcgttg cacatcgatt gtcagttgct aagcaaactg aaaatattat cgttatggat 2940cacggtggaa ttgttgaaac aggttcgcat gataaattaa tattggaaaa tggatattat 3000aaagaattat gtactgtgaa gacgaagaaa aaagaatttt agataaaaca aaaac 3055<210>16<211>17<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>16ccttggtcag gctatcg17<210>17<211>20<212>DNA<213>清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)<400>17atcacctttt tgaattaccc 20
權(quán)利要求
1.分離多肽，特征為它是由清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)2512衍生的、稱為sakacin G的細(xì)菌素。
2.依照權(quán)利要求1的分離多肽，特征為它是IIa型細(xì)菌素。
3.分離多肽，特征為它包含SEQ ID NO2和/或SEQ ID NO4。
4.分離多肽，特征為它包含SEQ ID NO12。
5.核酸，特征為它包含編碼依照權(quán)利要求1-4之任一的多肽的核苷酸序列。
6.依照權(quán)利要求5的核酸，特征為它包含SEQ ID NO1和/或SEQID NO3。
7.依照權(quán)利要求5或6的核酸，特征為它包含核酸序列SEQ ID NO15。
8.依照權(quán)利要求5或6的核酸，特征為它包含核酸序列SEQ ID NO9。
9.分離多肽，特征為它包含SEQ ID NO6。
10.分離多肽，特征為它包含SEQ ID NO8。
11.分離多肽，特征為它包含SEQ ID NO14。
12.包含SEQ ID NO5的核酸。
13.包含SEQ ID NO7的核酸。
14.包含SEQID NO13的核酸。
15.包含依照權(quán)利要求5-8、12或14之任一項(xiàng)的核酸的克隆和/或表達(dá)載體。
16.經(jīng)依照權(quán)利要求15的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
17.依照權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，特征為它是選自下組的微生物乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)，或者它是酵母。
18.重組多肽的生產(chǎn)方法，其中將包含依照權(quán)利要求5-8、12或14之任一項(xiàng)的核酸的載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，并將其在容許表達(dá)依照權(quán)利要求1-4或9-11之任一項(xiàng)的多肽或由權(quán)利要求5-8、12或14之任一中定義的核酸序列編碼的多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
19.依照權(quán)利要求1-4之任一的多肽在食品制作中作為抗致病或非期望菌群的活性劑的用途。
20.依照權(quán)利要求19的用途，特征為將所述多肽用于在食品中抑制李斯特菌(Listeria)、尤其是單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的生長(zhǎng)和繁殖。
21.依照權(quán)利要求19或20的用途，特征為在食品中由菌株清酒乳桿菌2512生成所述多肽。
22.菌株清酒乳桿菌2512在食品中用于生成依照權(quán)利要求1-4之任一的細(xì)菌素多肽的用途。
23.細(xì)菌素組合物，特征為它包含至少一種依照權(quán)利要求1-4之任一的多肽或菌株清酒乳桿菌2512。
全文摘要
本發(fā)明涉及由清酒乳桿菌(Lactobacillussake)2512衍生的分離多肽，即稱為Sakacine G的細(xì)菌素。本發(fā)明還涉及編碼所述細(xì)菌素的核酸，以及所述多肽在食品制作中作為抗致病和非期望菌群的活性劑的用途。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1436238SQ0181125
公開日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2001年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月29日
發(fā)明者J－M·博杰奧德, C·弗利茅克斯, Y·塞納蒂姆伯, L·希曼 申請(qǐng)人:羅狄亞化學(xué)公司