專利名稱：作為疫苗佐劑的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
的描述人類，家畜和寵物常被接種疫苗以防止疾病或降低疾病的嚴(yán)重性。接種導(dǎo)致產(chǎn)生抗體，抗體是能與疫苗中所用的抗原物質(zhì)特異性結(jié)合的血清蛋白質(zhì)。這種體液應(yīng)答涉及選擇特異性B淋巴細(xì)胞系，以及增殖和分化所選的細(xì)胞以產(chǎn)生產(chǎn)抗體血漿細(xì)胞的克隆。
免疫接種后幾周內(nèi)抗體生產(chǎn)達(dá)到峰值，然后逐漸下降。由于血清蛋白質(zhì)的恒量周轉(zhuǎn)，該抗體生產(chǎn)的下降伴隨著抗體循環(huán)水平的相應(yīng)下降。然而，如果患者再次受到相同抗原的攻擊，將會(huì)啟動(dòng)比第一次更迅速和更強(qiáng)烈的新應(yīng)答曲線。這稱為二級(jí)，加強(qiáng)或回憶應(yīng)答，且在健康的患者中產(chǎn)生比第一次接觸抗原，或初次接種更高水平的親和力更大的抗體。這種抗體合成速率的增加是產(chǎn)抗體的血漿細(xì)胞數(shù)增加的結(jié)果。這些細(xì)胞在含有大多數(shù)小淋巴細(xì)胞的未接種患者的淋巴結(jié)中是稀少的。然而，在健康的患者中，初次接種后血漿細(xì)胞占到總淋巴結(jié)細(xì)胞的3％，二次接種后多達(dá)淋巴結(jié)細(xì)胞的30％。
據(jù)說(shuō)二級(jí)應(yīng)答是由于免疫記憶所致。即，健康機(jī)體能“記住”其以前與該抗原的接觸，并在其第二次接觸時(shí)能更迅速和有效地應(yīng)答，即使此時(shí)血清中特異性抗體的量下降到極低的水平。
某些情況，例如衰老，營(yíng)養(yǎng)不良，藥物成癮，醇中毒，和某些疾病狀態(tài)，例如糖尿病和艾滋病，引起免疫缺陷，其中許多免疫應(yīng)答受抑制和接種效力下降。因此在本領(lǐng)域中需要改進(jìn)接種技術(shù)，特別是針對(duì)老年或其它免疫缺陷群體。
本發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，一種接種方法使用了藥用組合物以增強(qiáng)疫苗效力。該藥用組合物包含一種能在免疫缺陷動(dòng)物中刺激抗對(duì)該動(dòng)物為異源的致病因子的抗體生產(chǎn)的免疫應(yīng)答觸發(fā)疫苗。該藥用組合物進(jìn)一步包括疫苗增效量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，它可增強(qiáng)在該動(dòng)物對(duì)該疫苗應(yīng)答中的所述抗體的產(chǎn)生和親和性。疫苗和NGF可單獨(dú)和一起施用。在優(yōu)選的方法中，接種方法包括給免疫缺陷動(dòng)物施用第一劑能在所述動(dòng)物中刺激抗對(duì)該動(dòng)物為異源的致病因子的抗體生產(chǎn)的免疫應(yīng)答觸發(fā)疫苗；然后，在施用所述第一劑大約1周至大約2月的時(shí)間期間內(nèi)給所述的動(dòng)物施用1)疫苗增效量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，它在所述的動(dòng)物中對(duì)所述的疫苗的應(yīng)答中增強(qiáng)所述抗體的生產(chǎn)，或者2)加強(qiáng)劑量的所述疫苗以及疫苗增效量的所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，以便增強(qiáng)所述疫苗在所述動(dòng)物中的效力。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是顯示與對(duì)照相比，根據(jù)本發(fā)明處理的成年小鼠中抗體生產(chǎn)的圖示。
圖2是顯示與對(duì)照相比，利用本發(fā)明在老年小鼠中增強(qiáng)抗體生產(chǎn)的圖示。
圖3是顯示在幼年和老年小鼠中抗體生產(chǎn)的圖示。
圖4是顯示與對(duì)照相比，免疫接種3個(gè)月后，根據(jù)本發(fā)明在老年小鼠中增強(qiáng)抗體生產(chǎn)的圖示。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)生長(zhǎng)因子不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起作用，而且在免疫系統(tǒng)生理學(xué)中具有重要作用。記憶B細(xì)胞是保留機(jī)體遇到給定化學(xué)結(jié)構(gòu)(抗原)之痕跡(記憶)的淋巴細(xì)胞，它產(chǎn)生并分泌NGF，通過(guò)細(xì)胞表面受體與之結(jié)合，并與其生物學(xué)信息反應(yīng)(由相同細(xì)胞產(chǎn)生并反應(yīng)的自分泌環(huán)路)，該細(xì)胞可存活許多年，或者甚至在機(jī)體的整個(gè)生命歷程中存活，它與具有較短壽命的其它淋巴細(xì)胞存在差異。
盡管還沒(méi)有任何特定的理論來(lái)解釋，但據(jù)信除了NGF在維持記憶B細(xì)胞存活中的活性外，NGF可能也影響其產(chǎn)生，對(duì)其前體起正調(diào)作用。記憶細(xì)胞可能由祖先細(xì)胞隨機(jī)獲得產(chǎn)NGF的能力而產(chǎn)生，否則，祖先細(xì)胞將經(jīng)過(guò)細(xì)胞程序死亡(自殺)而走向死亡，這種產(chǎn)NGF的能力將產(chǎn)生自分泌環(huán)維持的分化直至成熟記憶細(xì)胞階段，然后，成熟的記憶細(xì)胞得以存活。因此，給動(dòng)物施用外源性NGF產(chǎn)生更高數(shù)目的記憶細(xì)胞。更大的記憶細(xì)胞庫(kù)給個(gè)體提供了針對(duì)抗原的更強(qiáng)和更持久的保護(hù)。這種改進(jìn)在免疫缺陷情況，例如，衰老，其中許多免疫應(yīng)答受到抑制的情況下更明顯。經(jīng)過(guò)增加記憶B細(xì)胞的數(shù)目，NGF提高了免疫系統(tǒng)識(shí)別極低濃度的抗原的能力，因?yàn)楸砻婵贵w在記憶B細(xì)胞上具有更高的親和力。
本發(fā)明適用于能在免疫應(yīng)答中形成抗體的動(dòng)物，例如，包括人類的哺乳動(dòng)物，，家畜和寵物，以及鳥(niǎo)類，如家禽。
隨著人的衰老，其免疫應(yīng)答也下降，免疫接種效力由于普遍的低親和力抗體反應(yīng)而減小。因此，本發(fā)明特別適用于45歲以上，特別是50歲和以上的人使用。
本發(fā)明也適用于由于施用諸如環(huán)孢菌素的抗排斥藥品而具有免疫缺陷的移植病人。
據(jù)信本發(fā)明也適用于任何已知的疫苗，其例子包括流感疫苗，流感嗜血桿菌疫苗，甲肝病毒疫苗，乙肝病毒疫苗，丙肝病毒疫苗，結(jié)核疫苗，帶狀泡疹病毒疫苗，巨細(xì)胞病毒疫苗，肺炎球菌性肺炎疫苗，腦膜炎球菌性腦膜炎疫苗，白喉疫苗，破傷風(fēng)疫苗，狂犬病疫苗，幽門(mén)螺桿菌疫苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗和天花疫苗。
還相信本發(fā)明可適用于任何未來(lái)的疫苗，例如可開(kāi)發(fā)用于接種抗艾滋病病毒的疫苗。
一般來(lái)說(shuō)，以在大約1×10-9g到大約1×10-3g的范圍內(nèi)，更典型的是在大約1×10-8g到大約1×10-4g的范圍內(nèi)的量施用疫苗。
疫苗增效量的NGF一般以在大約0.001-100mg/kg受試者體重的范圍內(nèi)的量，優(yōu)選以大約0.1-10mg/kg的量，更優(yōu)選大約0.3-3mg/kg的量施用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，NGF可在施用疫苗之前和/或同時(shí)施用。
當(dāng)與第二次(加強(qiáng))接種劑量相聯(lián)施用時(shí)，本發(fā)明特別有效。第二次或加強(qiáng)接種劑量一般在施用第一次(初次)疫苗劑量后大約1周至大約2月的時(shí)間期限內(nèi)施用，優(yōu)選在第一次疫苗劑量大約10-45天內(nèi)施用，更優(yōu)選在施用第一次疫苗劑量大約10-30天內(nèi)施用，根據(jù)一些實(shí)施方案在施用第一次疫苗劑量大約10-20天內(nèi)施用。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在施用第二次(加強(qiáng))疫苗劑量前幾天給受試者施用一劑NGF，更優(yōu)選的是在施用第二次(加強(qiáng))疫苗劑量前3-4天施用。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF也可與施用第二次(加強(qiáng))疫苗劑量時(shí)同時(shí)施用。
NGF和疫苗的施用可經(jīng)過(guò)任何合適的方式進(jìn)行，例如，注射，輸注或口服。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)注射用藥。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可經(jīng)過(guò)給受試者導(dǎo)入包括攜帶編碼NGF之基因的載體的成肌細(xì)胞。根據(jù)該實(shí)施方案，受試者中的成肌細(xì)胞產(chǎn)生NGF以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)效力。
當(dāng)疫苗和NGF同時(shí)施用時(shí)，它們可作為包括疫苗和NGF的單個(gè)組合物提供。
包括疫苗和/或NGF的組合物也可包括一種或多種藥用上可接受的載體和任選其它的治療成分。適用于注射或輸注的配制品包括含水或不含水的無(wú)菌注射溶液，它可任選含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和導(dǎo)致配制品與目的受試者血液等滲的溶質(zhì)，以及可包括懸浮劑和增稠劑的含水和無(wú)水無(wú)菌懸液。該配制品可存在于單位劑量或多劑量的容器內(nèi)，例如，密封的安培和小瓶，且可以冷凍干燥(凍干)狀態(tài)貯存，僅需要在使用前立即加入無(wú)菌液體載體，例如注射水。
優(yōu)選使用的NGF與受試者匹配，例如，人NGF優(yōu)選用于人受試者。本發(fā)明適用于天然的(即，天然存在的)NGF，以及相應(yīng)于天然NGF，具有天然NGF的氨基酸序列的合成NGF和重組NGF，基本上與其相似的生物學(xué)活性氨基酸序列，或其縮短的序列形式，和具有取代，缺失，延長(zhǎng)，置換或其它修飾的序列且具有基本上相似于NGF的生物活性的其生物學(xué)活性類似物。
本發(fā)明以實(shí)施例1作進(jìn)一步的說(shuō)明，它并不用于限制本發(fā)明。
實(shí)施例 1給兩組10只老年(＞5月齡)C57/BL6雌性小鼠經(jīng)每只小鼠腹膜內(nèi)注射懸浮于0.1ml完全Freund氏佐劑中的在0.1ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中的0.1mg(4-羥基-5-碘-3-硝基-酚)乙酰-牛血清白蛋白(NIP-BSA)(Reth等，1978)進(jìn)行免疫。21天后，在一組動(dòng)物中給每只動(dòng)物注射50μg按上述從下頜下唾液腺純化的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，而另一組動(dòng)物用相同量的預(yù)先加熱(72℃20分鐘)滅活的純化NGF處理。再過(guò)4天后，兩組動(dòng)物接受上述相同的NGF處理，并用在不完全Freund氏佐劑中的0.1mgNIP-BSA加強(qiáng)注射所有小鼠。4天后，經(jīng)眼眶后神經(jīng)叢吸血從每只動(dòng)物獲取大約0.4ml血液，并經(jīng)過(guò)向血清樣品中加入BSA中和抗-BAS抗體。然后在ELISA中測(cè)定NIP-特異性IgG滴度。在用含1％BSA的PBS飽和并用含0.05％(v/v)Tween-20的PBS漂洗后用NIP-BSA(35μg/ml溶于PBS中)覆蓋平板，將覆蓋的孔與系列稀釋的小鼠血清37℃溫育1小時(shí)；免疫前小鼠血清的合并液用作陰性對(duì)照。經(jīng)過(guò)加入堿性磷酸酶偶連的羊抗小鼠IgG檢測(cè)結(jié)合的Ig。經(jīng)過(guò)與NPP(Sigma)底物溶液溫育觀察最終反應(yīng)，記錄405nm下的吸光值。結(jié)果在下面表A和圖1和2中顯示。
表A 小鼠血清中的NIP-特異性IgG的滴度(Abs405任意單位)

圖1和2顯示了在老年小鼠中NGF處理顯著增加血清NIP-特異性IgG的滴度，而不影響在幼年小鼠中的反應(yīng)。
經(jīng)過(guò)使用偶連到葡聚糖上的NIP-BSA作為傳感器芯片在BIAcore機(jī)器上分析NGF處理的和對(duì)照小鼠產(chǎn)生的特異性IgG對(duì)抗原決定簇(NIP-BSA)的親和性。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明IgG對(duì)該抗原的親和力在老年小鼠中比在幼年小鼠中低得多，顯示在記憶細(xì)胞成熟中有缺損。然而在老年小鼠中用NGF處理可恢復(fù)高親和性IgG的生產(chǎn)，因此，不僅改良了體液免疫應(yīng)答的數(shù)量，而且改進(jìn)了其質(zhì)量(未顯示數(shù)據(jù))。
為了確定這種簡(jiǎn)單的NGF施用方案是否能在免疫后長(zhǎng)期維持特異性IgG的高滴度，我們從用NIP-BSA加強(qiáng)注射3個(gè)月后的同組老年免疫的小鼠中獲得血液樣品。經(jīng)ELISA測(cè)量NIP—特異性IgG的血清滴度。圖4顯示了NGF處理的動(dòng)物組甚至在加強(qiáng)免疫后長(zhǎng)期維持明顯的NIP—特異性IgG滴度。
總之，這些結(jié)果表明即使在初次反應(yīng)的末期，當(dāng)已知記憶B細(xì)胞出現(xiàn)了成熟時(shí)，單次施用NGF也可校正老年小鼠中體液免疫應(yīng)答的質(zhì)量和數(shù)量。此時(shí)NGF處理增加了在老年小鼠中不能由自身產(chǎn)生細(xì)胞因子的記憶B細(xì)胞的存活。相反，在正常幼年小鼠中NGF處理無(wú)效，其記憶淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生足夠量的NGF，因此得以存活。而且數(shù)據(jù)表明施用NGF可能有助于幾乎所有的初級(jí)或次級(jí)其特征為體液免疫應(yīng)答受損的免疫缺陷狀態(tài)(癌癥，艾滋病，慢性炎癥等。)本發(fā)明進(jìn)一步受如下實(shí)施例2支持。
實(shí)施例2小結(jié)在人類T和B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定了神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的生產(chǎn)。NGF僅由B細(xì)胞在組成上生產(chǎn)，該細(xì)胞也表達(dá)表面p140trk-A和p75NGFR分子，且因此有效結(jié)合和內(nèi)吞細(xì)胞因子。內(nèi)源性NGF的中和引起bcl-2蛋白質(zhì)消失和攜帶表面IgG或IgA的靜息淋巴細(xì)胞(包括記憶細(xì)胞的群體)程序性死亡，而表面IgM/IgD“處女(未接觸抗原的)”B淋巴細(xì)胞不受影響。體外施用中和抗-NGF抗體引起用破傷風(fēng)類毒素，硝基酚或砷酸鹽免疫的小鼠中特異性IgG滴度急劇減少和表面IgG或IgA B淋巴細(xì)胞的數(shù)目減少。因此，NGF是記憶B淋巴細(xì)胞的自分泌存活因子。引言幾乎在30年前(Levi-Montalcini，1987；Cohen，1960)作為第一個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的可溶性信號(hào)被描述和鑒定的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是稱為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的蛋白質(zhì)家族的一個(gè)成員，它對(duì)于調(diào)節(jié)發(fā)育和神經(jīng)元細(xì)胞的存活(Barde，1990)是關(guān)鍵的。其在維持神經(jīng)元在交感神經(jīng)節(jié)和感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中的存活的作用已確定了數(shù)十年(Levi-Montalcini和Angeletti，1966，1968)。在最近幾年，這些開(kāi)始的觀察已擴(kuò)展到中央神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的其它群體，包括前腦基底膽堿能細(xì)胞(Johnson等，1986；Shelton和Reichardt，1986)。據(jù)信與其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白一樣，NGF由佐細(xì)胞，例如，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生(Ernfors等，1990，Hofer等，1990)，因此，主要通過(guò)形成旁分泌環(huán)路調(diào)節(jié)神經(jīng)元的分化過(guò)程。
神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，包括NGF，腦產(chǎn)生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)和NT4/5通過(guò)特異性表面受體在細(xì)胞靶上發(fā)揮其效力，其中該受體通過(guò)結(jié)合和內(nèi)吞配體觸發(fā)代表適應(yīng)性應(yīng)答的級(jí)聯(lián)生化事件(參見(jiàn)Barde，1990)。根據(jù)對(duì)配體的低(Kd1nM)和高(Kd20pM)親和力，在靶細(xì)胞上可鑒定兩類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。最近已鑒定了這些受體的分子特性(Meakin和Shooter，1992)。稱為p75NGFR的75kDa糖蛋白介導(dǎo)與任何神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白具有相似親和力的低親和性結(jié)合(Chao，1994)。與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白以高特異性方式相互作用的，屬于trk酪氨酸激酶受體家族的蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)高親和力結(jié)合。p140trk-A與NGF結(jié)合，p140trk-B與BDNF，p140trk-C與NT-3和NT-4/5結(jié)合(Barbacid，1994)。很可能各種類型的受體給靶細(xì)胞傳遞不同的信號(hào)，因?yàn)閜75NGFR和p140trk-A似乎不形成NGF-結(jié)合雜二聚體(Jing等，1992)。令人感興趣的是，p75NGFR表現(xiàn)出與腫瘤壞死因子受體I和II，淋巴細(xì)胞表面抗原CD30，CD40，OX40和Fas/Apo-1表面抗原，涉及防止或介導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的分子的結(jié)構(gòu)同源性(參見(jiàn)Raffioni等，1993)。
由于首次描述從小鼠小顎腺細(xì)胞純化NGF，很明顯該因子也可由一些非神經(jīng)細(xì)胞類型產(chǎn)生(Levi-Montalcini，1987)，包括角質(zhì)細(xì)胞(DiMarco等，1993)和平滑肌細(xì)胞(Ueyama等，1993)。同樣，已報(bào)道了由免疫細(xì)胞表達(dá)trk原癌基因，例如單核細(xì)胞(Ehrard等，1993a)或T淋巴細(xì)胞(Ehrard等，1993b)。因此，相信神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，特別是NGF可在神經(jīng)系統(tǒng)外發(fā)揮重要作用。
這兩方面的證據(jù)，加上p75NGFR與一系列表面受體，包括細(xì)胞因子的那些表面受體具有結(jié)構(gòu)同源性，以及在一些自體免疫疾病患者中觀察到的NGF血漿水平升高(Dicou等，1993；Bracci-Laudiero等，1993；L.B.-L，L.A.，E.G.，和G.Rasi，未公開(kāi)觀察結(jié)果)引起對(duì)NGF和/或其受體是否由免疫系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行研究。本文顯示了NGF在基礎(chǔ)條件下由正常人B淋巴細(xì)胞合成和釋放，該細(xì)胞也在組成上表達(dá)p75NGFR和p140trk-A受體鏈。另外，內(nèi)源性NGF以自分泌方式發(fā)揮功能以維持具有記憶B細(xì)胞表面表型的細(xì)胞活性，且其體內(nèi)中和消除了次級(jí)體液免疫應(yīng)答。結(jié)果由正常人免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生NGF在測(cè)定NGF在各種病理學(xué)狀態(tài)下的血漿水平的研究過(guò)程中，我們注意到在慢性肝臟疾病和其它自體免疫條件的患者中存在特別高含量的細(xì)胞因子。為了測(cè)定在免疫活性細(xì)胞中哪一種細(xì)胞類型負(fù)責(zé)NGF生產(chǎn)，將正常外周血或扁桃體單核細(xì)胞(MNC)分離成T細(xì)胞，B細(xì)胞和單核細(xì)胞。然后在存在或不存在相關(guān)刺激的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞，隨后檢測(cè)NGF合成和分泌的生化證據(jù)。只有B淋巴細(xì)胞在組成上產(chǎn)生NGF且其N(xiāo)GF生產(chǎn)受金黃色葡萄糖球菌I Cowan菌株(SAC)的刺激而增強(qiáng)(a)。免疫印跡表明在含抗-NGF抗體的B淋巴細(xì)胞條件培養(yǎng)基中有一條主要帶，但無(wú)免疫IgG時(shí)沒(méi)有(數(shù)據(jù)未顯示)。經(jīng)代謝標(biāo)記的B細(xì)胞上清的免疫沉淀也顯示出一條單一的主帶，該主帶在還原條件下具有Mr13kDa，或在非還原條件下具有M，26kDa，其存在被包含過(guò)多未標(biāo)記的NGF阻斷。對(duì)B細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和上清的動(dòng)力學(xué)研究顯示無(wú)NGF貯存庫(kù)(數(shù)據(jù)未顯示)。與B細(xì)胞的這些結(jié)果相反，用T淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞即使在刺激后也未觀察到NGF生產(chǎn)。盡管最近報(bào)道了一些T細(xì)胞克隆可產(chǎn)生NGF(Ehrard等，1993b)，但似乎這類細(xì)胞很少在正常外周血或扁桃體樣品中存在(根據(jù)對(duì)來(lái)自至少20個(gè)不同的供體的細(xì)胞群體的分析)，因而把注意力集中在B細(xì)胞生產(chǎn)上。
在密度梯度上分離B淋巴細(xì)胞，高-和低-密度餾份分別作為靜息和體內(nèi)激活的細(xì)胞的代表進(jìn)行研究。兩種B細(xì)胞群體產(chǎn)生并有效釋放NGF(后者比前者多大約60％，數(shù)據(jù)未顯示)。接著用抗人免疫球蛋白鏈恒定區(qū)加白細(xì)胞介素-4的抗體(抗-μ+IL-4)或用SAC刺激靜息B細(xì)胞，兩種刺激對(duì)B細(xì)胞具有活性，前者僅激活表面IgM+細(xì)胞，后者基本上激活所有的B淋巴細(xì)胞(Romagnani等，1982)。很明顯抗-μ+IL-4刺激是無(wú)效的，而SAC極大地增強(qiáng)NGF的合成和分泌。經(jīng)ELISA分析相似培養(yǎng)物的上清證實(shí)抗-μ+IL-4刺激的細(xì)胞和未刺激的細(xì)胞逐漸降低了NGF生產(chǎn)，而SAC-刺激細(xì)胞強(qiáng)烈增加NGF生產(chǎn)。相對(duì)照，兩種刺激均有效，其誘導(dǎo)的增殖刺激指數(shù)分別為＞10和＞20。這些發(fā)現(xiàn)表明SAC，而不是抗-μ+IL-4觸發(fā)導(dǎo)致NGF生產(chǎn)的代謝途徑。另一種可能的解釋是正常情況下與抗-μ+IL-4應(yīng)答的淋巴細(xì)胞，即，大多數(shù)未接觸抗原的sμ+δ+細(xì)胞在sIg交聯(lián)后不改變NGF生產(chǎn)(或可能不能生產(chǎn)NGF)，而與SAC應(yīng)答的淋巴細(xì)胞，即也包括具有sγ+或sα+(sγ+/α+)表型的細(xì)胞的群體卻改變，這表明在對(duì)后一種細(xì)胞類型特異性的功能過(guò)程中涉及細(xì)胞因子。由正常人免疫活性細(xì)胞表達(dá)NGF受體分子NGF由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的觀察結(jié)果導(dǎo)致確定是否也存在NGF受體，使得自分泌反饋環(huán)成為可能。為達(dá)到該目的，對(duì)扁桃體或外周血T細(xì)胞，B細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)兩種神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞表現(xiàn)的NGF結(jié)合分子，p140trk-A(trk)和p75NGFR進(jìn)行了研究。使用特異性抗體進(jìn)行的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的Western印跡分析表明所研究的每種細(xì)胞類型均表達(dá)trk分子；令人感興趣的是，p75NGFR僅由B細(xì)胞生產(chǎn)。而且，經(jīng)過(guò)FACS，隨后用抗p75NGFR鏈的抗體和用Tmg13.1(最近描述的針對(duì)trk分子細(xì)胞外細(xì)胞因子結(jié)合區(qū)的單克隆抗體(Eager，1991))染色研究了相同的細(xì)胞。與免疫化學(xué)研究一致，僅在B細(xì)胞上觀察到兩種染色，而T細(xì)胞和單核細(xì)胞僅被Tmg13.1染色(數(shù)據(jù)未顯示)。
由B淋巴細(xì)胞受刺激表達(dá)兩種受體鏈，即神經(jīng)細(xì)胞的典型方式，表明這些細(xì)胞用于應(yīng)答由細(xì)胞因子傳遞的所有各種信號(hào)。因而檢查了B細(xì)胞以便獲得與NGF在淋巴細(xì)胞中的功能相關(guān)的數(shù)據(jù)。
為了證實(shí)細(xì)胞因子的結(jié)合并分析其功能效應(yīng)，將扁桃體B淋巴細(xì)胞分離成小的和大的細(xì)胞，并使用平衡結(jié)合試驗(yàn)研究其結(jié)合和內(nèi)吞N(yùn)GF的能力。靜息和體內(nèi)激活的B細(xì)胞均能有效內(nèi)吞125I-NGF(數(shù)據(jù)未顯示)。觀察結(jié)果是用大型和靜息B細(xì)胞獲得的125I-NGF的飽和曲線及其Scatchard轉(zhuǎn)化。大型細(xì)胞按預(yù)期表達(dá)兩類結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)分別為Kd30pM(30000位點(diǎn)/細(xì)胞)和Kd1nM(106結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞)，與在神經(jīng)細(xì)胞上報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。令人驚奇的是，當(dāng)在小型靜息B細(xì)胞上進(jìn)行相同分析時(shí)，觀察不到飽和結(jié)合，即使用極高的125I-NGF濃度培養(yǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)，盡管兩種受體鏈明顯表達(dá)且細(xì)胞因子有效內(nèi)吞。這一顯著的差異表明內(nèi)源性配體實(shí)際上占據(jù)受體位點(diǎn)的可能性，它是當(dāng)自分泌環(huán)路發(fā)揮作用時(shí)經(jīng)常遇到的情況(Cozzolino等，1989；Cozzolino等，1990)。因此，純化的小型B淋巴細(xì)胞用在pH3.0緩沖的細(xì)胞培養(yǎng)基簡(jiǎn)單處理(4℃60秒)，然后在結(jié)合試驗(yàn)前用正規(guī)培養(yǎng)基洗滌。在這些條件下，可檢測(cè)分別具有90000和106結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞的高-和低-親和性(分別為Kd170pM和1nM)受體。為了進(jìn)一步證實(shí)由于存在自分泌環(huán)路這些位點(diǎn)確實(shí)被NGF占據(jù)的假說(shuō)，在SDS-PAGE中電泳酸性pH洗脫物(和作為對(duì)照的中性pH洗脫物)，印跡并用特異性抗NGF抗體染色。僅在酸性洗脫物中檢測(cè)到細(xì)胞因子?？傊@些結(jié)果證實(shí)了B淋巴細(xì)胞表達(dá)兩類完整功能的NGF受體。B淋巴細(xì)胞中內(nèi)源性NGF中和的影響上面表明B細(xì)胞產(chǎn)生NGF并表達(dá)高-和低-親和力受體的數(shù)據(jù)支持了自分泌環(huán)路的假說(shuō)。為了了解由該環(huán)路發(fā)揮的作用，中和內(nèi)源性NGF并測(cè)定其對(duì)B淋巴細(xì)胞特性的影響。為達(dá)到該目的，采用中和抗NGF抗體或在選擇實(shí)驗(yàn)中采用NGF反義寡核苷酸。首先使用以抗-μ+IL-4或SAC刺激的靜息外周血或扁桃體B淋巴細(xì)胞在常規(guī)3H-胸苷摻入試驗(yàn)中試驗(yàn)抗-NGF抗體。在對(duì)照免疫前抗體存在下兩種刺激均誘導(dǎo)強(qiáng)烈應(yīng)答；在抗-NGF抗體存在下，不影響對(duì)抗-μ+IL-4的應(yīng)答，而對(duì)于SAC減少20-30％(表1)，初步表明NGF涉及對(duì)SAC的增殖應(yīng)答。然而，加入外源性重組NGF不能增加3H-胸苷摻入(表1)，即使存在最適度以下劑量的刺激(數(shù)據(jù)未顯示)，進(jìn)一步表明細(xì)胞因子不能充當(dāng)生長(zhǎng)因子。同樣，抗-NGF抗體不能調(diào)節(jié)體內(nèi)激活前B細(xì)胞低密度的自發(fā)增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。這些用抗-μ+IL-4或SAC的刺激實(shí)驗(yàn)又表明不同的細(xì)胞群體與促細(xì)胞分裂原應(yīng)答，且它們除了NGF生產(chǎn)外，可根據(jù)NGF利用在功能上進(jìn)行劃分。為了支持這一概念，經(jīng)過(guò)淘選成sμ+δ+細(xì)胞和sγ+及sα+細(xì)胞(sγ+/α+)分離靜息扁桃體B淋巴細(xì)胞，然后用SAC或抗-μ+IL-4刺激。表1顯示了sμ+δ+細(xì)胞與SAC應(yīng)答的增殖不受中和抗-NGF抗體的影響。與預(yù)期一樣，sγ+/α+細(xì)胞針對(duì)抗-μ+IL-4的增殖極弱(數(shù)據(jù)未顯示)，而這些細(xì)胞針對(duì)SAC應(yīng)答極強(qiáng)；當(dāng)在抗-NGF抗體存在下進(jìn)行刺激時(shí)，3H-胸苷摻入降低＞80％(p＜0.0001)。這些發(fā)現(xiàn)，結(jié)合對(duì)NGF生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞因子對(duì)sγ+/α+細(xì)胞是關(guān)鍵的且對(duì)sμ+δ+細(xì)胞明顯是非必需的。
這些數(shù)據(jù)導(dǎo)致進(jìn)一步研究NGF對(duì)靜息sμ+δ+細(xì)胞和sγ+/α+細(xì)胞的效力?？紤]到不能增加B細(xì)胞的體外生長(zhǎng)(表1)且已知NGF維持神經(jīng)元細(xì)胞存活的特性(其缺乏時(shí)細(xì)胞走向程序死亡)，需考慮的是NGF是否可增強(qiáng)靜息sμ+δ+細(xì)胞或sγ+/α+細(xì)胞的存活。因此，在抗NGF抗體或NGF反義寡核苷酸存在下培養(yǎng)從扁桃體純化的上述群體不同的時(shí)間間隔，記錄片斷化的/完整的DNA的比率，作為走向細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞百分比的測(cè)量值。當(dāng)分析sμ+δ+細(xì)胞時(shí)，用抗-NGF試劑和用對(duì)照免疫前IgG(或有義寡核苷酸)處理的細(xì)胞均具有相等比率的細(xì)胞走向細(xì)胞程序死亡。作為對(duì)比，用抗-NGF抗體或寡核苷酸處理的sγ+/α+細(xì)胞培養(yǎng)物在60小時(shí)時(shí)含有＞60％的細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞，而對(duì)照培養(yǎng)物具有＜20％的細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞(p＜0.0001)；令人感興趣的是，細(xì)胞程序死亡的動(dòng)力學(xué)比sμ+δ+細(xì)胞慢得多，這表明后一種細(xì)胞和sγ+/α+細(xì)胞之間在體外生命潛力方面有重要差異。
總之，這組實(shí)驗(yàn)證實(shí)了內(nèi)源性NGF是sγ+/α+細(xì)胞的自分泌存活因子，因?yàn)槠渲泻陀|發(fā)這些細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡，但對(duì)于sγ+/α+細(xì)胞并非如此，表明只有前一種細(xì)胞可合成細(xì)胞因子。為了試驗(yàn)這一概念，經(jīng)ELISA分析純化群體的NGF生產(chǎn)。很明顯sγ+/α+細(xì)胞產(chǎn)生比sμ+δ+細(xì)胞至少多8倍的NGF(409 19PG/107個(gè)細(xì)胞對(duì)51 4pg/107個(gè)細(xì)胞；n＝9)。
因此，為了確定亞群之間的功能差異是否是由于NGF的利用，而不是由于其生產(chǎn)，研究了導(dǎo)致細(xì)胞程序死亡途徑的一個(gè)重要決定子，bcl-2蛋白更新(Korsmeyer，1992)。用抗-NGF或?qū)φ湛贵w培養(yǎng)純化的靜息sγ+/α+和sμ+δ+群體18小時(shí)，然后裂解以分析其細(xì)胞內(nèi)bcl-2蛋白的含量。內(nèi)源性NGF的中和引起來(lái)自sγ+/α+細(xì)胞的bcl-2蛋白完全消失，但不影響sμ+δ+細(xì)胞中的bcl-2蛋白含量，揭示了該亞群在NGF利用方面的主要差異?？?NGF抗體耗盡體內(nèi)記憶B細(xì)胞由于sμ+δ+表型鑒定為未接觸抗原的B細(xì)胞，而具有sγ+/α+表型的細(xì)胞包含已進(jìn)行Ig恒定區(qū)類型轉(zhuǎn)換過(guò)程的那些淋巴細(xì)胞，包括記憶B淋巴細(xì)胞(Kishimoto和Hirano，1989；Sprent，1994)，假定自分泌NGF用作記憶B細(xì)胞的存活因子，決定使用體內(nèi)研究分析完全確定的半抗原特異性系統(tǒng)硝基酚-BSA(NP)或Arsonate-KLH(Ars)，或復(fù)合(嵌合)抗原系統(tǒng)破傷風(fēng)類毒素(TT)來(lái)檢驗(yàn)這一觀點(diǎn)。首先，證實(shí)了在人和鼠B細(xì)胞之間，NGF合成(鼠sγ+/α+和sμ+δ+細(xì)胞分別在組成上產(chǎn)生234±21和28±3pg/107個(gè)細(xì)胞)，NGF受體表達(dá)[鼠未裂解的sIg+細(xì)胞每細(xì)胞表達(dá)≈4800高親和力(Kd≈135pM)和≈106低親和力(Kd≈1.1nM)的結(jié)合位點(diǎn)]，和細(xì)胞因子對(duì)體外細(xì)胞存活的功能意義(sγ+/α+細(xì)胞接觸中和抗-NGF抗體時(shí)產(chǎn)生≈70％的DNA片斷)是基本上相同的。因此，用相關(guān)抗原免疫接種20個(gè)BALB/c或C57BL/6小鼠組，40天后一組10個(gè)動(dòng)物接受單一劑量的中和抗-NGF IgG，而用非免疫IgG作為對(duì)照注射其它10只小鼠。再過(guò)48小時(shí)后，所有動(dòng)物接受回憶劑量的各自抗原，4天后處死所有小鼠，經(jīng)過(guò)ELISA測(cè)定抗原特異性IgM和IgG的血漿濃度。接受抗-NGF抗體的動(dòng)物顯著低于對(duì)照的針對(duì)免疫原的特異性IgG水平(p＜0.001)。相對(duì)比，在抗原特異性IgM濃度中未觀察到區(qū)別，表明新形成的未接觸抗原的B淋巴細(xì)胞遇到免疫原產(chǎn)生的抗體應(yīng)答，即次級(jí)的(初級(jí))應(yīng)答不受影響。為了進(jìn)一步支持后一結(jié)論，用抗-NGF IgG或?qū)φ誌gG首先處理另外兩組小鼠，然后(48小時(shí)后)用TT免疫，一周后處死動(dòng)物以測(cè)定其TT-特異性IgM血漿水平，在兩組群體中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(在處理的動(dòng)物中0.275±0.032Abs405任意單位而對(duì)照為0.284±0.041)(數(shù)據(jù)未顯示)。
上述發(fā)現(xiàn)表明，與體外數(shù)據(jù)一致，抗-NGF抗體能誘導(dǎo)大多數(shù)同種型轉(zhuǎn)換記憶B細(xì)胞的細(xì)胞死亡，從而抑制次級(jí)體液應(yīng)答。為了獲得支持該觀點(diǎn)的直接證據(jù)，用抗-NGF IgG或?qū)φ誌gG處理兩組正常成年小鼠，三天后分離脾細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞熒光光度術(shù)測(cè)定B細(xì)胞亞群體的比例。與對(duì)照相比，處理的小鼠脾臟中sγ+/α+細(xì)胞的百分比顯著下降，而sμ+δ+細(xì)胞百分比在兩組之間觀察不到明顯的差異。總之，這組實(shí)驗(yàn)表明NGF在體內(nèi)維持記憶B細(xì)胞中發(fā)揮作用。NGF不是B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)換因子上述體內(nèi)NGF中和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與細(xì)胞因子是記憶B淋巴細(xì)胞的自分泌存活因子的假說(shuō)一致。然而，如果NGF涉及控制IgMIgG類型轉(zhuǎn)換以及CD40配體的機(jī)制(Aruffo等，1993)可觀察到相同結(jié)果。然而，如果這樣，無(wú)論何時(shí)在抗-NGF抗體存在下體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞多克隆群體分化應(yīng)觀察到更高比例的產(chǎn)IgM細(xì)胞，以及產(chǎn)IgG-或IgA細(xì)胞的量減少。因此，用商陸促分裂原培養(yǎng)正常人外周血單核細(xì)胞10天以刺激多克隆分化(Kishimoto和Hirano，1989)，且用抗-NGF IgG或非免疫IgG作為陰性對(duì)照，或用可溶性CD40五聚體，即一種遺傳改造的防止CD40-gp39相互作用的分子(Fanslow等，1992)作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)ELISA進(jìn)行的Ig測(cè)量顯示在商陸促分裂原刺激的培養(yǎng)物中抗-NGF抗體誘導(dǎo)IgG和IgA水平有限下降，但I(xiàn)gM水平比對(duì)照培養(yǎng)物低20％(表2)。相對(duì)比，可溶性CD40五聚體與對(duì)照相比引起IgG和IgA分泌的抑制，且IgM分泌率增加(表2)。
這些實(shí)驗(yàn)表明在可能負(fù)責(zé)觀察到的改變的機(jī)制中存在明顯的差異。事實(shí)上，可溶性CD40五聚體引起Ig類型轉(zhuǎn)換表現(xiàn)的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞在轉(zhuǎn)換前(即，s+)區(qū)域的“聚集”；相反，抗-NGF抗體僅引起產(chǎn)IgG-和產(chǎn)IgA細(xì)胞急劇減少，它是抗-NGF抗體誘導(dǎo)的各自前體消失(死亡)的證據(jù)。這些數(shù)據(jù)與上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，其中s+或s+細(xì)胞的減少并不伴隨著s+細(xì)胞的增加?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)有力的表明NGF不充當(dāng)正常人或鼠B淋巴細(xì)胞的“轉(zhuǎn)換因子”。討論精確辨別大量化學(xué)結(jié)構(gòu)并保留這些遭遇的痕跡的能力(特異性和記憶)是免疫系統(tǒng)的標(biāo)記。而特異性的分子基礎(chǔ)主要通過(guò)對(duì)T和B淋巴細(xì)胞表達(dá)的抗原受體的生化和遺傳進(jìn)行廣泛鑒定來(lái)限定，對(duì)免疫記憶的了解仍然主要是表象的。特別是仍需要限定象大多數(shù)淋巴細(xì)胞一樣的單個(gè)記憶細(xì)胞在靜止條件下是具有有限的和受限制的壽命，還是其為持續(xù)多年，可能一生的長(zhǎng)生細(xì)胞。已提出了一些假說(shuō)，流行的一個(gè)是抗原在淋巴器官中的長(zhǎng)期存留導(dǎo)致維持免疫記憶的免疫細(xì)胞連續(xù)，緩慢增殖(Gray，1993)。然而，難以想象抗原如何能保留多年不被修飾，特別是如果其為蛋白質(zhì)時(shí)(Sprent，1994)。事實(shí)上，已提供了免疫學(xué)記憶可被非周期性細(xì)胞相當(dāng)長(zhǎng)期保持的證據(jù)(Schittek和Raiewsky，1990)，盡管使其存活的分子機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明的證據(jù)表明記憶B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)可遵循Bizzozzero“長(zhǎng)期”細(xì)胞(其原型是神經(jīng)元)的相同命運(yùn)，因?yàn)樗鼈兙哂挟a(chǎn)生自分泌存活因子，NGF的能力。
主要的論據(jù)表明細(xì)胞因子充當(dāng)存活因子而不是生長(zhǎng)因子，這是基于這樣的觀察結(jié)果，即經(jīng)過(guò)中和抗-NGF抗體防止NGF受體觸發(fā)純化的sγ+/α+靜息B細(xì)胞引起經(jīng)過(guò)細(xì)胞程序死亡而產(chǎn)生大量細(xì)胞死亡。另外，當(dāng)用誘導(dǎo)強(qiáng)烈增殖反應(yīng)的抗-μ抗體+IL-4刺激靜息未分離的B細(xì)胞時(shí)，不增加其N(xiāo)GF產(chǎn)率，且外源性重組NGF不增加其增殖，也不受抗-NGF抗體的影響。而且，當(dāng)SAC用于刺激相同細(xì)胞時(shí)，分泌的NGF量增加，但進(jìn)一步加入外源性細(xì)胞因子不能加強(qiáng)3H-胸苷摻入，即使使用適度以下劑量的刺激。同樣，低密度的體內(nèi)激活前的B細(xì)胞表達(dá)更多NGF，但飽和劑量的抗-NGF抗體不能消除B細(xì)胞增殖，正如細(xì)胞因子是生長(zhǎng)因子時(shí)可預(yù)期的?？傊?，這些因素更加表明NGF是一種存活因子。
這些結(jié)論似乎與過(guò)去幾年顯示的淋巴細(xì)胞上的NGF具有內(nèi)在刺激生長(zhǎng)活性的報(bào)道相抵觸(Otten等，1989；Brodie和Gelfand，1992)。然而，考慮到根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，加入外源性NGF可降低某些體外自發(fā)死亡的細(xì)胞數(shù)[特別是來(lái)自IgA-和IgG4-分泌細(xì)胞的那些細(xì)胞(Kimata等，1991)]是因?yàn)榈兔芏扰囵B(yǎng)條件，最終導(dǎo)致培養(yǎng)物中更高的基礎(chǔ)增殖，可重新解釋這些報(bào)道。而且，正如IL-3和干細(xì)胞因子支持液體培養(yǎng)物中休眠的非周期淋巴造血祖先細(xì)胞長(zhǎng)期存活(Katayama等，1993)的觀察結(jié)果所顯示的，生長(zhǎng)和存活因子之間的區(qū)別可能純粹是命名上的。
B細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生NGF的發(fā)現(xiàn)對(duì)NGF“致炎”作用的證據(jù)(Aloe等，1994)提供了進(jìn)一步的支持，它可能以旁分泌方式有助于炎癥細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞的功能，該細(xì)胞帶有與細(xì)胞因子反應(yīng)所必需的受體機(jī)制(Ehrhard等，1993a)，但不能產(chǎn)生該細(xì)胞因子(Santambrogio等，1994)。相似情況適用于T淋巴細(xì)胞。在本研究中，沒(méi)有嘗試從表型或功能觀點(diǎn)更精確地鑒定表達(dá)NGF受體因而可能與之反應(yīng)的T細(xì)胞群體或亞群體。然而，B細(xì)胞產(chǎn)生的NGF可能在將B細(xì)胞抗原提供給T淋巴細(xì)胞的復(fù)合事件中發(fā)揮重要作用，特別是當(dāng)需要發(fā)生次級(jí)免疫應(yīng)答時(shí)。事實(shí)上，sIgG+記憶B細(xì)胞表達(dá)對(duì)抗原具有高親和力的受體(Siekevitz等，1987；MacLennan和Gray，1986)，因而當(dāng)抗原量有限時(shí)在發(fā)生的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合中優(yōu)先。其釋放NGF的能力可能對(duì)于適當(dāng)激活記憶或原初T細(xì)胞是必需的。
本研究發(fā)現(xiàn)的重點(diǎn)是B淋巴細(xì)胞受刺激表達(dá)已知結(jié)合NGF的兩條鏈(trk分子和p75NGFR分子)，而這是神經(jīng)元細(xì)胞的典型特征。盡管NGF是第一個(gè)鑒定的細(xì)胞因子，但關(guān)于其與哪一種受體鏈相互作用觸發(fā)特異性代謝途徑仍然所知甚少，在結(jié)合單一配體分子中兩條鏈?zhǔn)欠駞f(xié)同作用也不清楚，因?yàn)殛P(guān)于這一主題已報(bào)道的結(jié)果相矛盾(Jing等，1992；Benedetti等，1993；Huber和Chao，1995)。然而，已顯示當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)未結(jié)合時(shí)p75NGFR的表達(dá)誘導(dǎo)組成上的神經(jīng)細(xì)胞死亡，而其被NGF或單克隆抗體結(jié)合抑制細(xì)胞死亡(Rabizadeh等，1993)，這表明它本身能傳遞生物學(xué)信號(hào)，這與p75NGFR和一系列受體鏈，包括TNFRI，TNFRII，F(xiàn)as/Apo-1和CD40之間的結(jié)構(gòu)同源性一致，這些受體鏈均涉及誘導(dǎo)或防止靶細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡(參見(jiàn)Raffioni等，1993)。這些后來(lái)的數(shù)據(jù)完全符合中和自分泌NGF，但未用抗-p75NGFR處理測(cè)定B細(xì)胞死亡的發(fā)現(xiàn)(準(zhǔn)備中的原稿)，表明這些受體鏈作為作用于存活/死亡分配的信號(hào)介導(dǎo)。令人感興趣的是，盡管p75NGFR和CD40之間具有結(jié)構(gòu)同源性，但很明顯NGF不參與Ig類型轉(zhuǎn)換過(guò)程。
在有些細(xì)胞類型中，如角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞中(Yaar等，1994；Di Marco等，1993)，trk介導(dǎo)有效刺激細(xì)胞增殖的信號(hào)，與神經(jīng)元細(xì)胞中出現(xiàn)的情況相反，其中NGF很可能經(jīng)過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶激活防止trk結(jié)合后的細(xì)胞程序死亡(Yao和Cooper，1995)。這一差異可這樣解釋，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞因子受體，通?？赡艽嬖诳蓞⑴c與trk和/或p75NGFR形成多鏈?zhǔn)荏w復(fù)合物的其它鏈。后一種假說(shuō)也可解釋在大型和靜息B細(xì)胞群體表現(xiàn)的NGF結(jié)合親和力中觀察到的有限但明顯的差異(分別為≈30pM與≈170pM)。
根據(jù)表面Ig同種型表達(dá)分離正常靜息B淋巴細(xì)胞鑒定了兩種功能上不同的亞群體，即，sμ+δ+未接觸抗原的細(xì)胞和sγ+/α+記憶細(xì)胞(Kishimoto和Hirano，1989)。我們使用該研究認(rèn)識(shí)到NGF自分泌環(huán)路的作用并觀察到一些特征，這些特征導(dǎo)致形成這樣一種觀點(diǎn)，即在人類和小鼠中，細(xì)胞因子是記憶細(xì)胞的內(nèi)源性存活因子。首先，盡管未接觸抗原的細(xì)胞和記憶細(xì)胞均基本上表達(dá)相同水平的NGF受體，但后者產(chǎn)生至少比前者多8倍的NGF蛋白質(zhì)。其次，用中和抗-NGF抗體處理誘導(dǎo)sγ+/α+細(xì)胞中的bcl-2蛋白質(zhì)和同樣的大量DNA片斷消失，而對(duì)于sμ+δ+細(xì)胞則無(wú)足輕重。第三，體內(nèi)施用抗-NGF抗體抑制了第二抗原特異性免疫應(yīng)答，但不能影響初級(jí)IgM應(yīng)答。最后，給正常動(dòng)物單次注射抗-NGF抗體引起同種型轉(zhuǎn)換的B淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著降低，該淋巴細(xì)胞包括記憶細(xì)胞。另一方面，這些發(fā)現(xiàn)得出了至少兩個(gè)重要結(jié)果，即發(fā)生NGF基因表達(dá)的成熟階段和NGF與bcl-2之間的關(guān)系。
由sμ+δ+細(xì)胞產(chǎn)生較低但可檢測(cè)的NGF表明在B細(xì)胞個(gè)體發(fā)生期間相當(dāng)早期開(kāi)始，其功能意義需進(jìn)一步解釋。然而，根據(jù)對(duì)不同B細(xì)胞亞群體數(shù)量的定量結(jié)果，表明sμ+細(xì)胞也包括記憶淋巴細(xì)胞，能產(chǎn)生分泌Ig而不是IgM的細(xì)胞(Gray，1993)。如果這樣，我們觀察到的sμ+細(xì)胞產(chǎn)生的NGF可由后一種細(xì)胞產(chǎn)生，在這種情況下，NGF基因表達(dá)可能與操縱Ig類型轉(zhuǎn)換的相同分子機(jī)制相聯(lián)系，且很可能受其調(diào)節(jié)。
目前對(duì)于NGF受體鏈與bcl-2相聯(lián)系的分子途徑所知甚少，其中，bcl-2是在神經(jīng)元和淋巴細(xì)胞，特別是記憶B細(xì)胞中調(diào)節(jié)存活的關(guān)鍵蛋白質(zhì)(Batistatoua等，1993；Hawkins和Vaux，1994；Nunez等，1991)，事實(shí)上，該蛋白質(zhì)從用中和抗-NGF抗體處理的靜息sIgG+或sIgA+細(xì)胞中消失。最近，已提供的證據(jù)表明可能涉及活性氧種類，更普遍的是細(xì)胞氧化還原潛力的改變(Greenlund等，1995)。在這一點(diǎn)上，已表明在EBV感染的組成上表達(dá)氧化氮合成酶的B淋巴細(xì)胞中低速率的氧化氮產(chǎn)生防止了細(xì)胞程序死亡(Mannick等，1994)，很可能在多種水平上作用于巰基敏感性途徑，該途徑也調(diào)節(jié)bcl-2的代謝，而bcl-2對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原潛力敏感并參與其維持(Hockenbery等，1993)。令人感興趣的是，Mosialos等(1995)最近顯示在轉(zhuǎn)導(dǎo)TNF/Fas/NGF受體家族信號(hào)的蛋白質(zhì)之間存在功能關(guān)系；因?yàn)門(mén)NF誘導(dǎo)細(xì)胞氧化還原平衡的改變(Ishii等，1992)，這些分子也可參與NGF誘導(dǎo)的適應(yīng)性應(yīng)答。我們目前考察了NGF中和后記憶B細(xì)胞中的后一種假說(shuō)。
一個(gè)值得考慮的顯著的證據(jù)是這樣一種觀察結(jié)果，在淋巴細(xì)胞中，至少細(xì)胞程序死亡和細(xì)胞存活通過(guò)自分泌環(huán)路調(diào)節(jié)，前者涉及Fas/Apo-1及其配體(Brunner等，1995；Dhein等，1995；Ju等，1995)，后者涉及NGF(根據(jù)我們的數(shù)據(jù))。這一安排確保了及時(shí)滿足指定細(xì)胞進(jìn)入任一途徑所需的分子要求，并幫助了解淋巴器官如何定位，其中在該位置以有序方式發(fā)生復(fù)合物的功能改變。自分泌環(huán)路是開(kāi)放式的(涉及配體的分泌和與細(xì)胞外受體的結(jié)合，不是隔絕或內(nèi)部分泌)的證據(jù)有力地表明兩個(gè)系統(tǒng)的功能受受體拮抗劑或可溶性受體的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生“社會(huì)性”的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制單個(gè)淋巴細(xì)胞的命運(yùn)。令人感興趣的是，后一種復(fù)雜性可產(chǎn)生一些使用藥物學(xué)方法干擾該動(dòng)力學(xué)的機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)程序細(xì)胞分離和培養(yǎng)從外周血單核細(xì)胞或扁桃體細(xì)胞經(jīng)過(guò)E-花結(jié)試驗(yàn)分離人T淋巴細(xì)胞。經(jīng)過(guò)附著在塑料平皿上分離單核細(xì)胞。使用CD19-覆蓋的磁珠從無(wú)-T群體進(jìn)一步純化B淋巴細(xì)胞。使用抗-CD3ε單克隆抗體(Boheringer Mannheim，Milano，Italy)經(jīng)兩輪陰性選擇從脾臟分離按上述方法除掉單核細(xì)胞的鼠B淋巴細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定群體的純度超過(guò)95％。用Percoll密度梯度將人和鼠B細(xì)胞進(jìn)一步分成靜息(高密度)和活化(低密度)細(xì)胞。按流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定扁桃體靜息B細(xì)胞中dlsIgM+，sIgG+，和sIgA+細(xì)胞的比例一般分別是65％，25％和10％。
對(duì)于增殖試驗(yàn)，在含5％CO2的加濕空氣中，在補(bǔ)充了10％v/v胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)的RPMI1640中以106/ml的濃度在96-孔平板中培養(yǎng)B細(xì)胞72小時(shí)。使用1∶10000最終稀釋的加熱滅活的金黃色葡萄球菌I Cowan菌株(SAC，BoheringerMannheim)。使用100U/ml的人rIL-4(R&D，Minneapolis，MN)，使用1g/ml兔抗人鏈，使用100ng/mlNGF(Boheringer Mannheim)，以10μg/ml使用中和性羊抗NGF抗體[R&D，在IMR-32成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖試驗(yàn)(Janet等，1995)中與100ng/mlNGF反應(yīng)的ND50＝10μg/ml]或免疫前的羊IgG。在培養(yǎng)的最后12小時(shí)中用0.5Ci的3H-胸苷脈沖標(biāo)記細(xì)胞并在β-閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
對(duì)于免疫球蛋白的生產(chǎn)，在商陸促分裂原(GIBCO)，10g/ml，抗-NGF抗體(10g/ml)，免疫前的羊IgG(10g/ml)，CD40-或CD4-上清(1∶10最終稀釋度)存在或不存在的條件下，培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞12小時(shí)。收集上清并經(jīng)ELISA試驗(yàn)IgG，IgA，IgM生產(chǎn)。
對(duì)于NGF生產(chǎn)的分析，在補(bǔ)充了10％(v/v)Nutridoma(Sigma)的無(wú)血清RPMI-1640中，在SAC(1∶10000最終稀釋度)，植物凝集素(PHA-P，1g/ml，GIBCO)，脂多糖(LPS，10g/ml，Sigma)存在或不存在的條件下以107/ml培養(yǎng)細(xì)胞(2×107)不同的時(shí)間，經(jīng)過(guò)ELISA測(cè)定上清。
使用按上述制備的用兔抗-人IgM和兔抗-人IgD(稱為sμ+δ+)，或兔抗人IgG加兔抗人IgA(稱為s+/+)，或羊抗小鼠IgM和IgD或IgG和IgA覆蓋的塑料平皿(Wysocki等，1978)經(jīng)過(guò)淘選程序分離B細(xì)胞亞群體。經(jīng)過(guò)使用特異性mAbs的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)測(cè)定分離的群體純度通常＞90％。為了排除sIg受體觸發(fā)后激活過(guò)程的干擾，使用互補(bǔ)非附著群體(例如，s-細(xì)胞，包含s+/+細(xì)胞的大多數(shù)細(xì)胞)重復(fù)所有實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3輪Ig-覆蓋的平板貼壁后回收。細(xì)胞活力測(cè)定和DNA的片斷化用10μg/ml抗-NGF IgG或免疫前的IgG，或者用20μM與NGF編碼區(qū)的核苷酸54-72互補(bǔ)的18-聚體反義或有意義寡核苷酸(Primm，Milano，Italy)以5×106/ml培養(yǎng)的人和鼠B細(xì)胞亞群體用5mM Tris，20mM EDTA，和0.5％(v/v)Triton X-100，pH8.0以1∶1.5稀釋，使其在冰上裂解15分鐘，之后以27000xg離心20分鐘分離完整的染色質(zhì)(沉淀)與DNA片斷(上清)。沉淀重懸于5ml含有10mMTris和1mM EDTA pH8.0的緩沖液中，使用二苯胺試劑(1.5％二苯胺溶于乙酸加10％乙醛)在30℃處理16小時(shí)(Burton，1956)測(cè)定沉淀和上清樣品中的DNA含量。測(cè)定各樣品在600nm下的光密度。根據(jù)McConkey等(1989)計(jì)算DNA片斷化的百分?jǐn)?shù)。經(jīng)過(guò)苔盼藍(lán)染料排斥試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。放射性配體結(jié)合研究為了分析表面NGF受體，用在pH3.0下緩沖的RPMI-1640在冰上酸處理人靜息扁桃體或鼠脾臟B淋巴細(xì)胞1分鐘并用PBS洗滌。然后在過(guò)量未標(biāo)記的人rNGF存在或不存在的條件下用不同濃度的125I-NGF(Amersham，Milano，比活為50Ci/g)以106/ml在4℃培養(yǎng)酸處理的靜息B淋巴細(xì)胞和體內(nèi)活化的大型B淋巴細(xì)胞2小時(shí)。洗滌細(xì)胞并在γ-計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)結(jié)合的放射活性。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的特異性結(jié)合且經(jīng)過(guò)科學(xué)程序分析數(shù)據(jù)(圖P，Biosoft英國(guó)劍橋)。對(duì)于放射性配體內(nèi)吞，在過(guò)量未標(biāo)記的NGF存在或不存在的條件下用0.5nM125I-NGF按上述培養(yǎng)細(xì)胞，洗滌并在37℃培養(yǎng)2小時(shí)，然后用甘氨酸緩沖液(pH2.8)處理并裂解。經(jīng)過(guò)在γ-計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)測(cè)定膜結(jié)合的(酸洗脫物)和與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的放射活性。TCA-濃縮來(lái)自108個(gè)靜息B細(xì)胞的中性pH洗滌液和酸性pH洗脫物，印跡到硝酸纖維素膜上，并用抗-NGF IgG或用免疫前IgG免疫染色以檢測(cè)受體結(jié)合的內(nèi)源性配體。免疫化學(xué)分析對(duì)于Western印跡分析，TCA-沉淀2×107個(gè)細(xì)胞的上清或NP-40(0.25％溶于PBS)溶胞產(chǎn)物，用乙醇洗滌并在2-巰基乙醇Laemmli緩沖液中以1∶1稀釋。在SDS-PAGE中電泳樣品，對(duì)硝基纖維素濾膜印跡并用合適的抗體[羊抗-NGF，兔抗-trk(Genzyme，Boston，MA)，小鼠抗-p75NGFR(Boheringer Mannheim)，小鼠抗-bcl-2(Santa CruzTechnology，Milano)]或用免疫前Ig免疫染色。使用合適的第二抗體和ECL檢測(cè)系統(tǒng)，按廠商(Amersham)的建議觀察抗原-抗體復(fù)合物。對(duì)于內(nèi)源性標(biāo)記和免疫沉淀研究，用無(wú)半胱氨酸RPMI-1640(GIBCO)洗滌細(xì)胞3次并在補(bǔ)充了5％透析FCS和200Ci35S-半胱氨酸(Amersham，比活800Ci/mM)的相同培養(yǎng)基中在5％CO2中37℃以107/ml培養(yǎng)4小時(shí)。棄去上清，在冷PBS中洗滌細(xì)胞并在0.25％NP-40加1mM PMSF中裂解。在100μg/ml人rNGF存在或不存在的條件下按所述方法(Cozzolino等，1990)免疫沉淀上清和細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。洗滌免疫沉淀，在含有或不含2-巰基乙醇的SDS Laemmli緩沖液中洗脫，并在用Amplify(Amersham)處理的15％SDS-PAGE板上電泳，干燥并在-70℃對(duì)Hyper膜MP(Amersham)曝光。小鼠免疫和處理以40mg半抗原對(duì)1g蛋白質(zhì)的比率(Nisonoff，1967)經(jīng)過(guò)重氮化對(duì)-氨基苯胂酸并偶連到匙孔血藍(lán)蛋白(KLH，Calbiochem)上制備Ars-KLH。按照Reth等，1978將(4-羥基-5-碘-3-硝基-苯)乙酰(NIP，D.Schilovich，HSR，Milano博士惠贈(zèng))偶連到牛血清白蛋白(NIP-BSA)上。兩組20只6周齡的雌性Balb/c小鼠用0.1ml TT溶液[15μg/ml(Anatetal，Biocine-Sclavo，Siena，Italy)]在頸部s.c.注射或用Ars-KLH(0.1mg)經(jīng)i.p.注射，用0.1mg NIP-BSA經(jīng)i.p.免疫一組20只C57BL/6小鼠。引發(fā)40天后，用羊抗-NGF IgG(500g/小鼠)處理各組10只小鼠，其它用免疫前羊IgG(500g/小鼠)處理，48小時(shí)后用相同劑量的相關(guān)抗原加強(qiáng)注射所有小鼠。第二次免疫4天后，從眼眶后神經(jīng)叢抽血。用TT，NIP-BSA或Ars-KLH免疫的其它組的10只小鼠用于在加強(qiáng)注射前立即測(cè)定抗原特異性IgG。
為進(jìn)行脾細(xì)胞的FACS分析，用抗-NGF抗體或羊IgG在72小時(shí)內(nèi)(0.5mg/小鼠)兩次注射處理10只成年BALB/c小鼠組。再過(guò)72小時(shí)后，處死小鼠，獲得除去單核細(xì)胞的脾細(xì)胞。使用特異性抗體經(jīng)過(guò)細(xì)胞熒光光度術(shù)測(cè)定表面IgG+，IgA+，或IgM+脾細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。ELISA按Soderstrom等(1990)所述進(jìn)行NGF ELISA。為評(píng)價(jià)破傷風(fēng)類毒素(TT)-特異性IgG或IgM滴度，用501溶于0.1M硼酸鹽緩沖液，pH8.6中的TT(10g/ml)在4℃覆蓋平板過(guò)夜。為評(píng)價(jià)NIP或Ars-特異性IgG或IgM滴度，用NIP-KLH或Ars-BSA(35μg/ml溶于PBS中)覆蓋平板。經(jīng)過(guò)用NIP-BSA或Ars-KLH覆蓋平板還評(píng)價(jià)了針對(duì)免疫復(fù)合物的特異性IgG和IgM滴度。用含1％BSA的PBS飽和并用含0.05％(v/v)Tween20的PBS漂洗后，用系列稀釋的小鼠血清在37℃培養(yǎng)覆蓋的孔1小時(shí)；免疫前的小鼠血清合并液用作陰性對(duì)照。經(jīng)過(guò)加入堿性磷酸酶連接的羊抗-小鼠IgG或IgM檢測(cè)結(jié)合的Ig。經(jīng)過(guò)與NPP(Sigma)底物溶液溫育觀察最終反應(yīng)并記錄405nm處的吸光度。表1 抗-NGF抗體對(duì)促分裂原誘導(dǎo)的靜息B淋巴細(xì)胞增殖的影響3H-胸苷摻入(cpm)實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)2 實(shí)驗(yàn)3UF B細(xì)胞 251 240 306UF B細(xì)胞+NGF 305 312 403UF B細(xì)胞+SAC 13808 32010 17040UF B細(xì)胞+SAC+抗-NGF11488 25432 13050UF B細(xì)胞+SAC+羊IgG 13765 32456 17321UF B細(xì)胞+SAC+NGF 14056 34021 19028UF B細(xì)胞+IL-4+抗-μ 12896 15675 11366UF B細(xì)胞+IL-4+抗-μ+抗-NGF 12798 15254 10987UF B細(xì)胞+IL-4+抗-μ+羊IgG 12913 16070 11654UF B細(xì)胞+IL-4+抗-μ+NGF13004 16876 12114純化的sμ+δ+細(xì)胞384 426 368純化的sμ+δ+細(xì)胞+SAC+羊IgG 6863 7121 7256純化的sμ+δ+細(xì)胞+SAC+抗-NGF 6943 6889 7124純化的sγ+/α+細(xì)胞 279 344 368純化的sγ+/α+細(xì)胞+SAC+羊IgG 13935 14759 13157純化的sγ+/α+細(xì)胞+SAC+抗-NGF2468 3137 2324培養(yǎng)靜息未分級(jí)分離的(UF)B淋巴細(xì)胞或所示的純化群體48小時(shí)并用3H-胸苷在最后12小時(shí)脈沖標(biāo)記。數(shù)據(jù)表示為三份培養(yǎng)物的平均3H-胸苷摻入。SD常低于10％。以1∶10000的最終稀釋度使用SAC。以10g/ml濃度使用羊抗-NGF抗體或免疫前羊IgG。以100ng/ml濃度使用重組人NGF。以100U/ml濃度使用IL-4。以1g/ml的濃度使用多克隆兔抗-抗體。
表2 抗-NGF抗體對(duì)PWM-刺激的PBMNC產(chǎn)生Ig的影響
Ig(ng/ml)IgM IgG IgA僅含培養(yǎng)基 84 30 676PWM 1028 966 10716PWM+a-NGF674 374 1350PWM+羊IgG987 995 9234PWM+CD40μ1530 554 4794PWM+CD4μ 928 10249865在PWM(10g/ml)，羊抗-NGF抗體或免疫前羊抗IgG(10g/ml)，CD40或CD4上清(1∶10最終稀釋度)存在或不存在的條件下以3×106個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)人PBMNC 12小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，收集上清并使用特異性抗體經(jīng)過(guò)ELISA測(cè)量IgA，IgG，IgM。數(shù)據(jù)表示為三份孔的平均Ig濃度；SD＜15％。
實(shí)施例3體液免疫中與年齡相聯(lián)系的變化對(duì)抗體應(yīng)答的質(zhì)量影響多于對(duì)其數(shù)量的影響?？贵w應(yīng)答質(zhì)量隨年齡的改變包括抗體同種型從IgG轉(zhuǎn)換為IgM和抗體親和力由高變低。老年人對(duì)大多數(shù)疫苗的反應(yīng)受損以及老年人對(duì)感染具有更大的易感性支持了這一觀點(diǎn)，即免疫衰老導(dǎo)致免疫缺陷狀態(tài)。盡管這些變化大部分歸根于T細(xì)胞幫助關(guān)于外周同種型和親和力成熟的B細(xì)胞成熟的能力受損，本實(shí)施例表明老年動(dòng)物記憶B細(xì)胞存活能力受損是由于NGF生產(chǎn)受損。在記憶B細(xì)胞成熟期期間施用NGF恢復(fù)在用常用半抗原，NIP-BSA免疫的老年小鼠中特異性，高親和力的IgG生產(chǎn)。結(jié)果和討論在用NIP免疫的老年小鼠中特異性IgG生產(chǎn)被極大地抑制一組10只老年(＞5月齡)和一組10只幼年(≤8周齡)C57/BL6雌性小鼠用每只小鼠0.1mg(4-羥基-5-碘-3-硝基-苯)乙酰-牛血清白蛋白(NIP-BSA)(Reth等，1978)溶于0.1ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，重懸于0.1ml完全Freund’s佐劑經(jīng)i.p.免疫接種。21天后，經(jīng)眼眶后神經(jīng)叢吸血從每只動(dòng)物獲得0.4ml血液，經(jīng)過(guò)向血清樣品中加入BSA中和抗-BSA抗體。然后在ELISA中測(cè)定NIP-特異性IgG和IgM滴度。圖3顯示了對(duì)NIP的特異性IgG反應(yīng)在老年小鼠中比幼年小鼠明顯受影響，而抗半抗原的特異性IgM反應(yīng)在兩組小鼠中相似。這些結(jié)果表明NIP-特異性高親和力免疫球蛋白生產(chǎn)中的機(jī)制(體細(xì)胞高變，同種型轉(zhuǎn)換)在老年小鼠中存在缺陷。
已報(bào)道NGF是記憶B淋巴細(xì)胞的自分泌存活因子(Torcia等，1996)。為了研究老年小鼠有缺陷的免疫應(yīng)答是否負(fù)責(zé)缺乏NGF生產(chǎn)或NGF有效性誘導(dǎo)的記憶B細(xì)胞的大量死亡，我們經(jīng)過(guò)淘選技術(shù)從10只老年小鼠的脾臟分離了記憶B細(xì)胞(作為sIgD-淋巴細(xì)胞)且來(lái)自10只幼年小鼠的細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)16小時(shí)，收獲上清，經(jīng)過(guò)ELISA技術(shù)測(cè)定NGF。表3顯示了從老年小鼠分離的記憶B細(xì)胞不能產(chǎn)生NGF，而根據(jù)報(bào)道(Torcia等，1996)，從幼年小鼠分離的相同群體產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子。
表3 老年或幼年小鼠sIgD-脾細(xì)胞的NGF生產(chǎn)未刺激的NGF生產(chǎn)(pg/ml)老年小鼠＜9幼年小鼠535.3±43.1由于NGF生產(chǎn)受損，老年小鼠記憶B細(xì)胞的存活曲線與從幼年小鼠分離的相同群體相比一律更短。
權(quán)利要求
1.一種用于增強(qiáng)免疫缺陷動(dòng)物中疫苗效力的藥用組合物，包含A)能刺激動(dòng)物中抗對(duì)所述動(dòng)物為異源的致病因子的抗體生產(chǎn)的免疫應(yīng)答觸發(fā)疫苗；和B)疫苗增效量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，它在所述的動(dòng)物中增強(qiáng)對(duì)所述疫苗應(yīng)答的所述抗體生產(chǎn)；C)其中所述的動(dòng)物是免疫缺陷動(dòng)物，且其中所述的疫苗和所述的NGF可分別或一起施用。
2.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述的動(dòng)物是人類，且所述的疫苗選自流感疫苗，流感嗜血桿菌疫苗，甲肝病毒疫苗，乙肝病毒疫苗，丙肝病毒疫苗，結(jié)核疫苗，帶狀泡疹病毒疫苗，巨細(xì)胞病毒疫苗，肺炎球菌性肺炎疫苗，腦膜炎球菌性腦膜炎疫苗，白喉疫苗，破傷風(fēng)疫苗，狂犬病疫苗，幽門(mén)螺桿菌疫苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗和天花疫苗。
3.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述的疫苗量從大約1×10-9g到大約1×10-3g，且所述NGF的量為大約0.001-100mg/kg。
4.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述的疫苗量從大約1×10-8g到大約1×10-4g，且所述NGF的量為大約0.1-10mg/kg。
5.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述的NGF量為大約0.3-3mg/kg。
6.權(quán)利要求1的藥用組合物，包含包括所述疫苗和所述NGF的組合物。
7.權(quán)利要求6的藥用組合物，其中所述的組合物包括藥用上可接受的載體。
8.一種免疫接種方法，包括給免疫缺陷動(dòng)物施用增強(qiáng)疫苗效力的藥用組合物，所述藥用組合物包含A)能刺激動(dòng)物中抗對(duì)所述動(dòng)物為異源的致病因子的抗體生產(chǎn)的免疫應(yīng)答觸發(fā)疫苗；和B)疫苗增效量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，它在所述的動(dòng)物中增強(qiáng)對(duì)所述疫苗應(yīng)答的所述抗體生產(chǎn)；C)其中所述的動(dòng)物是免疫缺陷動(dòng)物，其中所述的疫苗和所述的NGF可分別或一起施用，且其中所述疫苗在所述動(dòng)物中的效力被所述NGF增強(qiáng)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的動(dòng)物是人類，且所述的疫苗選自流感疫苗，流感嗜血桿菌疫苗，甲肝病毒疫苗，乙肝病毒疫苗，丙肝病毒疫苗，結(jié)核疫苗，帶狀泡疹病毒疫苗，巨細(xì)胞病毒疫苗，肺炎球菌性肺炎疫苗，腦膜炎球菌性腦膜炎疫苗，白喉疫苗，破傷風(fēng)疫苗，狂犬病疫苗，幽門(mén)螺桿菌疫苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗和天花疫苗。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的疫苗量從大約1×10-9g到大約1×10-3g，且所述NGF的量為大約0.001-100mg/kg。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述的疫苗量從大約1×10-8g到大約1×10-4g，且所述NGF的量為大約0.1-10mg/kg。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述的NGF量為大約0.3-3mg/kg。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述的疫苗作為加強(qiáng)劑量的疫苗施用。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的NGF在所述的加強(qiáng)劑量疫苗前大約3-4天施用。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述的NGF也與施用所述疫苗基本上同時(shí)施用。
16.權(quán)利要求8的方法，其中所述的疫苗和所述的NGF經(jīng)注射用藥。
17.一種免疫接種方法，包括-給免疫缺陷動(dòng)物施用第一劑量的能刺激動(dòng)物中抗對(duì)所述動(dòng)物為異源的致病因子的抗體生產(chǎn)的免疫應(yīng)答觸發(fā)疫苗；-然后，在施用所述第一劑量后大約1周和2月之間的時(shí)間期間內(nèi)，給所述動(dòng)物施用1)一種疫苗增效量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，它在所述的動(dòng)物中增強(qiáng)對(duì)所述疫苗應(yīng)答的所述抗體生產(chǎn)或者2)加強(qiáng)劑量的所述疫苗與疫苗增效量的所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)以增強(qiáng)所述疫苗在所述動(dòng)物中的效力。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的時(shí)間期間是大約10-45天。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述的時(shí)間期間是大約10-30天。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述的時(shí)間期間是大約10-20天。
全文摘要
本發(fā)明的一種接種方法使用了藥用組合物以增強(qiáng)疫苗效力。該方法利用了能在免疫缺陷動(dòng)物中刺激抗對(duì)該動(dòng)物為異源的致病因子的抗體生產(chǎn)的免疫應(yīng)答觸發(fā)疫苗。作為佐劑,施用疫苗增效量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF),它可增強(qiáng)在該動(dòng)物對(duì)該疫苗應(yīng)答中的抗體生產(chǎn)和親和性。
文檔編號(hào)A61K39/205GK1260722SQ98806220
公開(kāi)日2000年7月19日 申請(qǐng)日期1998年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月1日
發(fā)明者瑪麗·托西亞 申請(qǐng)人:普羅泰克施恩無(wú)限公司