專利名稱：一種測定非小細胞肺癌血漿蛋白質指紋圖譜的方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及血漿蛋白質指紋圖譜，具體涉及一種測定非小細胞肺癌血漿蛋白質指紋圖譜的方法。
背景技術：
蛋白質指紋圖譜技術有蛋白芯片技術和質譜鑒定技術組成，而后者有分為基質輔助的激光解析離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質譜(ESI-MS)，近來有研究發(fā)展了表面增強的激光解析離子化飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)可直接應用血漿等體液樣本，具有需要樣本量少(如血漿0.5ul-500ul，細胞約2000個)，可檢測低豐度(1fmol)、低分子量的未知蛋白，由于以上特點，比較適合臨床應用。
SELDI-TOF-MS技術目前已廣泛應用于腫瘤、新藥開發(fā)、傳染病、神經、精神疾病等領域。已有研究報道，關于腫瘤診斷的研究結果于2002年Lancet上由美國FDA和NCI合作研究的卵巢癌的早期診斷上(Lancet 2002，359(2)590-7)，與傳統(tǒng)的CA125單項指標相比(陽性預測值僅35％)，僅蛋白質指紋圖譜的多項指標診斷模型的敏感度在100％，陽性預測值高達94％，以后的幾年中，該方法已用于如小細胞肺癌(Lancet 2003，362(9382)433-9)、前列腺癌(J Urol2004，172(4pt)1302-5)、腎癌(Int J Mol Med 2005。15(2)285-90)、乳腺癌(Breast Cancer Res Treat2004，86(3)281-91)、頭頸部腫瘤(Clin Cancer Res2004，10(14)4806-12)國內已開展此項技術，如上海華山醫(yī)院用于膀胱癌(Clin Biochem 2004，37(9)772-9)和神經膠質瘤研究；瑞金醫(yī)院用于胰腺癌和血液病研究，中山醫(yī)院用于慢性肝病，包括肝炎、肝硬化和肝癌及其轉移復發(fā)的研究；浙江大學用于結腸癌(Clin Cancer Res 2004，10(14)8380-5)等。展現(xiàn)了廣闊的臨床應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種測定非小細胞肺癌的血漿蛋白質指紋圖譜的方法。具體涉及血漿蛋白質的表面增強激光解析離子化-飛行時間質譜測定和肺癌的特異性蛋白峰比較識別的方法。
本方法可用于提高鑒別肺癌尤其是非小細胞肺癌的特異性。
本發(fā)明方法的主要技術方案是采用表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術，包括患者血漿樣本的采集標準，化學芯片的選擇、處理和閱讀，測定條件的優(yōu)化；判別模式及驗證。
本方法對經查體各項指標正常，且血脂、血糖、肝腎功能，乙肝五項化驗均正常的健康人血漿進行測定，和經病理檢驗證實為肺癌病人或非小細胞肺癌病人或肺部疾患(包括支氣管擴張、肺炎、肺梗塞)的血漿進行測定，結果表明，在非小細胞肺癌患者的血漿蛋白質指紋圖譜中顯示有判別意義的蛋白質峰，其準確率對肺癌而言為93.75％(30/32)，正常人為93.93％(31/33)。
本方法能進一步為篩查肺癌，尤其是非小細胞肺癌病人提供簡易的、特異性技術手段。也適用于大規(guī)模人群如體檢、流行病學調查等，還可用于對臨床患者的判別。表1是篩查非小細胞肺癌病人的血漿蛋白質指紋圖譜總結表。
表1



圖1是同一樣品同一芯片血漿樣品檢測重復性分析圖(WCX芯片/SELDI-TOF/MS)，其中顯示，強度重復性CV＝16.81％，分子量重復性CV＝0.0233％。
圖2是同一樣品不同芯片血漿樣品檢測重復性分析圖(WCX芯片/SELDI-TOF/MS)，其中顯示，強度重復性CV＝17.74％，分子量重復性CV＝0.0237％。
圖3是血漿蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰蛋白質峰1M/Z 3944；蛋白質峰2M/Z 2826，其中，第1、2行NSCLC病人；第3、4行正常人血漿。
圖4是區(qū)分正常人和非小細胞肺癌病人的血漿蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型)。
具體實施例方式
實施例1表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)實驗1.標本收集及預處理標本來源正常健康人血漿由上海體育大學提供，查體各項指標正常，且血脂、血糖、肝腎功能，乙肝五項化驗均正常，非小細胞肺癌病人血漿由上海胸科醫(yī)院胸部腫瘤研究所提供，肺癌病人均經病理檢驗證實。
標本收集空腹靜脈抽血5-10ml，室溫靜置30分鐘左右，6000rpm～1000rpm離心15分鐘，收集上清(血漿)分裝，-80℃保存。避免溶血和脂血標本。
芯片選擇比較血漿蛋白在WCX、SAX、H4、IMAC四種蛋白芯片上蛋白指紋峰的分布、表達情況，優(yōu)先選擇蛋白指紋峰分布和表達均理想的WCX2蛋白芯片對血漿的蛋白譜進行檢測。
血漿樣品前處理1).從-80℃冰箱中取出血漿樣品，置冰盒上融解；2).以10000rpm，4℃離心2分鐘；3).每個芯片點需要血漿3ul，將血漿用2倍體積U9緩沖液(9M urea，2％CHAPS，50mM Tris-Hcl，1％DTT，pH 9.0)稀釋。稀釋時，避免產生大量氣泡，將樣品充分混勻；
4).將以上樣品冰浴振蕩30分鐘；5).將9ul上述變性后樣品加入108ul相應的結合緩沖液，使得血漿的總稀釋倍數(shù)達到約40倍，混勻，避免氣泡產生；6).將處理好的血漿樣品上樣到芯片上。
2.實驗操作1)取出WCX2的芯片，在芯片背后標記時間，芯片種類等資料；2).將芯片裝入生物芯片處理器(Bioprocessor)，在組裝生物芯片處理器時，不觸碰加樣孔，同時將芯片上帶有”A”的一頭放在外端，注意密封；3).每孔加入200ul結合緩沖液(50mM NaAC，pH 4.0，或試劑盒中的binding buffer)，置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉/分震蕩5分鐘，甩掉緩沖液。重復上述操作。保持芯片上每點的濕潤，加緩沖液后保持芯片無氣泡，槍頭不接觸芯片上各點表面；4).上樣(劑量根據(jù)實際需要而定)，在芯片處理器每孔中加入100ul處理好的樣品，置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉/分，4℃震蕩1小時；5).甩出樣品，其中生物樣品(如血液，尿樣，腦脊液，癌細胞液等)甩入預裝消毒劑的容器；6).每孔加入200ul的結合緩沖液(50mM NaAc，pH 4.0或試劑盒中的binding buffer)，室溫置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉/分震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再加入結合緩沖液200ul，重復操作；7).每孔加入200ul HPLC水，甩出；8).拆開芯片處理器，取出芯片，待干后，每個加樣孔上加SPA 0.5ul，待干后，重復加SPA 0.5ul一次；9).待干后，即可上機測定。
3.設置芯片閱讀參數(shù)1)設定最高質量5000道爾頓，最適范圍2000-20000道爾頓；
2)設定初始激光強度為185；3)設定檢測敏感度為8；4)校正聚焦點于孔中央；5)設定質量檢測器為1000道爾頓；6)設置數(shù)據(jù)處理為SELDI位置；7)設定SELDI參數(shù)為22delta至4轉換，終點為82；8)設定濕熱位置至2，強度為10；9)置入樣品。
4，血清樣品檢測重復性分析(SELDI-TOF-MS/WCX2蛋白芯片)，同一樣品同一芯片重復性分析結果表明，強度重復性CV＝16.81％，分子量重復性CV＝0.0233％；同一樣品不同芯片重復性分析結果表明，強度重復性CV＝17.74％，分子量重復性CV＝0.0237％。
5，在上述基礎上，確定正常人與非小細胞肺癌患者血漿鑒別模式，1)建模組正常人血漿33份，非小細胞肺癌病人血漿32份。
2)獲得血漿蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰蛋白質峰1M/Z 3944；蛋白質峰2M/Z 2826。
建立區(qū)分正常人和非小細胞肺癌病人的血漿蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型)，通過血漿中M/Z為3944和2826二個蛋白質即可將肺癌病人鑒別出來，其準確率對肺癌而言為93.75％(30/32)，正常人為93.93％(31/33)。
上述判別模式用于判別實驗，結果顯示特異蛋白質3944Da在正常組低表達，在肺癌患者高表達，其中I、III期表達水平高于II期。手術后即刻血漿表達水平高于手術前。在腺癌，鱗癌和腺鱗混合型中表達無差異。
肺部疾患(包括支氣管擴張、肺炎、肺梗塞)15人血漿SEDLI-TOF-MS檢測未見特異蛋白質3944Da高表達；胸水患者10人SEDLI-TOF-MS檢測，其中9例胸水檢測到癌細胞，有8例可見特異蛋白質3944Da表達；1例患者為炎性胸水未檢測到癌細胞，也沒有特異蛋白質3944Da表達。
表2是特異蛋白質3944Da在33例正常和手術前后的表達。
表2

6，驗證(盲篩結果)共64份標本，其中，病理及臨床證實其中含正常人標本33例，NSCLC病人例31例，33例被判別為正常人中，30例被證明為正常(真陰性)，5例NSCLC病人被判斷為正常人(假陰性)3例被判斷為病人(假陽性)，31例被判別為NSCLC病人中，26例被證明為病人(真陽性)，5例被判為正常人(假陽性)，診斷敏感性＝30/(26+5)＝96.77％診斷特異性＝30/(30+3)＝90.90％陽性預期值＝26/(26+5)＝83.87％陰性預期值＝30/(30+5)＝85.71％總有效率＝(30+26)/64＝87.50％。
權利要求
1.一種測定非小細胞肺癌血漿蛋白質指紋圖譜的方法，其特征是采用表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術，包括非小細胞肺癌血漿樣本的采集標準，化學芯片的選擇、處理和閱讀，測定條件的優(yōu)化；判別模式及驗證，所述的芯片閱讀參數(shù)設置為1)設定質量范圍2000-20000道爾頓；2)設定初始激光強度為185；3)設定檢測敏感度為8；4)校正聚焦點于孔中央；5)設定質量檢測器為1000道爾頓；6)設置數(shù)據(jù)處理為SELDI位置；7)設定SELDI參數(shù)為22delta至4轉換，終點為82；8)設定濕熱位置至2，強度為10。
2.根據(jù)權利要求1的測定非小細胞肺癌血漿蛋白質指紋圖譜的方法，其中所述的化學芯片確定為WCX2蛋白芯片。
3.根據(jù)權利要求1的測定非小細胞肺癌血漿蛋白質指紋圖譜的方法，其中所述的芯片閱讀參數(shù)設置1)，設定最高質量5000道爾頓。
4.根據(jù)權利要求1的測定非小細胞肺癌血漿蛋白質指紋圖譜的方法，其特征是所述的判別模式是正常人與非小細胞肺癌病人鑒別的血漿蛋白質M/Z3944，2826及決策樹的判別模式。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及一種測定非小細胞肺癌血漿蛋白質指紋圖譜的方法。本方法采用表面增強激光解析離子化－飛行時間質譜測定技術進行肺癌的特異性蛋白峰比較識別，對經查體各項指標正常，且血脂、血糖、肝腎功能，乙肝五項化驗均正常的健康人，和經病理檢驗證實為肺癌病人或非小細胞肺癌病人或肺部疾患的血漿進行測定，結果表明，在非小細胞肺癌患者的血漿蛋白質指紋圖譜中顯示有判別意義的蛋白質峰，其準確率對肺癌而言為93.75％，正常人為 93.93％。本方法能進一步為篩查肺癌，尤其是非小細胞肺癌病人提供簡易的、特異性技術手段。也適用于大規(guī)模人群如體檢、流行病學調查等，還可用于對臨床患者的判別。
文檔編號G01N33/72GK1854732SQ200510025478
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權日2005年4月27日
發(fā)明者馮久賢, 沙慧芳 申請人:上海市胸科醫(yī)院