專利名稱：細菌素和新的細菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用新的產(chǎn)細菌素產(chǎn)乳酸細菌和/或由這些菌種產(chǎn)生的新細菌素控制動物、特別是家禽中的疾病。本發(fā)明還涉及新細菌素，所述新細菌素的氨基酸序列，以及產(chǎn)生所述新細菌素的產(chǎn)乳酸細菌菌株。進一步地，本發(fā)明涉及含有所述新細菌素和/或產(chǎn)生它們的產(chǎn)乳酸細菌的菌株的治療組合物，以及所述治療組合物的用途。
背景技術(shù)：
食用未正確處理的家禽產(chǎn)品已經(jīng)導(dǎo)致人的腸疾病。早已認識到沙門氏菌(Salmonella spp.)是這類疾病的致病菌,近來認識到彎曲桿菌(Campylobacter spp.),特別是空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)也被牽連其中。這兩種微生物可以定植于家禽的胃腸道中，而對這些鳥類沒有任何有害效果，雖然一些已被定植的鳥類可以被檢測到，但無癥狀的帶菌者可以在生產(chǎn)和處理過程中自由傳播這些微生物，導(dǎo)致進一步感染活的鳥類和尸體。家禽在食物供應(yīng)中作為沙門氏菌和彎曲桿菌的原始貯主(Jones等，JournalofFood卩1*(^6(^丨011(食品保護雜志)，第54卷，吣.7，502-507，1991年7月)。在養(yǎng)成生產(chǎn)期間預(yù)防在活家禽中的定植可以消除家禽污染的問題。許多因素促成細菌在動物消化道內(nèi)的定植和繼續(xù)存在。這些因素已被Savage (Progress in Food and Nutrition Science (食品和營養(yǎng)科學(xué)進展)，第 7 卷，65-74,1983)詳盡地評述。在這些因素中所包括的是(I)胃酸度(Gilliland，JournalofFood Production(食品生產(chǎn)雜志)，第 42 卷，164-167,1979) ； (2)膽汁鹽(Sharpe 和Mattick, Milchwissenschaft, 第 12 卷，348-349,1967 ；Floch 等，American Journalof Clinical Nutrition (美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志)，第 25 卷，1418-1426，1972 ;Lewis 和Gorbach, Archives of Internal Medicine (內(nèi)科學(xué)檔案)，第 130 卷，545-549,1972 ；Gilliland 和 Speck, Journal of Food Protection (食品保護雜志)，第 40 卷，820-823,1977) ;Hugdahl 等,Infection and Immunity (感染和免疫)，第 56 卷，1560-1566,1988)；(3)螺動；(4)消化酶(Marmur, Journal ofMolecular Biology (分子生物學(xué)雜志)，第 3 卷，208-218,1961) ； (5)免疫反應(yīng)；和(6)本源微生物(indigenous microorganism)以及它們產(chǎn)生的抗菌化合物。前四種因素取決于宿主的表現(xiàn)型，可能不是實際上可控的變量。胃腸(GD道的免疫反應(yīng)不易調(diào)節(jié)。涉及本源微生物及其代謝物的因素取決于GI道的正常菌群?？刂茝澢鷹U菌和/或沙門氏菌的定植的一種可能的方法是通過使用競爭性排斥(CE) ο Nurmi 和 Rantala (Nature (自然)，第 241 卷，210-211,1973)證明通過將來自健康家禽腸內(nèi)物質(zhì)的細菌管飼給微生物群落還沒有建成的年幼的雛雞(chick)抵抗沙門氏菌定植，有效控制沙門氏菌的感染。給雛雞施用不確定的CE制備物加速新孵出鳥類的消化道菌群的成熟，并提供由成年雌禽向其后代傳送微生物群落的自然過程的替代者。實驗室和現(xiàn)場實驗的結(jié)果提供通過給雛雞施用正常微生物群落控制彎曲桿菌的優(yōu)點的證據(jù)；降低的鳥群受彎曲桿菌感染的頻率(Mulder和Bolder, IN !Colonization Control ofhuman bacterial enteropathogens in poultry(家禽中人細菌性腸道病原體的定植控制);L. C. Blankenship (編)，Academic Press,加利福尼亞圣地亞哥，359-363,1991)以及降低的被定植的鳥類的糞便中空腸彎曲桿菌(C. jejuni)水平已有報道(Stern, PoultryScience (家禽科學(xué))，第 73 卷，402-407，1994)。Schoeni 和 Wong (AppI. Environ. Microbiol.，第 60 卷，1191-1197,1994)報道了通過應(yīng)用碳水化合物添加劑和三種已被鑒定的拮抗劑(差異朽1檬酸桿菌(Citrobacterdiversus) 22,克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) 23 和大腸桿菌(Escherichiacoli) 25)顯著減少了肉仔雞(broiler)中空腸彎曲桿菌的定植。也有在用嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)和幾鏈球菌(Streptococcus faecium)的家禽分離培養(yǎng)物治療以后，感染肉仔雞的腸內(nèi)樣品中空腸彎曲桿菌顯著減少的證據(jù)(Morishita等，AvianDiseases (禽類疾病)，第 41 卷，850-855，1997)。 Snoeyenbos等(美國專利No. 4, 335, 107,1982年6月)通過凍干糞便并厭氧培養(yǎng)這種制備物開發(fā)了預(yù)防沙門氏菌定植的競爭性排斥(CE)微生物群落技術(shù)。Mikola等(美國專利No. 4，657，762，1987年4月)用腸道糞便和盲腸內(nèi)容物作為CE微生物群落源用于預(yù)防沙門氏菌定植。Stern等(美國專利No. 5，451，400，1995年9月和美國專利6，241，335，2001年4月)公開一種粘膜CE組合物以保護家禽和家畜抵抗沙門氏菌和彎曲桿菌的定植，其中預(yù)先洗滌的盲腸的粘蛋白層被刮下，被刮下的刮屑保持在無氧環(huán)境中，進行厭氧培養(yǎng)。Nisbet等(美國專利No. 5，478，557，1996年12月)公開了一種確定的益生菌(probiotic)，其可以得自各種家養(yǎng)動物，其是通過連續(xù)培養(yǎng)直接來自成年目標(biāo)動物的糞便，盲腸和/或大腸內(nèi)容物的分批培養(yǎng)物獲得的。微生物產(chǎn)生多種證明有抗細菌性質(zhì)的化合物。一類這樣的化合物，細菌素，由殺菌蛋白組成，其作用機制類似于離子載體抗生素。細菌素通常具有抵抗與其產(chǎn)生者密切相關(guān)的菌種的活性。它們在由復(fù)雜微生物種群，例如腸道，口腔或其他上皮表面分離出的細菌菌種中的廣泛存在表明細菌素可能在細菌生態(tài)系統(tǒng)的種群動態(tài)方面具有調(diào)節(jié)作用。細菌素被定義為由細菌產(chǎn)生的具有生物活性蛋白部分和殺菌作用的化合物(Tagg等，Bacteriological Reviews (細菌學(xué)評論),第 40 卷,722-256,1976)。其他特性包括(I)窄譜抑制活性，集中于密切相關(guān)的菌種；(2)與特定的細胞受體結(jié)合；以及(3)質(zhì)粒攜帶細菌素產(chǎn)生和宿主細胞細菌素免疫性的遺傳決定簇。不完全確定的拮抗性物質(zhì)被稱為“細菌素樣物質(zhì)”。一些有效對抗革蘭氏陽性細菌、相反不對抗革蘭氏陰性細菌的細菌素，具有較廣譜的活性。已有建議術(shù)語細菌素，當(dāng)用于描述由革蘭氏陽性細菌產(chǎn)生的抑制劑時，應(yīng)滿足(I)是一種肽和(2)具有殺菌活性的最低標(biāo)準(zhǔn)(Tagg等，同上)。乳酸細菌是最重要的益生菌微生物之一。它們是革蘭氏陽性的，不產(chǎn)生孢子的，過氧化氫酶陰性的缺乏細胞色素的生物。它們是厭氧但耐氧的、有復(fù)雜營養(yǎng)要求的、耐酸的以及嚴(yán)格可發(fā)酵的，并以乳酸作為糖發(fā)酵的主要終產(chǎn)物。乳酸產(chǎn)生細菌包括乳酸桿菌(Lactobacillus)菌種，雙歧桿菌(Bifidobacterium)菌種，幾腸球菌(Enterococcusfaecalis),屎腸球菌(Enterococcus faecium),乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis),腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),嗜酸芽抱乳酸菌(SPorolactobacillus inulinus),嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)等。這些 菌種在其中廣泛存在細菌素方面是受到特別關(guān)注的,也廣泛應(yīng)用于發(fā)酵奶、食品和肉加工工業(yè)中。它們在食品的保存和風(fēng)味特征中的作用已有詳盡記載。大部分由這些菌種產(chǎn)生的細菌素僅僅具有抵抗其他乳酸細菌的活性，但有幾種顯示出對較大種系差異的革蘭氏陽性細菌以及，在特定條件下，對革蘭氏陰性細菌的抗菌活性。乳酸桿菌已被廣泛研究其拮抗劑的產(chǎn)生。其中包括充分定性的細菌素(DeKlerk，1967 ；Upreti和 Hinsdill 1975 ；Barefoot 和 Klaenhammer 1983 ;Joerger 和 Klaenhammer1986);可能的細菌素樣物質(zhì)(Vincent et al. , 1959),和其他與細菌素不必然相關(guān)的拮抗劑(Vakil 和 Shahni 1965 ;Hamdan 和 Mikolaj cik 1974 ；Mikolaj cik 和 Hamdan 1975;以及 Shahni 等，1976)。Klaenhammer(1993)將當(dāng)時所知的乳酸細菌細菌素分為四個主要類別第I類-羊毛硫抗生素(Lantibiotics)，其是< 5kDa的小肽,含有不常見的氨
基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸。它們受到特別關(guān)注是因為它們具有相對于其他細菌素而言非常廣譜的活性。實例包括Nisin, Nisin Z, carnocin U149, lacticin481,和lactocin5。第II類——小的不含羊毛硫氨酸的肽一類非均質(zhì)的< IOkDa的小肽。這一類包括具有抵抗李斯特氏菌(Listeria spp.)的活性的肽。第III類-大的熱不穩(wěn)定的> 30kDa的蛋白質(zhì)。實例是Helveticin。第IV類——含有額外部分例如脂類和碳水化合物的復(fù)雜細菌素-蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供含有至少一種產(chǎn)乳酸細菌菌株的新菌株和/或由至少一種新菌株產(chǎn)生的新細菌素的新的組合物；使用所述菌株或細菌素的方法，所述新菌株，所述新細菌素的氨基酸序列，以及使用方法，其均與相關(guān)技術(shù)中的菌株、細菌素和使用方法不同。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供產(chǎn)生新細菌素的乳酸桿菌和腸球菌的新菌株。本發(fā)明的另一個目的是提供鑒定特征為NRRL B-30514的新唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株 PVD32。本發(fā)明的又一個目的是提供鑒定特征為NRRL B-30510的新嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)LWP320。本發(fā)明的又一個目的是提供鑒定特征為NRRL B-30645的新糞腸球菌(Enterococcus faecalis)LWP2I。本發(fā)明的又一個目的是提供鑒定特征為NRRL B-30511的新堅韌腸球菌(Enterococcus durans)菌株 LWP26。本發(fā)明的又一個目的是提供具有選自由NRRL B-30514和NRRL B-30510組成的組的乳酸桿菌菌株的鑒定特征的分離的乳酸桿菌。本發(fā)明的又一個目的是提供具有選自由NRRL B-30645和NRRL B-30511組成的組的乳酸桿菌菌株的鑒定特征的分離的乳酸桿菌。本發(fā)明的另一個目的是提供由乳酸桿菌和腸球菌的新菌株產(chǎn)生的新細菌素。
本發(fā)明的又一個目的是提供具有如SEQ ID NO I所示氨基酸序列的新細菌素0R7。本發(fā)明的又一個目的是提供具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的新細菌素LWP320。本發(fā)明的又一個目的是提供具有如SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的新細菌素LWP21。本發(fā)明的又一個目的是提供具有如SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的新細菌素LWP26。本發(fā)明的另一個目的是提供治療組合物，包括(a)有效量的至少一種分離的細菌素，以至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平，所述的細菌素具有選自NRRL B-30514、NRRL B-30510.NRRL B_30645、NRRL B-30511、和其混合物組成的組的菌株的鑒定特征的產(chǎn) 乳酸細菌菌株產(chǎn)生；和(b)適當(dāng)?shù)闹委熭d體。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述細菌素具有選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或其混合物組成的組的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供用于動物的治療飼料，包括(a)有效量的至少一種分離的細菌素，以至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平，所述的細菌素具有選自由NRRLB-30514、NRRL B-30510、NRRL B-30511、NRRL B-30645和其混合物組成的組的菌株的鑒定特征的產(chǎn)乳酸細菌菌株產(chǎn)生，(b)治療載體，和(c)動物飼料。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述至少一種細菌素具有選自由SEQ ID NO USEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4和其混合物組成的組的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供用于動物的治療飼料，包括(a)有效量的細菌素，以至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平，所述細菌素具有選自由NRRL B-30510、NRRLB-30514和其混合物組成的組的乳酸桿菌菌株的鑒定特征的乳酸桿菌菌株產(chǎn)生，(b)治療載體，和(c)動物飼料。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述細菌素具有選自由SEQ IDNOI和SEQ ID NO 2組成的組的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供用于動物的治療組合物，包括(a)有效量的至少一種分離的細菌素，以至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平，所述細菌素具有選自由NRRLB-30511、NRRL B-30645和其混合物組成的組的腸球菌菌株的鑒定特征的腸球菌菌株產(chǎn)生，(b)治療載體，和(c)動物飼料。本發(fā)明的另一個目的是提供至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包含至少一種產(chǎn)新細菌素的乳酸桿菌或腸球菌的新菌株，至少一種由乳酸桿菌或腸球菌的新菌株產(chǎn)生的新細菌素，或者所述新菌株和/或新細菌素的組合的治療組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供至少減低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包含特征為NRRL保藏號B-30514和B-30510的乳酸桿菌；鑒別特征為NRRL B-30511和NRRL B-30645的腸球菌；和其混合物的新菌株的治療組合物。本發(fā)明的又一個目的是提供至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包含至少一種鑒別特征為NRRL B-30510, NRRL B-30511,NRRL30514, NRRL B-30645，和其混合物的新菌株；至少一種具有如SEQ ID NO K SEQ IDN02、SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4所示氨基酸序列，和其混合物的細菌素；或新菌株和新細菌素的組合的治療組合物。本發(fā)明的又一個目的是提供至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包含具有如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的新細菌素的治療組合物。本發(fā)明的又一個目的是提供至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包含具有如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的新細菌素的治療組合物。本發(fā)明的又一個目的是提供至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包含具有如SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的新細菌素的治療組合物。 本發(fā)明的又一個目的是提供至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包含具有如SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的新細菌素的治療組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植水平的方法，其是通過給所述動物施用包括具有鑒別特征為NRRL B-30510或NRRL B-30514的乳酸桿菌細菌新菌株；具有鑒別特征為NRRL B-30511或NRRL B-30645的腸球菌新菌株，和其混合物產(chǎn)生的細菌素的治療組合物。 本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點根據(jù)下述說明將變得明顯。微牛物的保藏唾液乳酸桿菌，標(biāo)明為NRRL B-30514(菌株P(guān)VD32)，嗜酸乳酸桿菌標(biāo)明為NRRLB-30510(菌株LWP320);堅韌腸球菌標(biāo)明為NRRL B-30511 (菌株LWP26)于2001年8月3日保藏，糞腸球菌標(biāo)明為NRRL B-30645(菌株LWP21)于2003年4月I日保藏。所有上述菌株已按照布達佩斯條約的規(guī)定保藏于美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心專利培養(yǎng)物保藏中心(國家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research),1815N. University Street, Peoria,Illinois 61604)。


圖I是SDS-PAGE后對0R7直接檢測的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個條帶具有抗菌活性以及具有活性的條帶的分子量。第I道——6，500-97，000的MMW分子量標(biāo)記(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 97, 000，66，000，43，000，30，000，21，000，14，400 和6，500Da。第2道的條帶——純化的lactocin 0R7，第3道的條帶——被空腸彎曲桿菌吸收后的CAP lactocin 0R7，具有抗菌活性，生長抑制的區(qū)域(見箭頭)，質(zhì)量為大約6，OOODa，第4道的條帶——CAP lactocin 0R7。其他條帶沒有顯示出抗菌活性。圖2是SDS-PAGE后對細菌素LWP320和LWP26直接檢測的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個條帶具有抗菌活性以及具有活性的條帶的分子量。第3道——3，000-43，000 的 LMW分子量標(biāo)記(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 3, 000，11，400，18，000，21，000和43，OOODa。第I道的條帶——細菌素LWP320，第2道的條帶——細菌素LWP26，具有抗菌活性，生長抑制的區(qū)域，質(zhì)量分別為大約6，000和大約3，OOODa0其他條帶沒有顯示出抗菌活性。
圖3是SDS-PAGE后對腸球菌素LWP21直接檢測的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個條帶具有抗菌活性以及活性條帶的分子量。第4道——1060-43, 000的LMW分子量標(biāo)記(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) : 1，060，2，500，3，500，14，400，20，000，30，000和43，OOODa。第I道的條帶(SP-瓊脂糖凝膠后的腸球菌素LWP21)，和第2道的條帶(苯基-瓊脂糖凝膠CL-4B后的第2峰)具有抗菌活性，生長抑制的區(qū)域(見箭頭)，質(zhì)量為大約6，OOODa。第3道的條帶(phenyl-Sepharose CL-4B后的峰)，具有大約3，OOODa的質(zhì)量。其他條帶沒有顯示出抗菌活性。
具體實施例方式腸感染在人中的重要性已經(jīng)被日益充分地認識到，家禽污染和人感染之間的關(guān)系也有詳盡記載。通過干預(yù)家禽加工廠消除這種健康危險的能力也是眾所周知的。在肉仔雞生產(chǎn)和加工過程中，含有病原體的糞便物轉(zhuǎn)移到肉上，并繼續(xù)存在于加工食品的廚房中。
競爭性生物的代謝物可能有助于控制病原體例如空腸彎曲桿菌和沙門氏菌。本發(fā)明的新拮抗菌種從肉仔雞的盲腸和嗉囊粘膜表面分離而來。表征的拮抗物的天然組分是低分子量的肽，細菌素，其具有廣譜的拮抗活性。本發(fā)明提供了新乳酸桿菌和腸球菌菌株，新細菌素，所述細菌素的氨基酸序列，含有所述新細菌素和/或產(chǎn)生它們的菌株的治療組合物，以及使用所述新治療組合物的方法。嗜酸乳酸桿菌LWP320分離菌是兼性厭氧菌(微需氧性細菌)，過氧化氫酶陰性的，革蘭氏陽性的非運動性的多形態(tài)的棒狀細菌，其在MRS瓊脂上在大約37°C延遲生長。當(dāng)在MRS瓊脂上生長時，該分離菌在大約24小時的微需氧培育后產(chǎn)生直徑為大約0. 5mm至大約0.8mm的發(fā)白色的、半透明的菌落。在MRS肉湯中，菌株LWP320只在培養(yǎng)管底部生長。唾液乳酸桿菌PVD32菌株是兼性厭氧菌(微需氧性細菌)，革蘭氏陽性的，過氧化氫酶陰性的，非運動性的，多形態(tài)的棒狀桿菌。菌落在大約37°C微需氧培育大約18-24小時后產(chǎn)生直徑為大約Imm至大約3mm的圓形至規(guī)則形狀的、光滑的、凸面的具有清晰邊緣的菌落。該菌株產(chǎn)生乳酸和H2O2。糞腸球菌LWP21菌種是兼性厭氧菌(微需氧性細菌)，革蘭氏陽性球菌，過氧化氫酶陰性。在MRS瓊脂上在37°C生長延遲。當(dāng)在MRS瓊脂上培養(yǎng)時、該菌株在大約37°C在大約24小時的微需氧培育后產(chǎn)生直徑為大約0. 2mm的發(fā)白色的，半透明的菌落。在大約37°C在大約48小時的微需氧培育后，菌落的直徑為大約1_至大約I. 2_。該菌株在MRS肉湯中僅生長在培養(yǎng)管底部大約2/3體積中。堅韌腸球菌LWP26菌種是兼性厭氧菌(微需氧性細菌)，革蘭氏陽性球菌，過氧化氫酶陰性的，在大約37°C在MRS瓊脂上延遲生長。當(dāng)在MRS瓊脂上生長時，該菌株產(chǎn)生發(fā)白色的、半透明的菌落，并在大約37°C微需氧培育大約24小時后變透明。在大約37°C微需氧培育大約48小時后,菌落大小平均為大約0. 8mm至大約I. Omm0在MRS肉湯中，該菌株生長在管中的全部體積。對分離的乳酸桿菌和腸球菌菌種產(chǎn)生細菌素活性的篩選通過在營養(yǎng)瓊脂上用感興趣的不同目標(biāo)細菌接種的培養(yǎng)物進行。其他檢測菌株在有氧條件下在大約37°C培養(yǎng)大約14-24小時。小腸結(jié)腸炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)和假結(jié)核耶氏菌(Y. pseudotuberculosis)在大約28°C在有氧條件下培養(yǎng)大約14-24小時。抵抗空腸彎曲桿菌的活性的檢測在用空腸彎曲桿菌接種的含有大約5%裂解血液的彎曲桿菌瓊脂上進行。血的使用是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，包括例如羊，馬等。抵抗空腸彎曲桿菌的活性的檢測在大約5% O2，大約10% CO2，和大約85% N2的微量需氧條件下在大約42°C進行大約24-48小時。將大約O. 2ml生理鹽水中懸浮的拮抗細菌平板接種于乳酸桿菌瓊脂上，培育大約24小時。大約O. 5cm3的瓊脂塊被切下并轉(zhuǎn)移到添加有裂解血、大約10mg/ml利福平、大約2. 4U/ml多粘菌素，并接種了大約IO7個空腸彎曲桿菌細胞的布魯氏菌或彎曲桿菌瓊脂上。平板在微量需氧條件下在大約42°C培育大約24-48小時?；钚酝ㄟ^測量生長抑制的區(qū)域來評價。發(fā)現(xiàn)有拮抗性的乳酸桿菌分離菌被評價其細菌素的產(chǎn)生。粗制的抗菌制備物(CAP)通過僅對在需氧條件下在大約37°C在饑餓培養(yǎng)基(starvation medium)上生長大約 18小時的拮抗菌株的培養(yǎng)物進行硫酸銨沉淀來制備，所述的饑餓培養(yǎng)基為
K2HPO46.0 g
KH2PO40.2 g
(NH4) 2SO40.2 g
MgSO40.1 g
葡萄糖9.0 g
組氨酸0.08 g
精氨酸0.02 g加蒸餾水至1000ml，pH值為大約7. 2。然后將培養(yǎng)物流體以大約12，OOOXg離心大約10分鐘。得到的上清然后加入INNaOH調(diào)整pH值至大約6. 2并加入大約130U/ml過氧化氫酶以除去有機酸和過氧化氫，和抑制因子。通過組合進行硫酸銨沉淀、脫鹽色譜和凝膠過濾從上清中分離拮抗肽，得到粗制的抗菌制備物(CAP) ο CAP樣品通過O. 22 μ過濾器(MiIlipore, Bedford, MA, USA)過濾。發(fā)現(xiàn)有拮抗性的腸球菌分離菌被評價其細菌素的產(chǎn)生。粗制的抗菌制備物(CAP)通過僅對在有氧條件下在大約37°C在MRS肉湯中生長大約18小時的拮抗菌株培養(yǎng)物進行硫酸銨沉淀來制備，所述的MRS肉湯為MRS 肉湯 15. Og乳糖0.05g加蒸餾水至大約1000ml，pH 1.2。然后將培養(yǎng)物流體以大約12，OOOXg離心大約10分鐘。得到的上清然后加入INNaOH調(diào)整pH值至大約6. 2并加入大約130U/ml過氧化氫酶以除去有機酸和過氧化氫，和抑制因子。通過組合進行硫酸銨沉淀、脫鹽色譜和凝膠過濾從上清中分離拮抗肽，得到粗制的抗菌制備物(CAP) ο CAP樣品通過0.22 μ過濾器(Mi I lipore, Bedford, MA, USA)過濾。所有上述肽的分子量通過SDS-PAGE電泳確定。所述肽的pi通過等電聚焦確定。氨基酸序列通過Edman降解法使用，例如，491cLC自動測序儀(Applied Biosystems, Inc.)確定。為本發(fā)明的目的，術(shù)語“肽”指至少兩個或更多個氨基酸或氨基酸類似物的化合物。氨基酸或氨基酸類似物可以通過肽鍵相連。在另一個實施方案中，氨基酸可以通過其他鍵，例如酯，醚等相連。肽可以是任何結(jié)構(gòu)構(gòu)型，包括線性，分支，或環(huán)狀構(gòu)型。本文所用的術(shù)語“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光學(xué)異構(gòu)體，和氨基酸類似物。本發(fā)明的肽衍生物和類似物包括但不限于那些包含作為一級氨基酸序列的包括其序列中的殘基被功能等同的氨基酸殘基替換從而導(dǎo)致保守性氨基酸替換的改變的序列的肽的全部或部分氨基酸序列。例如，序列中的一個或多個氨基酸殘基可以被另一個具有類似極性的，作為功能等同物的氨基酸替換，導(dǎo)致沉默的改變。序列中氨基酸的替換可以選自該氨基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天門冬酰胺，和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸，和組氨酸。帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。這種改變不會顯著影響聚丙酰胺凝膠電泳確定的分子量或等電點。非保守性氨基酸替換也可以被引入以替換氨基酸，使之具有特別偏好的性質(zhì)。例如，Cys可以 被引入到可能的位置以與另一個Cys形成二硫橋。Pro可以因其特別的平面結(jié)構(gòu)而被引入。本發(fā)明的肽可以被化學(xué)合成。合成肽可以用熟知的固相液相技術(shù)，或肽濃縮(peptide condensation)技術(shù),或其組合制備,可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是標(biāo)準(zhǔn)的Boc (Na-氨基保護的Na-t- 丁基氧羰基)氨基酸樹脂，進行Merrifield的原始固相程序的標(biāo)準(zhǔn)進行去保護、中和、稱聯(lián)和洗漆步驟(J. Am. Chem. Soc,第85卷，2149-2154，1963)，或堿敏感的Na-氨基保護的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino和Han, J. Org. Chem.，第37卷，3403-3409，1972)。此外，本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他Na-保護的基團。固相肽合成可以用本領(lǐng)域的普通技術(shù)(參見例如 Stewart 和 Young, Solid Phase Synthesis (固相合成),第二版,Pierce ChemicalCo. , Rockford, 111.，1984 ;Fields和 Noble, Int. J. Pept. Protein Res.,第 35 卷,161-214,1990)，或用自動合成儀實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，所述肽和/或所述新細菌菌株可以置于治療可接受的載體內(nèi)局部、腸胃外、經(jīng)粘膜，例如口服，經(jīng)鼻，或經(jīng)直腸，或經(jīng)皮膚給藥。本發(fā)明的肽如果需要的話可以進行修飾以增加所述肽穿過細胞膜的能力，例如通過增加所述肽的疏水性，使所述肽與載體(例如特異性受體的配體)相接合等。本發(fā)明還提供將靶分子與本發(fā)明的肽相接合。為本發(fā)明目的的靶分子指當(dāng)體內(nèi)給藥時，定位于所希望的一個或多個區(qū)域的分子。在本發(fā)明的各種實施方案中，靶分子可以是肽或蛋白質(zhì)、抗體、凝集素、碳水化合物或類固醇。靶分子可以是在靶細胞上的受體的肽配體或抗體，如單克隆抗體。為了便于交聯(lián)，抗體可以減少到兩個重鏈和輕鏈的異質(zhì)二聚體，或者F(ab’)2片段可以被還原，并通過還原的巰基與所述肽交聯(lián)。本發(fā)明的另一個方面是提供治療組合物。所述治療組合物可以用于口服、經(jīng)鼻、肺部給藥、注射等。所述治療組合物包含有效量的本發(fā)明的至少一種細菌素和它們的衍生物和/或至少一種新菌株以至少降低至少一種目標(biāo)細菌定植的水平，還包括可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。稀釋劑可以包括緩沖液，如，舉例而言，Tris-HCl，醋酸鹽，磷酸鹽；添加劑可以包括去垢劑和增溶試劑，如，舉例而言，Tween 80，聚山梨醇酯80等；抗氧化劑包括，如，舉例而言，抗壞血酸，焦亞硫酸鈉等；防腐劑可以包括，例如，Thimersol,苯甲醇等；以及膨脹物質(zhì)如乳糖,甘露醇等。本發(fā)明的治療組合物可以被合并入聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚乙醇酸等的微粒制備物中，或被合并入脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體的包封包括各種聚合物的包封。各種不同的聚合物載體都可用于貯含和/或遞送上面所討論的一種或更多種治療試劑，包括例如生物可降解的和不能生物降解的組合物。生物可降解組合物的代表性實例包括白蛋白，膠原，明膠，透明質(zhì)酸，淀粉，纖維素(甲基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素，醋酸纖維素苯二甲酸酯，醋酸纖維素琥珀酸酯，羥丙基甲基纖維素苯二甲酸酯)，酪蛋白，右旋糖苷，多糖，纖維蛋白原，聚(D，L丙交酯)，聚(D，L-丙交酯共乙交酯)，聚(乙交酯)，聚(羥基丁酸酯)，聚(烷基碳酸酯)和聚(原酸酯)，聚酯，聚(羥基戊酸)，聚二噁烷酮，聚(對苯二甲酸乙二酯)，聚(蘋果酸)，聚(丙醇二酸)，聚酐，聚磷腈，聚(氨基酸)和它們的共聚物(通常參見，Ilium, L. , Davids, S. S.(編)"Polymers in Controlled DrugDelivery (受控藥物釋放中的聚合物)"Wright, Bristol, 1987 ；Arshady, J. ControlledRelease 17 1-22,1991 ；Pitt, Int.J. Phar. 59 173-196,1990 ；Holland 等，J.ControlledRelease 4:155-0180,1986)。不能降解的代表性實例包括聚(乙烯-醋酸乙烯酯)(“EVA”)共聚物，硅橡膠，丙烯酸聚合物(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯，聚氰基丙烯酸烷基酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚酰胺(尼龍6，6)，聚氨酯，聚(酯型聚氨酯)，聚(醚型聚氨酯)，聚(酯-脲)，聚醚(聚(環(huán)氧乙烯)，聚(環(huán)氧丙烷)，Pluixmics和聚(四亞甲基二醇)，硅橡膠和乙烯基聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚(乙烯醇)，聚(醋酸乙烯苯二甲酸酯)。聚合物也可以被開發(fā)出來的，或者是陰離子的(例如藻酸鹽，卡拉膠，羧甲基纖維素和聚丙烯酸)，或者是陽離子的(例如殼聚糖，聚L賴氨酸，聚氮丙啶，和聚烯丙胺)(通常參見Dunn等，J.Applied Polymer Sci. 50 :353-365,1993；Cascone 等，J.Materials Sci. !Materialsin Medicine (藥物中的材料)5 :770-774,1994 ;Shiraishi 等，Biol. Pharm. Bull. 16 (11)1164-1168，1993 ；Thacharodi 和 Rao, Int ' 1J. Pharm. 120 :115-118,1995 ；Miyazaki 等，Int' 1J.Pharm. 118 :257-263,1995)。聚合物載體可以制成各種形式的，具有希望的釋放特性和/或具有特定的所希望的性質(zhì)。例如，聚合物載體可以被制成當(dāng)暴露于特定的觸發(fā)事件(如PH)時釋放治療試劑(參見例如 Heller 等，"Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems,(以化學(xué)的方式自調(diào)整的藥物遞送系統(tǒng))"，自iPolymers in Medicine III (藥物中的聚合物III)，Elsevier Science Publishers B. V.，阿姆斯特丹，1988, pp. 175-188 ;Kang 等，J. AppliedPolymer Sci.48 :343-354,1993 ;Dong等，J.Controlled Release 19 :171-178,1992；Dong和 Hoffman, J. Controlled Release 15 141-152,1991 ；Kim 等，J.Controlled Release28 :143-152,1994 ；Cornejo-Bravo 等，J. Controlled Release 33 :223-229,1995 ；ffu 和Lee, Pharm. Res. 10(10) : 1544-1547，1993 ；Serres 等，Pharm. Res. 13(2) : 196-201，1996 ；Peppas, " Fundamentals of pH-and Temperature-Sensitive Delivery Systems, (pH及溫度敏感遞送系統(tǒng)基礎(chǔ))"，自Gurny等(編)，Pulsatile Drug Delivery (脈動的藥物遞送)，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH,斯圖加特，1993, pp. 41-55 ；Doelker, " Cellulose Derivatives,(纖維素衍生物)"1993,自 Peppas 和 Langer (編),Biopolymers I (生物聚合物I), Springer-Verlag, Berlin)。pH敏感的聚合物的代表性實例包括聚丙烯酸及其衍生物(包括例如均聚物如聚氨基羧酸；聚丙烯酸；聚甲基丙烯酸，這些均聚物的共聚物，以及聚丙烯酸和如上所討論的丙烯單體的共聚物。其他PH敏感的聚合物包括多糖如醋酸纖維素苯二甲酸酯；羥丙基甲基纖維素苯二甲酸酯；醋酸羥丙基甲基纖維素琥拍酸酯；trimellilate醋酸纖維素偏苯三酸酯(trimellilate);和殼聚糖。其他pH敏感的聚合物還包括任何PH敏感的聚合物和水溶性聚合物的混合物。 同樣地，聚合物載體可以被制成是溫度敏感的(參見例如，Chen等，"NovelHydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadh esivePolyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery,(用于陰道藥物遞送的接枝到生物粘附聚丙烯酸骨架的溫度敏感型Pluronic的新型凝膠)"，自Proceed. Intern.Symp. Control. ReI. Bioact. Mater. 22 167-168, Controlled Release Society, Inc.,1995 ；Okano, " Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for TemporalControlled Drug Delivery，(用于時序受控藥物遞送的剌激響應(yīng)型水凝膠的分子設(shè)計)"自 Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22 :111-112, Controlled ReleaseSociety, Inc.，1995 ; Johnston 等，Pharm. Res. 9 (3) :425_433，1992 ;Tung，Int ' 1J.Pharm. 107 :85-90,1994 ；Harsh 和 Gehrke，J.Controlled Release 17 :175-186，1991 ；Bae 等，Pharm. Res. 8 (4) :531-537,1991 ；Dinarvand 和 D ' Emanuele, J. ControlledRelease36 :221-227,1995 ；Yu 和 Grainger， " Novel Thermo-sensitive AmphiphilicGels Poly N-isopropyIaeryIamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamideNetwork Synthesis and Physicochemical Characterization，(新型熱敏感型兩親凝膠聚N-異丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸鈉-共-n-N-烷基丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)合成和物化特性)"，俄勒R科學(xué)與技術(shù)研究生院化學(xué)和生物科學(xué)系，Beaverton，俄勒R州，pp. 820-821 ；Zhou和 Smid，" Physical Hydrogels of Associative Star Polymers，(締合的星型聚合物的物理水凝膠)"，紐約州立大學(xué)環(huán)境科學(xué)和林學(xué)院化學(xué)系聚合物研究所，Syracuse,紐約州，pp. 822-823 ;Hoffman 等，"Characterizing Pore Sizes and Water' Structure' inStimuli-Responsive Hydrogels,(剌激響應(yīng)型水凝膠中的孔徑和水‘結(jié)構(gòu)’特征)"，華盛頓大學(xué)生物工程中心，P. 828 ;Yu 和 Grainger，" Thermo-sensitive Swelling Behaviorin Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks Cationic, Anionic and AmpholyticHydrogels,(交聯(lián)的N-異丙基丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)中的熱敏感型溶脹性能)"，俄勒R科學(xué)與技術(shù)研究生院化學(xué)和生物科學(xué)系，Beaverton，俄勒R州，pp. 829-830 ;Kim等，Pharm.Res. 9 (3) :283-290,1992 ；Bae 等，Pharm. Res. 8 (5) :624-628,1991 ；Kono 等，J. ControlledRelease 30 :69-75,1994 ；Yoshida 等，J.Controlled Release 32 :97-102,1994 ；Okano等，J. Controlled Release 36 :125-133,1995 ；Chun 和 Kim，J. Controlled Release 38 39-47，1996 ;D' Emanuele 和 Dinarvand, Int' 1J. Pharm. 118 :237-242,1995 ；Katono 等，J.Controlled Releasel6 :215-228,1991 ;Hoffman，" Thermally Reversible HydrogelsContaining Biologically Active Species，(包含生物活性物質(zhì)的熱可逆型水凝膠)"，自 Migliaresi 等(編)，Polymers in Medicine III (藥物中的聚合物 III)，ElsevierScience Publishers Β· V.，阿姆斯特丹，1988，pp. 161-167 ;Hoffman，" Applications ofThermally-Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics，(熱可逆型聚合物和凝膠在治療學(xué)和診斷學(xué)中的應(yīng)用)"，自第三屆藥物遞送系統(tǒng)中的新進展國際研討會，鹽湖城，猶他州，1987年2月24-27日，pp. 297-305 ;Gutowska等，J.Controlled Release 22 :95-104,1992 ；Palasis和 Gehrke,J. Controlled Release 18 1-12，1992 ； Paavo I a 等，Pharm. Res. 12 (12) 1997-2002，1995)。熱膠凝聚合物的代表性實例，以及它們的凝膠溫度(LCST(°C ))包括均聚物如聚(N-甲基-N-n-丙基丙烯酰胺)，19.8 ;聚(N_n_丙基丙烯酰胺)，21. 5 ;聚(N-甲基-N-異丙基丙烯酰胺)，22. 3 ’聚(N-n-丙基甲基丙烯酰胺)，28. O ’聚(N-異丙基丙烯酰胺)，30. 9 ;聚(N，η-二乙基丙烯酰胺)，32. O ;聚(N-異丙基甲基丙烯酰胺)，44. O ;聚(N-環(huán)丙基丙烯酰胺)，45. 5 ;聚(N-乙基甲基丙烯酰胺)，50. O ;聚(N-甲基-N-乙基丙烯酰胺)，56. O ;聚(N-環(huán)丙基甲基丙烯酰胺)，59. O ;聚(N-乙基丙烯酰胺)，72. O。而且，熱膠凝聚合物可以通過制備上述兩個或多個單體之間的共聚物，或者將這種均聚物與其他水溶性聚合物如丙烯醒基單體(aeryImonomer)(例如丙烯酸及其衍生物如甲基丙烯酸,丙烯酸酯及其衍生物如甲基丙烯酸丁酯，丙烯酰胺，和N-n- 丁基丙烯酰胺)組合來制造。熱膠凝聚合物的其他代 表性實例包括纖維素醚衍生物如羥丙基纖維素，41°C ;甲基纖維素，55°C ;羥丙基甲基纖維素，66°C ;和乙基羥乙基纖維素，和 Pluronics 如 F-127，10_15°C ;L_122，19°C ;L_92，26°C ；L-81,20°C ;和 L-61，24°C。利用和本發(fā)明的聚合物載體可以制成多種不同的形式，包括例如棒狀設(shè)計(rod-shaped device)、丸、厚片(slab)或膠囊(參見例如，Goodell et al.，Am. J. Hosp.Pharm. 43 :1454-1461,1986 ;Langer 等， "Controlled release of macromoleculesfrom polymers (大分子從聚合物的受控釋放)"，自 Biomedical Polymers, PolymericMaterials and Pharmaceuticals for Biomedical Use (生物醫(yī)學(xué),用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的聚合物材料和藥物)，Goldberg, E. P.，Nakagim, Α·(編)Academic Press, pp. 113-137,1980 ；Rhine 等，J. Pharm. Sci. 69 :265-270,1980 ；Brown 等，J. Pharm. Sci. 72 :1181-1185,1983 ；以及 Bawa 等，J. Controlled Release I :259-267,1985)。治療試劑可以通過封閉在聚合物基質(zhì)中與聚合物共價連接被連接，或者可以封裝在微膠囊中。在本發(fā)明的特定優(yōu)選的實施方案中，治療組合物以非膠囊的制劑如微球(尺寸范圍在納米到微米)、糊劑、各種尺寸的絲狀劑(thread)、薄膜劑和噴霧劑被提供。本發(fā)明的另一個方面是提供治療組合物和動物飼料。本發(fā)明的治療組合物可以用上述的聚合物載體包封，然后通過任何已知的將其應(yīng)用于飼料中的方法添加到飼料中，例如通過機械攪拌，噴灑等。所述治療組合物包括，例如，能有效地至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中定植的水平的量的至少一種細菌素和/或拮抗細菌，例如大約O. 5g每種的lactocin和/或腸球菌素/lOOOg，大約I. 25g聚合物載體例如聚乙烯吡咯烷酮/IOOOgdP大約8. 6%稀釋劑例如水/lOOOg，與可消化的任何顆粒組分，例如磨碎的玉米谷物；谷物例如燕麥，小麥，蕎麥；磨碎的果實例如梨等混合。然后將所述治療組合物以有效地至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平的量加入任何類型的動物飼料中，例如細菌素對飼料的比為大約I : 10至大約I : 100。為本發(fā)明的目的，動物飼料的實例包括青飼料，青貯飼料，干燥的青飼料，根，塊莖，肉質(zhì)果，谷類，種子，啤酒糟，果渣，啤酒酵母，蒸餾殘渣，面粉加工副產(chǎn)品，糖、淀粉或油生產(chǎn)的副產(chǎn)品，和各種食品廢棄物。該產(chǎn)品可以添加到飼養(yǎng)牛、家禽、兔、豬、或羊等的動物飼料中。它可以與用于這些家畜的其他飼料添加劑混合使用。
下述實施例僅僅是為了進一步舉例說明本發(fā)明，并非要限制由權(quán)利要求確定的本發(fā)明的范圍。實施例I產(chǎn)生細菌素的兩種新拮抗菌株，唾液乳酸桿菌，標(biāo)明為NRRL B_30514(菌株P(guān)VD32)和嗜酸乳酸桿菌，標(biāo)明為NRRL B-30510 (菌株LWP320)從肉仔雞的盲腸和嗉囊中分離出來。所述盲腸和嗉囊預(yù)先排空并用大約IOOml無菌的O. 85% w/v鹽水溶液(生理鹽水)洗滌兩次。盲腸和嗉囊物懸浮于PH為大約7. O的無菌鹽水溶液中。將大約O. Iml的10倍稀釋的懸液直接平板接種于選擇性MRS瓊脂上。平板在大約37°C厭氧培育大約16-18小時。從每個樣品選擇至少10個乳酸桿菌特異的菌落。乳酸桿菌用APO 50CHL微檢測系統(tǒng)(bioMerieux,法國)進行鑒別。菌株唾液乳酸桿菌PVD32和嗜酸乳酸桿菌LWP320在大約37°C在MRS瓊脂上培養(yǎng)大約24小時。這兩個菌株是兼性厭氧菌，革蘭氏陽性的非運動性的棒狀細菌，能夠在大 約30°C，37°C，和42°C生長。菌株P(guān)VD32在MRS瓊脂上生長，在大約37°C微需氧培育大約18-24小時后，產(chǎn)生直徑為大約1-3_的圓形至規(guī)則形狀的、光滑的、凸面的具有清晰邊緣的菌落。菌株LWP320在MRS瓊脂上生長，在37°C微需氧培育大約24小時后，產(chǎn)生直徑大約為O. 5到O. 8mm的發(fā)白的,半透明的菌落。糞腸球菌LWP21和堅韌腸球菌LWP26在大約37°C在MRS瓊脂上生長大約24小時。它們是革蘭氏陽性的兼性厭氧菌，非運動性的球菌，能在大約30°C，37°C，和42°C生長。菌株LWP21在MRS瓊脂上生長，產(chǎn)生發(fā)白色的半透明菌落，微需氧培育大約24小時后變得透明。在大約37°C微需氧培育大約48小時后，菌落直徑為大約O. 8至大約I. 0mm。使用API 50CHL懸浮介質(zhì)，在API 50CHL和EN-C0CXUS圖表種類中的結(jié)果如下述表I所示。下述表2顯示的結(jié)果表明菌株P(guān)VD32是唾液乳酸桿菌，菌株LWP320是嗜酸乳酸桿菌，菌株LWP21是糞腸球菌，菌株LWP26是堅韌腸球菌。評價拮抗分離物的拮抗活性的目標(biāo)細菌包括從俄羅斯的肉仔雞中分離的空腸彎曲桿菌的菌株L4和BI,空腸彎曲桿菌ATCC 11168,腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的幾個種，綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株ATCC 9027,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytongenes),用作檢測培養(yǎng)物以評價分離菌的拮抗活性?？漳c彎曲桿菌在大約37°C在大約5% O2，大約10%CO2，和大約85% N2的微需氧條件下，在添加有大約0. 02%亞硫酸氫鈉，大約0. 05%硫酸亞鐵，和大約5%部分裂解羊血的布魯氏菌瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上生長大約18-24小時。其他菌株小腸結(jié)腸炎耶氏菌(Y. enterocolitica)和假結(jié)核耶氏菌(Y. pseudotuberculosis)在營養(yǎng)瓊脂上在大約37°C或大約28°C在有氧條件下培養(yǎng)大約18-24小時。分離菌對彎曲桿菌的拮抗活性被評價。大約0. 2ml生理鹽水懸液被平板接種于MRS瓊脂上，在大約37°C培育大約24小時。大約0. 5cm3的瓊脂塊被切割下來并轉(zhuǎn)移到添加有大約5% -10%部分裂解羊血，大約10mg/ml利福平，和大約2. 5u/ml多粘菌素，接種量為每個平板大約IO7個空腸彎曲桿菌細胞的布魯氏菌瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上。平板在大約42°C在如上所述的微量需氧條件下培育大約24小時。拮抗活性通過測量空腸彎曲桿菌抑制區(qū)域的直徑大小得以評價。對空腸彎曲桿菌的拮抗活性用11，790種分離菌進行評價，其中279種分離菌顯示出對空腸彎曲桿菌的拮抗作用。
表I. API50CHL和EN-C0CCUS檢測的鑒定結(jié)果
檢測(得分)Γ 1
PVD32API 50CHL(99.9%)唾液乳酸桿菌
LWP320API 50CHL(96.6%)嗜酸乳酸桿菌
LWP21EN-COCCUS-檢測(96% )糞腸球菌
LWP26EN-COCCUS-檢測(98% )堅韌腸球菌表2a.乳酸桿菌菌種的特征(API 50CHL的結(jié)果)
分離菌及其性質(zhì)碳水化合物PVD32LWP320
O-對照
赤蘚糖醇(Erythriol)
D-阿拉伯糖 L-阿拉伯糖
Tl
D-木糖 L-木糖
福壽糖醇β-甲基-木糖苷
半乳糖++
D-葡萄糖~
D-果糖~
D-甘露糖~
權(quán)利要求
1.一種細菌素，所述細菌素的氨基酸序列是SEQ ID NO 2。
2.—種細菌素，所述細菌素的氨基酸序列是SEQ ID NO 3。
3.—種細菌素，所述細菌素的氨基酸序列是SEQ ID NO 4。
4.一種治療組合物,包括 (a)有效量的至少一種分離的細菌素，以至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平，所述細菌素的氨基酸序列是選自由SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4組成的組的氨基酸序列；和 (b)適當(dāng)?shù)闹委熭d體。
5.一種用于動物的治療飼料,包括 (a)有效量的至少一種分離的細菌素，以至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平，所述細菌素的氨基酸序列是選自由SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4組成的組的氨基酸序列， (b)治療載體；和 (C)動物飼料。
6.治療組合物在制造至少降低至少一種目標(biāo)細菌在動物中的定植水平的藥物中的應(yīng)用，其中所述治療組合物包括 有效量的至少一種細菌素，以至少降低至少一種目標(biāo)細菌的定植水平，所述細菌素的氨基酸序列是選自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4組成的組的氨基酸序列；和 治療載體。
全文摘要
新的細菌素和/或新的產(chǎn)乳酸菌株被用于至少減少至少一種目標(biāo)細菌在動物、特別是家禽中的定植水平。
文檔編號A61P31/04GK102887945SQ20121012125
公開日2013年1月23日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者N·J·斯特恩, E·A·斯韋托奇, B·V·葉魯斯拉諾夫, L·I·沃洛季納, Y·N·科瓦列夫, T·Y·庫德里亞夫采瓦, V·V·佩雷列金, V·D·波基蘭科, V·P·列夫查克, V·N·博曾科夫, O·E·斯韋托奇, E·V·米特西韋奇, I·P·米特西韋奇 申請人:由農(nóng)業(yè)部部長代表的美利堅合眾國, 國家應(yīng)用微生物和生物技術(shù)研究中心