抗神經(jīng)生長因子抗體及其制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種制備適用于貓的抗體的方法。還提供了與貓神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合且中和貓NGF結(jié)合p75或TrkA貓NGF受體能力的嵌合抗體和貓源化抗體。本發(fā)明延及編碼所述抗體的核酸和使用所述抗體和/或核酸治療貓?zhí)弁春完P(guān)節(jié)炎的方法。
【專利說明】抗神經(jīng)生長因子抗體及其制備和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及充當(dāng)貓神經(jīng)生長因子的拮抗劑抗體及其片段。本發(fā)明還涉及制備這些抗體的方法以及這些抗體和片段在治療貓的與神經(jīng)生長因子相關(guān)的病癥中的治療用途，例如疼痛、疼痛相關(guān)病癥以及導(dǎo)致疼痛發(fā)作的病癥。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)生長因子(NGF)是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽鏈、β多肽鏈和Y多肽鏈構(gòu)成。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，其參與許多不同的作用。NGF促進感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的生存和分化，并且通過兩類膜結(jié)合受體即低親和性NGF受體ρ75和高親和性NGF受體跨膜酪氨酸激酶TrkA來傳達信號。NGF與TrkA或ρ75的結(jié)合導(dǎo)致感覺神經(jīng)元中神經(jīng)肽的上調(diào)。
[0003]已經(jīng)描述了使用NGF拮抗劑治療人類的疼痛和疼痛敏感(Cattaneo A.、Curr.0p.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，國際專利申請W02006/131951描述了人源化形式的大鼠aDll(aDll)單克隆抗體。a Dll抗體對小鼠NGF具有結(jié)合特異性，但已知也與人類和大鼠形式的NGF結(jié)合。在施用至人之前，需要對a Dll大鼠衍生單克隆抗體進行人源化，從而使產(chǎn)生的中和抗體最少，該中和抗體是由人類對嚙齒類衍生抗體的抗大鼠抗體(HAMA)反應(yīng)產(chǎn)生的。而且，用人恒定結(jié)構(gòu)域取代小鼠恒定結(jié)構(gòu)域允許選擇下游效應(yīng)子功能。
[0004]目前，通過施用數(shù)種鎮(zhèn)痛劑包括局部和全身麻醉劑、麻醉性鎮(zhèn)痛劑、α2拮抗劑、非類固醇抗炎藥(NSAIDs)和類固醇來進行貓的疼痛管理。這些藥物中的每一種都需要頻繁地施用并且在功效和安全性方面也有局限性。因此，對于患有慢性疼痛例如患有神經(jīng)病理性疼痛或腫瘤疼痛的貓，需要不頻繁施用且持久有效的疼痛緩解。
[0005]雖然NGF在貓組織中表達，但只有部分克隆是可用的序列。該部分mRNA序列在 GenBank 登錄 EF065101 (URL:http://www.ncb1.nlm.nih.gov.Felis catus nervegrowth factor beta-like mRNA,貓神經(jīng)生長因子-β類mRNA)中限定。但該文章既沒有描述貓NGF的拮抗劑，也沒有在貓中使用阻塞NGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)以防止或緩解疼痛。由于無法確定與另一物種中表達的神經(jīng)生長因子具有結(jié)合特異性的抗體是否也結(jié)合貓神經(jīng)生長因子，因此在貓中使用在其他物種中充當(dāng)抗NGF拮抗劑的已知抗體并不可行。而且，由于所施用的抗體將被貓免疫系統(tǒng)識別為外來的，因此也存在產(chǎn)生針對任何施用的抗體的中和抗體的可能性。另外，中和抗體的產(chǎn)生將限制該抗體的長期施用至貓，當(dāng)治療慢性疼痛相關(guān)病癥或癌性病癥時，這是特別重要的條件。此外，對貓施用來源于另一物種的抗NGF抗體可以顯示與存在于貓中但并不存在于該抗體原始來源的物種中的其他靶表位的交叉反應(yīng)。因此，迫切需要用于貓?zhí)弁粗委熤谐洚?dāng)貓NGF拮抗劑的結(jié)合成員(binding member),其中該結(jié)合成員保持高水平的結(jié)合親和性與親合力，同時避免了針對其的中和抗體的產(chǎn)生。
[0006]發(fā)明概述
[0007]經(jīng)過大量的努力，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了所制備的特異性結(jié)合貓NGF的非免疫原性嵌合抗體和貓源化抗體以及衍生自其的結(jié)合片段。特別是，出乎意料地，本文表明，本發(fā)明的抗體及其結(jié)合片段與貓NGF的結(jié)合，通過抑制貓NGF與高親和性TrkA受體或與p75受體的結(jié)合，隔絕了貓NGF的生物活性。這反過來阻止了感知神經(jīng)元中神經(jīng)肽的上調(diào)，結(jié)果減輕或消除了痛覺。使用重組DNA方法生產(chǎn)抗體，使得該抗體基本上是非免疫原性的，也就是說，在施用至貓個體之后，針對該抗體的中和抗體并未產(chǎn)生。由于使用標(biāo)準(zhǔn)方法例如CDR移植等并未產(chǎn)生抗體，因此這樣的發(fā)現(xiàn)是令人驚訝且完全出乎意料的。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了制備適合用于貓中的抗體的方法，其包括或基本上由以下步驟組成:
[0009]從貓之外的物種提供供體抗體，其中所述供體抗體對貓中存在的靶抗原有結(jié)合特異性；
[0010]將所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列的每一氨基酸殘基與一個或多個貓抗體的框架區(qū)的氨基酸序列中對應(yīng)位置的每一氨基酸殘基比較，以鑒別出所述供體受體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)與所述一個或多個貓抗體的框架區(qū)的氨基酸序列的對應(yīng)位置的一個或多個氨基酸殘基不同的一個或多個氨基酸殘基；以及
[0011]用存在于一個或多個貓抗體中對應(yīng)位置的一個或多個氨基酸殘基來取代所述供體抗體中一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
[0012]本發(fā)明的方法修飾了貓中使用的供體抗體，這樣的方法使得修飾的抗體的框架區(qū)內(nèi)的任何位置不含有在貓中的該位置將是外來的任何氨基酸。因此，修飾的抗體保持了供體抗體對靶抗原的特異性和親和性，但重要的是修飾并沒有產(chǎn)生潛在的外來表位。因此，在貓中，修飾的抗體不被看做外來的，并且尤其是在長期施用后，也沒有在貓中引起可能導(dǎo)致抗體功效的中和的免疫反應(yīng)。
[0013] 在某些實施方案中，取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基的步驟包括，用存在于對應(yīng)位置的與所述一個或多個取代的氨基酸殘基具有最高同源性的一個或多個氨基酸殘基來取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
[0014]在某些實施方案中，該方法還包括用來自貓抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域取代所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的步驟。通常，該重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域被HC2型貓恒定結(jié)構(gòu)域取代。
[0015]在某些實施方案中，靶表位是神經(jīng)生長因子(NGF)。
[0016]本發(fā)明第一方面的方法并不包括CDR移植。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備的抗體包含供體抗體的CDR、根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法制備的貓源化框架區(qū)，以及貓的恒定結(jié)構(gòu)域。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)的嵌合抗體或其結(jié)合片段，所述嵌合抗體包含來源于與貓之外的物種中的神經(jīng)生長因子結(jié)合的抗體的輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和從貓衍生抗體中獲得的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域。通常，當(dāng)嵌合抗體或衍生自其的結(jié)合片段在結(jié)合表位結(jié)合貓NGF時，會中和NGF生物功能。也就是說，嵌合抗體或結(jié)合片段與貓NGF的結(jié)合隔絕了 NGF與TrkA受體或與p75受體結(jié)合的能力。在某些實施方案中，嵌合抗體或其結(jié)合片段與NGF結(jié)合的結(jié)合親和力KD為1χ10_8或更小。
[0018]在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了抗貓NGF嵌合抗體或其結(jié)合片段，其能夠與貓NGF結(jié)合并中和貓NGF與p75或TrkA貓NGF受體結(jié)合的能力，該嵌合抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一'I"生的序列。SEQ ID NO:2的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域衍生自來源于貓(Felis catus)的抗體并且以GenBank登錄號BAA32229.1保藏。在另一實施方案中，所述重鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16，其是與衍生自來源于貓且以GenBank登錄號BAA32230.1保藏的抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合的恒定結(jié)構(gòu)域。
[0019]通常，本發(fā)明的抗貓NGF嵌合抗體的恒定結(jié)構(gòu)域并不介導(dǎo)與抗體恒定區(qū)相關(guān)的下游效應(yīng)子功能，例如補體結(jié)合、ADCC、Fe受體結(jié)合等。在某些實施方案中，可以將重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的殘基取代為不能被糖基化的殘基。在某些實施方案中，非糖基化重鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 19或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列。
[0020]本發(fā)明延及根據(jù)本發(fā)明第一方面制備的抗體。因此，在某些另外的方面，本發(fā)明延及貓源化抗貓NGF中和抗體。該貓源化抗體保留了抗體在本發(fā)明人預(yù)測在貓NGF和其他物種的NGF之間是保守的結(jié)合表位結(jié)合非貓NGF的結(jié)合特異性，同時通過以下方式降低了所述抗體的免疫原性:提供貓衍生恒定結(jié)構(gòu)域，并顯著地修飾可變區(qū)框架區(qū)(FR)所選的殘基，從而CDR區(qū)的結(jié)合特異性未被改變，但是插入CDR區(qū)之間的框架區(qū)中可能存在的T細(xì)胞表位通過用貓衍生氨基酸取代供體抗體框架區(qū)中的特定殘基來去除。重要的是，框架殘基并不會全部被來源于貓源抗體的框架區(qū)取代。相反，框架殘基的取代是經(jīng)過考慮的并且是特定的。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一或相關(guān)方面，提供了貓源化抗體或其結(jié)合片段，其能夠特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)。通常，當(dāng)結(jié)合時，貓源化抗體或其結(jié)合片段中和貓NGF生物功能。也就是說，貓源化抗體或其結(jié)合片段與貓NGF的結(jié)合隔絕了貓NGF與p75或TrkA貓NGF受體結(jié)合的能力。在某 些實施方案中，貓源化抗體或其結(jié)合片段與NGF結(jié)合的結(jié)合親和力KD為1χ10_8或更小。通常，貓源化抗體在貓中不是免疫原性的。
[0022]在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的制備抗體的方法制備貓源化抗體。
[0023]在本發(fā)明的另一或相關(guān)方面，提供了中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID N0:23或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在某些是方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選為約25個氨基酸的長度上。
[0024]在一些實施方案中，中和抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，抗體是嵌合抗體。在一些實施方案中，抗體是貓源化抗體，即具有已經(jīng)去免疫的氨基酸序列的抗體，從而，當(dāng)施用至貓后，并不產(chǎn)生針對所述抗體的中和抗體。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的制備抗體的方法來制備貓源化抗體。通常通過氨基酸取代或缺失的方式來選擇或修飾抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，從而使得恒定結(jié)構(gòu)域并不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。
[0025]在一些實施方案中，貓源化抗體或抗體結(jié)合片段包含或組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID N0:25或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選為約25個氨基酸的長度上。
[0026]在本發(fā)明的另一或相關(guān)方面，提供了中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠與貓神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合，該貓源化抗體或抗體結(jié)合片段包含或組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0027]通常，重鏈(VH)的可變區(qū)與包含至少一個免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合。通常，重鏈恒定結(jié)構(gòu)域由3個串聯(lián)的恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中在2個恒定結(jié)構(gòu)域之間提供鉸鏈區(qū)以提供結(jié)構(gòu)靈活性。不同同種型的恒定結(jié)構(gòu)域可以包含多于或少于3個的恒定結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，重鏈恒定結(jié)構(gòu)域來源于貓衍生抗體。已知兩種不同的貓恒定結(jié)構(gòu)域(以GenBank登錄號BAA32229.1和BAA32230.1表示)，在它們的CH3結(jié)構(gòu)域之間具有相同的鉸鏈區(qū)和八個氨基酸序列差異。通常，所述恒定結(jié)構(gòu)域包含CH1、CH3和CH3以及位于所述CHl和CH2結(jié)構(gòu)域之間的合適的連接體(或“鉸鏈”)。通常，本發(fā)明的抗貓NGF抗體包含與恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域并不產(chǎn)生抗體Fe區(qū)介導(dǎo)的下游效應(yīng)子功能，例如補體結(jié)合、ADCC或Fe受體結(jié)合等。
[0028]在某些實施方案中，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列的重鏈。
[0029]在具體實施方案中，所述貓源化抗體或其衍生的結(jié)合片段可以包含重鏈，其中恒定結(jié)構(gòu)域中的至少一個殘基已經(jīng)被取代或缺失以防止該殘基糖基化。在某些實施方案中，重鏈亞型來源于亞型IgG2的貓抗體。在某些另外的實施方案中，所述恒定結(jié)構(gòu)域衍生自來源于貓并且以GenBank登錄號BAA32230.1保藏的抗體。
[0030]在另一或相關(guān)方面，本發(fā)明延及貓源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)并中和其結(jié)合TrkA NGF受體和p75NGF受體的生物功能，所述貓源化抗體或其抗體結(jié)合片段包含輕鏈和重鏈，其中所述輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域包含、組成為或基本組成為與氨基酸序列SEQ ID N0:23相同或基本同源的氨基酸序列或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序`列；并且其中所述重鏈(VH)的可變結(jié)構(gòu)域包含、組成為或基本組成為與氨基酸序列SEQ ID N0:22相同或基本同源的氨基酸序列或與其具有至少85、90、95或98%氨基酸同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0031]在某些實施方案中，所述貓源化抗體或結(jié)合成員包含輕鏈，其包含、組成為或基本組成為氨基酸序列SEQ ID NO: 25或與其具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選98%氨基酸同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0032]在某些實施方案中，所述貓源化抗體或結(jié)合成員包含重鏈，其包含、組成為或基本組成為氨基酸序列SEQ ID NO: 24或與其具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選98%同一性的氨基酸序列的多肽。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度。
[0033]在某些實施方案中，抗體可以與至少一個受體分子綴合。在某些另外的實施方案中，至少一個恒定結(jié)構(gòu)域中的至少一個殘基可以被取代或缺失以防止該殘基糖基化。
[0034]在本發(fā)明的另一或相關(guān)方面，提供了中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠與貓神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合，該貓源化抗體或抗體結(jié)合片段包含或組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID N0:3或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸序列同一性的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0035]在一些實施方案中，中和抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，抗體是嵌合抗體。在一些實施方案中，抗體是貓源化抗體，即具有已經(jīng)去免疫的氨基酸序列的抗體，從而，當(dāng)施用至貓個體后，并不產(chǎn)生針對所述抗體的中和抗體。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的第一方面制備貓源化抗體。通常通過氨基酸取代或缺失的方式來選擇或修飾抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，從而使得恒定結(jié)構(gòu)域并不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。
[0036]在某些實施方案中，貓源化抗體或抗體結(jié)合片段包含或組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選為約25個氨基酸的長度上。
[0037]在本發(fā)明的另一或相關(guān)方面，提供了中和貓源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠與貓神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合，該貓源化抗體或抗體結(jié)合片段包含或組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0038]通常，重鏈(VH)的可變區(qū)與包含至少一個免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在某些實施方案中，重鏈恒定結(jié)構(gòu)域是來源于貓衍生抗體，例如表示為GenBank登錄號BAA32229.1和BAA32230.1的那些。通常，所述恒定結(jié)構(gòu)域包含CHl、CH3和CH3以及位于所述CHl和CH2結(jié)構(gòu)域之間的合適的連接體(或“鉸鏈”)。通常，本發(fā)明的抗貓NGF抗體包含與恒定結(jié)構(gòu)域結(jié) 合的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域并不產(chǎn)生抗體Fe區(qū)介導(dǎo)的下游效應(yīng)子功能，例如補體結(jié)合、ADCC或Fe受體結(jié)合等。
[0039]在某些實施方案中，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含或組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID N0:6或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列的重鏈。在某些實施方案中，所述恒定結(jié)構(gòu)域是衍生自來源于貓并且以GenBank登錄號BAA32229.1保藏的抗體的恒定結(jié)構(gòu)域。
[0040]在具體的實施方案中，所述貓源化抗體或衍生自其的結(jié)合片段可以包含重鏈，其中恒定結(jié)構(gòu)域中的至少一個殘基已經(jīng)被取代或缺失以防止該殘基糖基化。因此，在某些另外的實施方案中，抗體或抗體結(jié)合片段包含或組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQID NO: 7或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列的重鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。在某些實施方案中，重鏈亞型來源于亞型IgG2的貓抗體。
[0041]在某些另外的實施方案中，所述恒定結(jié)構(gòu)域衍生自來源于貓并且以GenBank登錄號BAA32230.1保藏的抗體。因此，在某些另外的實施方案中，本發(fā)明的另一貓源化抗體的重鏈包含衍生自抗體的重鏈，所述抗體來源于貓并且以GenBank登錄號BAA32230.1保藏。所述抗體包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17。在某些另外的實施方案中，可以修飾氨基酸序列SEQ ID NO: 17以取代可能經(jīng)受糖基化的任何氨基酸殘基。因此，本發(fā)明的另一實施方案提供了貓源化抗體，其具有包含氨基酸序列SEQ ID勵:18或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的重鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0042]在另一或相關(guān)方面，本發(fā)明延及貓源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)并中和其結(jié)合TrkA NGF受體和p75NGF受體的生物功能，所述貓源化抗體或其抗體結(jié)合片段包含輕鏈和重鏈，其中所述輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域包含、組成為或基本組成為與氨基酸序列SEQ ID N0:3相同或基本同源的氨基酸序列或與其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列；并且其中所述重鏈(VH)的可變結(jié)構(gòu)域包含、組成為或基本組成為與氨基酸序列SEQ ID N0:4相同或基本同源的氨基酸序列或與其具有至少85、90、95或98%氨基酸同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0043]在某些實施方案中，所述貓源化抗體或結(jié)合成員包含輕鏈，其包含、組成為或基本組成為氨基酸序列SEQ ID NO: 5或與其具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選98%氨基酸同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0044]在某些實施方案中，所述貓源化抗體或結(jié)合成員包含重鏈，其包含、組成為或基本組成為氨基酸序列SEQ ID N0:6或SEQ ID NO: 17或與其具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選98%同一性的氨基酸序列的多肽。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0045]在某些實施方案中，抗體可以與至少一個受體分子綴合。
[0046]在某些另外的實施方案中，可以取代或缺失至少一個恒定結(jié)構(gòu)域中的至少一個殘基，以防止該殘基的糖基化。因此，在某些另外的實施方案中，貓源化抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:重鏈，其中該重鏈包含選自SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:18的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少95%、更優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0047]本發(fā)明人進一步限定了一系列可以與互補性決定區(qū)(⑶Rs)結(jié)合以形成貓源化重鏈可變結(jié)構(gòu)域和貓源化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)(FR)。每一個重鏈結(jié)構(gòu)域和輕鏈結(jié)構(gòu)域都具有4個框架區(qū)，稱為FR1、FR2、FR3和FR4。
[0048]抗體分子可以包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)以及相關(guān)的插入框架區(qū)。重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)⑶R稱為HCDRs，根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在下列位置可以找到這些 CDR:HCDRl - Kabat 殘基 31-35、HCDR2 - Kabat 殘基 50-65、HCDR3 - Kabat 殘基95-102(Kabat EA et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest (具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)序列)，5thedition.Bethesda:US Department of Health andHuman Services,)。
[0049]而且，抗體進一步包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)以及相關(guān)的插入框架區(qū)。輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)⑶R稱為IXDR，根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在下列位置可以找到這些 CDRs: LCDRl - Kabat 殘基 24-34、LCDR2 - Kabat 殘基 50-56、LCDR3 - Kabat 殘基 89-97。
[0050]輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含四個框架區(qū)，？町、？1?2、？1?3和？1?4，以FR1-CDR1-FR2-CD R2-FR3-CDR3-FR4 排列插入 CDR。
[0051 ] 在另一方面，本發(fā)明延及抗NGF抗體或其NGF抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含以下中的至少一個:
[0052]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26組成的FRl框架區(qū)；
[0053]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:27組成的FR2框架區(qū)；
[0054]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:28組成的FR3框架區(qū)；
[0055]包含或 由氨基酸序列SEQ ID NO: 29組成的FR4框架區(qū)；
[0056]所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含以下中的至少一個:
[0057]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:30組成的FRl框架區(qū)；
[0058]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:31組成的FR2框架區(qū)；
[0059]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:32組成的FR3框架區(qū)；
[0060]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成的FR4框架區(qū)。
[0061 ] 通常，輕鏈⑶R和重鏈⑶R衍生自對NGF具有結(jié)合特異性的抗體，優(yōu)選為貓NGF。
[0062]在某些實施方案中，包含以上描述的所述至少一個框架區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與貓來源的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，貓衍生輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域通常為輕鏈K恒定結(jié)構(gòu)域，但任選地為輕鏈λ恒定結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述輕鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:26的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 27的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:28的FR3區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的FR4區(qū)，或與前述氨基酸序列具有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。
[0063]在某些另外的實施方案中，包含以上描述的至少一個框架區(qū)的重鏈可變區(qū)與至少一個貓來源的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在某些實施方案中，恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列沒有任何翻譯后修飾，或者可以被修飾以除去可能經(jīng)歷N-連接或O-連接糖基化的任何殘基或全部殘基，這樣使得恒定結(jié)構(gòu)域未被糖基化。在某些實施方案中，重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 30的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 31的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ IDNO:32的FR3區(qū)和具有氨基酸序列SEQ ID NO:33的FR4區(qū)，或具有與前述氨基酸序列有至少85、90、95或98%序列同一'丨生的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一'I"生是在至少約5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。
[0064]在某些另外的實施方案中，可以對本文描述的框架區(qū)進行修飾。也就是說，
【發(fā)明者】確認(rèn)，對于每一框架區(qū)中的一些殘基來說，可以為指定位置選擇氨基酸。重要的是，這些框架區(qū)修飾不會導(dǎo)致相關(guān)互補性決定區(qū)的構(gòu)象改變，這是由于這可以改變所得抗體的結(jié)合特異性和/或親和性。在某些實施方案中，本發(fā)明延及將2個或以上氨基酸取代引入到輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸殘基。
[0065]因此，在某些另外的實施方案中，本發(fā)明延及多肽，例如包含具有FRl區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述FRl區(qū)包含被以下氨基酸取代(其中氨基酸用其單字母代碼表示)中的一個或多個修飾的氨基酸序列SEQ ID NO: 26,即Dl是E或N，12是￥、？或1^3是￥或11?4是1^或1，57是1'，310是卩，312是？或六，Τ14是I或Α，Ε17是D, S18 是 P 或 A，V19 是 Α，121 是 F 以及 S22 是 F。
[0066]在某些另外的實施方案中，其中具有氨基酸序列SEQ ID NO:27的輕鏈FR2區(qū)可以被一個或多個以下氨基酸取代來修飾:Y2是F，L3是F或R，Κ5是R，R8是Q，L12是R，114是M以及Y15是H或A。
[0067]在某些實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的輕鏈FR3區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:G1是R，F(xiàn)6是I，S7是T，T13是A或S，T16是I或A，K18是 R 或 T，S20 是 A、G 或 T，R21 是 G，V22 是 M，Q23 是 E，T24 是 A、V 或 P，E25 是 D，V29 是 1、H或L以及F31是Y。
[0068]在某些實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 29的輕鏈FR4區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾=Fl是S，Q3是P，K6是H、Q、E、S或T，E8是D，L9是V、I或M以及KlO是R、D或T。
[0069]在某些實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的重鏈FRl區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:Q1是D或E，V2是E，Q3是L或R，L4是V，V5是M，E6是Q 或 D，A9 是 G，ElO 是 D 或 N，Lll 是 V 或 R，V12 是 R 或 K，Q13 是 K、T、E、N 或 R，P14 是 T，G15 是 E，E16 是 G、A 或 T，S17 是 A，L18 是 V，R19 是 K 或 E，L20 是 I 或 P，T21 是 F 或 S，A23是K、V或Q，A24是T或D以及G26是A。
[0070]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID N0:31的重鏈FR2區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:V2是L、F或I，R3是C或H，A5是S、V或T，G7是A、E或S，K8是Q或E，LlO是F或P，Ell是Q，W12是C或L，M13是V或I以及G14是A或
S0[0071]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 32的重鏈FR3區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:R1是Q或K，L2是F，T3是I，14是L，M或V，T5是 S，R6 是 A、T、K、G 或 V，T8 是 N、D、A 或 S，S9 是 A、D 或 T，KlO 是 T、E、Q、N 或 R，Nll 是 D或 K，T12 是 I 或 A，V13 是 A、L 或 G，F(xiàn)14 是 Y、V、A、S 或 W，L15 是 M，Q16 是 E、D、H 或 V，M17是 L，H18 是 N、S、T、D、G 或 R，S19 是 N，Q21 是 R、K 或 T，S22 是 T、1、A 或 V，E23 是 A、T、D、G 或 S，A26 是 G 或 S，T27 是 V、M、I 或 A，Y28 是 H，Y29 是 H 或 F 以及 A31 是 T、V、G、L、I 或M0
[0072]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 33的重鏈FR4區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾=Wl是R，C或L，G2是A，Q3是H、R、P或V，G4是D，T5 是 A 或 V，T6 是 L、1、Q、M 或 S，V7 是 I，T8 是 A、I 或 R，V9 是 G，SlO 是 P 以及 All 是S或Q。
[0073]在某些實施方案中，抗體是單克隆抗體。通常，所述抗體是貓源化抗體。
[0074]在另一方面，本發(fā)明延及抗NGF抗體或其NGF抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含以下中的至少一個:
[0075]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:8組成的FRl框架區(qū)；
[0076]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:9組成的FR2框架區(qū)；
[0077]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 10組成的FR3框架區(qū)；
[0078]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 11組成的FR4框架區(qū)；
[0079]所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含以下中的至少一個:
[0080]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 12組成的FRl框架區(qū)；
[0081]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 13組成的FR2框架區(qū)；[0082]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 14組成的FR3框架區(qū)；
[0083]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 15組成的FR4框架區(qū)。
[0084]通常，輕鏈⑶R和重鏈⑶R衍生自對NGF具有結(jié)合特異性的抗體，優(yōu)選為貓NGF。
[0085]通常，本發(fā)明的貓源化抗貓NGF抗體的產(chǎn)生不需要待引入輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)內(nèi)的回復(fù)突變。
[0086]在某些實施方案中，包含以上描述的所述至少一個框架區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與貓來源的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，貓衍生輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域通常為輕鏈K恒定結(jié)構(gòu)域，但任選地為輕鏈λ恒定結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述輕鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:8的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的FR3區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的FR4區(qū)，或與前述氨基酸序列具有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。 [0087]在某些另外的實施方案中，包含以上描述的至少一個框架區(qū)的重鏈可變區(qū)與至少一個貓來源的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在某些實施方案中，恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列沒有任何翻譯后修飾，或者可以被修飾以除去可能經(jīng)歷N-連接或O-連接糖基化的任何殘基或全部殘基，這樣使得恒定結(jié)構(gòu)域未被糖基化。在某些實施方案中，重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ IDNO: 14的FR3區(qū)和具有氨基酸序列SEQ ID NO: 15的FR4區(qū)，或具有與前述氨基酸序列有至少85、90、95或98%序列同一'丨生的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一'I"生是在至少約5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。
[0088]在某些另外的實施方案中，可以對本文描述的框架區(qū)進行修飾。也就是說，
【發(fā)明者】確認(rèn)，對于每一框架區(qū)中的一些殘基來說，可以為指定位置選擇氨基酸。重要的是，這些框架區(qū)修飾不會導(dǎo)致相關(guān)的互補性決定區(qū)的構(gòu)象改變，這是由于這可以改變所得抗體的結(jié)合特異性和/或親和性。在某些實施方案中，本發(fā)明延及將2個或以上氨基酸取代引入到輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸殘基。
[0089]因此，在某些另外的實施方案中，本發(fā)明延及多肽，例如包含具有FRl區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述FRl區(qū)包含通過被氨基酸殘基A取代位置21的氨基酸殘基I進行修飾的氨基酸序列SEQ ID Ν0:8。
[0090]在某些實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的輕鏈FR3區(qū)可以通過被氨基酸殘基Y取代位置31的氨基酸殘基F進行修飾。
[0091]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的重鏈FRl區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代(其中氨基酸用它們的單字母代碼表示)進行修飾:G9可以是A, DlO可以是E，G15可以是E，G16可以是A，R19可以是K，A23可以是V或M。此外，Ql可以是D或H，V2可以是E，Q3可以是L，E6可以是Q，G9可以是R，Lll可以是V，V12可以是R或S，Q13可以是K，L18可以是V，R19可以是S，L20可以是I，T21可以是F或S，A23可以是K，A24可以是T，F(xiàn)27可以是Y或L，S28可以是T或N，L29可以是F或V以及T30可以是S，G或R。
[0092]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的重鏈FR2區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:V2是L，W，F(xiàn)或A，R3是C，A5是P或T，G7是E或A，K8是Q或T，LlO是F，Ell是Q，W12是E或Τ，Μ13是V或L以及G14是A，T或S。
[0093]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的重鏈FR3區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:F2是L，S5是T，N8是T，A9是S，Nll是D，L13是A，K21是R以及T22是S。此外，T3是A，14是L或V，R6是A或I，N8是S，A9是G或T，KlO 是 T，R，G 或 Q，T12 是 A，Y14 是 D 或 S，L15 是 M，Q16 是 E，L 或 R，M17 是 L 或 T，N18 是
S、D 或 T，S19 是 1、N、R 或 T，K21 是 G 或 T，T22 是 P 或 A，E23 是 T、A 或 D，T25 是 A，T27 是V 或 M，Y29 是 C 或 F，C30 是 R，A31 是 G、1、T、S 或 V 以及 R32 是 K、S、T、1、V、P、N 或 G。
[0094]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 15的重鏈FR4區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:L6是I。此外，Wl可以是R，G2可以是R，Q3可以是P、V、H或R，T5可以是A、V、I或S，L6可以是Q，S10可以是T以及Sll可以是Q、A或P。
[0095]在本發(fā)明以上方面的某些實施方案中，抗體是單克隆抗體。通常，所述抗體是貓源化抗體。
[0096]在本發(fā)明以上方面的某些另外的實施方案中，貓源化NGF中和抗體或由其衍生的結(jié)合片段與貓NGF (神經(jīng)生長因子)特異性結(jié)合且其結(jié)合親和性的平衡解離常數(shù)(KD)為IxlO-8或更小。而且，優(yōu)選該貓源化抗體不與貓內(nèi)存在的任何其他表位(除了 NGF)交叉反應(yīng)，并且進一步，當(dāng)將本發(fā)明的抗體施用于貓時，不產(chǎn)生針對本發(fā)明的抗體的中和抗體。此外，優(yōu)選抗體的恒定結(jié)構(gòu)域不介導(dǎo)任何下游的效應(yīng)子功能，包括但不限于補體結(jié)合和激活、ADCC以及Fe受體結(jié)合和激活。
[0097]在某些另外的實施方案中，可以對本發(fā)明的抗體進行重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列修飾。所述修飾可以包括一個或多個氨基酸殘基的添加、取代或缺失。通常為了改變抗體的功能 特性而進行這些氨基酸改變。例如，可以進行氨基酸修飾以阻止被抗體恒定結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的下游效應(yīng)子功能，例如通過阻止抗體結(jié)合Fe受體、激活補體或誘導(dǎo)ADC的能力。此外，為了改變當(dāng)施用于貓時抗體的循環(huán)半衰期，可以對重鏈恒定結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)(hingeregion)進行修飾。
[0098]在某些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段并不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。通常，該抗體或結(jié)合片段具有貓重鏈亞型HC2。
[0099]在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一方面制備抗體的方法來制備貓源化抗體。
[0100]本發(fā)明延及結(jié)合貓NGF并且隔絕其結(jié)合p75或TrkA受體的能力的抗體片段。
[0101]在某些實施方案中，抗體結(jié)合片段可以包括被柔性連接體連接以形成單鏈抗體的本發(fā)明的重鏈和輕鏈序列。
[0102]單鏈Fv(scFv)包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域。VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成革巴結(jié)合位點。這兩個結(jié)構(gòu)域通過肽連接體共價連接。scFv分子在N末端需要輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的情況下可以具有VL-連接體-VH的形式，或在N末端需要VH結(jié)構(gòu)域的情況下為VH-連接體-VL。因此，在某些另外的實施方案中，抗原結(jié)合片段是單鏈Fv(ScFv)抗體片段。在某些另外的實施方案中，抗體結(jié)合片段選自Fab抗體片段、Fab’抗體片段、F(ab’)2抗體片段、Fv抗體片段、scFV抗體片段等，但并不限于此。
[0103]在某些另外的實施方案中，本發(fā)明提供了用于聯(lián)合療法的多特異性或多價抗體，其包含以不同的結(jié)合特異性與其他抗體偶聯(lián)或結(jié)合的本發(fā)明的抗貓NGF抗體或由其衍生的結(jié)合片段。多特異性抗體包含特異性結(jié)合第一貓NGF表位的至少一個貓源化抗體或嵌合抗體或由其衍生的結(jié)合片段，和對NGF上存在的另一表位或?qū)Σ煌目乖刑禺愋缘闹辽僖粋€結(jié)合位點。多價抗體包含對同一貓NGF表位有結(jié)合特異性的抗體或抗體結(jié)合片段。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明延及包含本發(fā)明的貓源化抗體或嵌合抗體的四個或更多Fv區(qū)或Fab區(qū)的抗體融合蛋白。另外的實施方案還延及抗體融合蛋白，其包含衍生自本發(fā)明的抗體的一個或多個Fab區(qū)與來自對貓NGF有特異性的抗體的一個或多個Fab區(qū)或Fv區(qū)。在某些另外的實施方案中，本發(fā)明延及雙特異性抗體，其中本發(fā)明的抗體或其結(jié)合片段與對第二靶標(biāo)有結(jié)合特異性的第二抗體或其片段連接，所述第二靶標(biāo)不是貓NGF。優(yōu)選地，所述第二靶標(biāo)通過P75或TrkA受體有助于阻止NGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法或重組方法來制得這樣的多價抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
[0104]本發(fā)明的另一方面提供了貓源化抗神經(jīng)營養(yǎng)因子中和抗體，其包含:
[0105](I)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 23或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列；所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:22或與所述氨基酸序列具有至少85%同一'丨生的序列；或 [0106](2)具有輕鏈和/或重鏈的嵌合抗體，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID N0:1，所述重鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。
[0107]在某些實施方案中，貓源化抗體具有輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:25 ;所述重鏈具有氨基酸序列 SEQ ID N0:6 或 SEQ ID N0:24。在某些實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)因子是貓神經(jīng)生長因子(NGF)。
[0108]本發(fā)明的又一方面提供了治療、抑制或減輕貓的疼痛的方法，該方法包括以下步驟:
[0109]提供治療有效量的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是本發(fā)明的貓源化抗體或嵌合抗體或其結(jié)合片段；以及
[0110]將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
[0111]在某些實施方案中，該貓源化抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:23或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或SEQ IDNO: 22或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。在某些另外的實施方案中，該貓源化抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5或SEQ IDNO:25或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:氨基酸序列SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:24或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選至少98%氨基酸同一性的序列。
[0112]在某些實施方案中，所述貓源化抗體或其抗原結(jié)合片段是本發(fā)明的前述方面提供的任何貓源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0113]在某些實施方案中，所述嵌合抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述重鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 2。
[0114]在某些實施方案中，疼痛是指神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)。特別是,疼痛可以是手術(shù)后或外科手術(shù)后疼痛。手術(shù)后疼痛(post-operative pain)可能在貓的以下任何手術(shù)程序后發(fā)生，其包括但不限于矯形外科手術(shù)、軟組織外科手術(shù)、卵巢子宮切除術(shù)、閹割手術(shù)等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛(腫瘤疼痛)。在某些另外的實施方案中，疼痛與關(guān)節(jié)炎相關(guān)或由它們導(dǎo)致，包括免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、炎癥、瘙癢、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎。
[0115]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療貓個體的關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括以下步驟:
[0116]提供治療有效量的本發(fā)明的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段；以及
[0117]將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
[0118]在一實施方案中，所述抗貓NGF抗體是嵌合抗體，其中輕鏈具有氨基酸序列SEQ IDNO: 1，和/或重鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。
[0119]在某些實施方案中，該抗體是貓源化抗體。在某些實施方案中，該貓源化抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID NO: 23或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 22或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0120]在某些實施方案中，關(guān)節(jié)炎包括選自免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和相關(guān)病癥。
[0121]通常，關(guān)節(jié)炎的治療包括減輕、抑制、降低、壓制或延遲與關(guān)節(jié)炎病癥相關(guān)的或由其引起的疼痛的發(fā)作。
[0122]本發(fā)明的又一方面提供了治療貓個體中由貓NGF表達增加或?qū)GF敏感性增加弓丨起的或與其相關(guān)的或由其導(dǎo)致`的病癥的方法，所述方法包括以下步驟:
[0123]提供治療有效量的本發(fā)明的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段；以及
[0124]將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
[0125]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了治療貓中被NGF誘發(fā)增殖的腫瘤和與其相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括以下步驟:
[0126]提供治療有效量的本發(fā)明的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段；以及
[0127]將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
[0128]在某些實施方案中，腫瘤是骨肉瘤。在某些實施方案中，自分泌或旁分泌NGF誘導(dǎo)腫瘤增殖。
[0129]在某些實施方案中，本發(fā)明的前述方法進一步包括共施用至少一種另外的藥劑的步驟，該藥劑可以提高和/或補足本發(fā)明的抗NGF抗體的治療效果。例如，該抗體或其抗原結(jié)合片段可以與至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇共施用。
[0130]合適的鎮(zhèn)痛劑的實例包括但不限于布托啡喏、丁丙諾啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替唳、嗎啡、納布啡及其衍生物。合適的NSAIDS包括但不限于對乙酰氨基酚、乙酰水楊酸、卡洛芬、依托度酸、酪洛芬、美洛昔康、非羅考昔、羅貝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
[0131]在某些另外的實施方案中，所述至少一種另外的藥劑可以是活性治療劑，其可以是選自抗生素、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗病毒劑或類似藥劑中的一組或多組。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是炎癥介質(zhì)(mediator)的抑制劑,例如PGE受體拮抗劑,免疫抑制劑例如環(huán)孢霉素，或抗炎糖皮質(zhì)激素。在某些另外的方面，所述至少一種另外的藥劑可以是用于治療認(rèn)知功能障礙或損傷的藥劑，例如老齡貓中日益普遍的失憶或相關(guān)病癥。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是用于治療心血管疾病的抗高血壓藥劑或者其他化合物，例如以治療高血壓、心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外，所述至少一種另外的藥劑可以選自利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑或HMG-CoA還原酶抑制劑。
[0132]在某些實施方案中，作為前述方法的一部分，將本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段以從約0.01mg/kg體重至約3mg/kg體重,特別是從約0.03mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量施用至有需要的貓。
[0133]在各種其它方面，本發(fā)明延及包含本發(fā)明任何前述方面的抗體或其結(jié)合片段的組合物。在某些實施方案中，所述組合物進一步包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
[0134]本發(fā)明的另一方面提供了用于治療導(dǎo)致貓的慢性疼痛或由貓的慢性疼痛引起的疼痛或病癥的藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的本發(fā)明的抗貓NGF貓源化抗體，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0135]在某些實施方案中，所述組合物進一步包括至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇。
[0136]在各種其它方面，本發(fā)明延及編碼本發(fā)明的抗體或抗體結(jié)合片段的分離核酸。
[0137]因此，本發(fā)明的另一方面提供了編碼根據(jù)本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗原結(jié)合片段的分離核酸。
[0138]在某些實施方案中，多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:23的抗貓NGF貓源化抗體或抗體片段的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 5或25的完整輕鏈。
[0139]在某些另外的實施方案中，多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID N0:4或SEQID NO: 22的抗貓NGF貓源化抗體或抗體片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有氨基酸序列SEQ IDNO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18 或 SEQ ID NO: 24 的的重鏈。
[0140]在某些實施方案中，所述分離核酸進一步編碼與其可操作地連接的一個或多個調(diào)控序列。
[0141]在另一方面，本方面提供了包含多核苷酸的表達載體，該多核苷酸編碼本發(fā)明的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，或重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述表達載體進一步包含一個或多個調(diào)控序列。在某些實施方案中，所述載體是質(zhì)粒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0142]本發(fā)明的另一方面提供了并入本發(fā)明的前述方面的表達載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的任意前述方面的抗體的宿主細(xì)胞。
[0143]本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生貓源化抗貓NGF中和抗體的方法，該方法包括以下步驟:培養(yǎng)本發(fā)明前述方面的宿主細(xì)胞以允許該細(xì)胞表達貓源化抗貓NGF中和抗體。
[0144]本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗貓NGF貓源化抗體的方法，包括以下步驟:在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達本發(fā)明前述方面的一個或多個多核苷酸/核酸或載體，其表達本發(fā)明抗體的輕鏈和/或重鏈；回收表達的多肽，其可以在一個宿主細(xì)胞內(nèi)一起表達或者在不同的宿主細(xì)胞內(nèi)單獨表達；以及分離抗體。
[0145]本發(fā)明的又一方面提供了治療、減輕或抑制貓的疼痛的方法，所述方法包括:將有效量的本發(fā)明任意前述方面的多核苷酸施用至貓。
[0146]本發(fā)明的又一方面提供了本發(fā)明的任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，用于治療、減輕或預(yù)防貓的疼痛。
[0147]在某些實施方案中，疼痛是急性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手術(shù)后疼痛或者由貓的任何手術(shù)程序造成的疼痛，其包括但不限于矯形外科手術(shù)、軟組織外科手術(shù)、卵巢子宮切除術(shù)、閹割等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛與關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥相關(guān)或由其引起，包括多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、炎癥、瘙癢、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。
[0148]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，用于治療骨關(guān)節(jié)炎和/或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0149]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，用于治療患病貓個體的通過NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤及其相關(guān)的病癥、尤其是骨肉瘤。在某些實施方案中，自分泌或旁分泌NGF誘導(dǎo)腫瘤增殖。
[0150]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段、或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物、或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，在制備用于治療或預(yù)防貓的疼痛的藥物中的用途。
[0151]在某些實施方案中，所述疼痛是急性疼痛。在某些另外的實施方案中，所述疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手術(shù)后疼痛或者由貓的任何手術(shù)程序造成的疼痛，其包括但不限于矯形外科手術(shù)、軟組織 外科手術(shù)、卵巢子宮切除術(shù)、閹割手術(shù)等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛與炎癥、瘙癢、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)或由其引起。
[0152]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，在制備用于治療、抑制、減輕或預(yù)防貓的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
[0153]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段、或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物、或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，在制備用于治療貓的通過NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤及其相關(guān)病癥、尤其是骨肉瘤的藥物中的用途。在某些實施方案中，自分泌或旁分泌NGF誘導(dǎo)腫瘤增殖。
[0154]本發(fā)明的另一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗貓NGF中和單克隆抗體或其片段的細(xì)胞系或其衍生細(xì)胞或后代細(xì)胞。所述抗體可以是貓源化抗體或嵌合抗體。
[0155]本發(fā)明的又一方面提供了用于治療貓的疼痛、或者用于治療與疼痛相關(guān)的病癥、或者用于治療、減輕或抑制與骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明任意前述方面的抗貓NGF抗體或結(jié)合片段以及其使用說明。
[0156]本發(fā)明的又一方面提供了體外、離體和體內(nèi)檢測流體中抗貓NGF單克隆抗體的診斷試劑盒，用于確定所述抗體的濃度。該試劑盒可以包含本發(fā)明任意抗體或其結(jié)合片段。該試劑盒可以包含使用說明?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0157]圖1A示出嵌合貓-大鼠抗體與貓NGF結(jié)合的圖表。圖1B示出表明嵌合貓-屬抗體與鼠NGF結(jié)合的圖表。
[0158]圖2A示出嵌合貓-大鼠抗體可以用蛋白A純化。圖2B示出具有表明嵌合抗體的重鏈和輕鏈結(jié)合的凝膠。
[0159]圖3A示出貓源化抗體與貓NGF結(jié)合的圖表。圖3B示出貓源化抗體與鼠NGF結(jié)合的圖表。
[0160]圖4A示出貓源化抗體可以用蛋白A純化。圖4B示出具有表明貓源化抗體的重鏈和輕鏈結(jié)合的凝膠。
[0161]圖5示出通過抗貓NGF貓源化抗體抑制NGF誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞增殖的圖表。
[0162]圖6示出抗原捕獲的貓源化抗體誘導(dǎo)的補體沉積(complement deposition)的圖表。
[0163]圖7示出本發(fā)明的嵌合貓-大鼠抗體的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)，包括前導(dǎo)序列和位于序列末端的雙終止密碼子。黑體表示大鼠來源可變結(jié)構(gòu)域殘基。
[0164]圖8示出本發(fā)明的嵌合貓-大鼠抗體的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)，包括前導(dǎo)序列和位于序列末端的雙終止密碼子。黑體表示大鼠來源可變結(jié)構(gòu)域殘基。
[0165]圖9示出本發(fā)明的貓源化抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:3)的氨基酸殘基。下劃線標(biāo)注包含三個⑶R(⑶R1XDR2和⑶R3)殘基的殘基。星號表示殘基與大鼠aDll抗小鼠NGF抗體中等同殘基之間的區(qū)別。根據(jù)Kabat對該殘基編號。
[0166]圖10示出本發(fā)明的貓源化抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:4)的氨基酸殘基。下劃線標(biāo)注包含三個⑶R (⑶R1XDR2和⑶R3)殘基的殘基。星號表示殘基與大鼠aDll抗小鼠NGF抗體中等同殘基之間的區(qū)別。根據(jù)Kabat對該殘基編號。
[0167]圖11示出本發(fā)明的貓源化抗體的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID N0:5)，其中黑體表示的殘基是可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，且接下來的殘基是輕鏈K恒定結(jié)構(gòu)域。
[0168]圖12示出本發(fā)明的貓源化抗體的重鏈的氨基酸序列(SEQ IDN0:6)，其中黑體表示的殘基是可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，且接下來的殘基是恒定結(jié)構(gòu)域的殘基。
[0169]圖13示出本發(fā)明可選的貓源化抗體的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID N0:22-feN2-VH)。
[0170]圖14示出具有輕鏈K恒定結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明可選的貓源化抗體的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 - feN2-Vk)?
[0171]圖15示出本發(fā)明可選的貓源化抗體的完整重鏈的氨基酸序列(SEQ ID N0:24-feN2-HC2)。
[0172]圖16示出具有輕鏈K恒定結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明可選的貓源化抗體的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID N0:25 - feN2-lLC)。
[0173]圖17示出通過對應(yīng)本發(fā)明的方法的方法制備的抗貓NGF單克隆抗體減輕狗的炎
性疼痛。
[0174]發(fā)明詳述
[0175]通過大量的試驗，發(fā)明人獲得了大鼠抗-小鼠NGF單克隆抗體(MAb) aDll氨基酸序列，并且用其產(chǎn)生了非免疫原性嵌合抗體和貓源化抗NGF抗體。所得的嵌合抗體包含來源于與貓抗體來源重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合的a Dll大鼠抗小鼠NGF抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。更加出乎意料的是，所述貓源化抗體并不是使用標(biāo)準(zhǔn)CDR移植技術(shù)產(chǎn)生的，經(jīng)證明，其顯示了結(jié)合貓NGF的高親和性。出乎意料的是，所述嵌合抗體和貓源化抗體都中和貓NGF生物功能，特別是通過抑制貓NGF與基于細(xì)胞的NGF受體TrkA和ρ75的結(jié)合。而且，還意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施用至貓時，并不在貓中產(chǎn)生針對它的中和抗體。因此，本發(fā)明的貓源化抗體和嵌合抗體都適合于長期緩解貓的慢性疼痛。
[0176]發(fā)明人利用的產(chǎn)生本發(fā)明抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的方法，導(dǎo)致輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)內(nèi)存在的特定大鼠(供體)氨基酸殘基被這樣的殘基取代，基于本發(fā)明人的分析，所述殘基會保留CDR區(qū)的構(gòu)象，并因此保持結(jié)合特異性和親合力，同時如果將抗體以不變的形式施用至貓，降低可能導(dǎo)致針對該抗體產(chǎn)生的中和抗體的免疫原性表位的存在。具體而言，制備本發(fā)明(被稱為PETisation)抗體的方法包括:通過將供體抗體框架區(qū)的序列與衍生自貓的一個抗體或抗體庫的序列進行比較，評價供體(例如大鼠)抗體框架區(qū)的序列施用至貓的適宜性。盡管該比較是在供體序列與靶序列的單個成員之間進行，但是顯而易見的是，與靶序列庫進行比較是優(yōu)選的，因為這將擴展靶標(biāo)種類中每一 Kabat位置的自然選擇的數(shù)目。這不但將增加供體與靶標(biāo)之間匹配的可能性，而且還將擴展不存在匹配的取代的選擇。因此，將能夠選擇與供體盡可能緊密的特征的取代。當(dāng)供體序列與貓序列在任何Kabat數(shù)目或?qū)?yīng)的位置不同時，修飾供體序列以用貓中該位置的自然的氨基酸殘基來取代正在討論的氨基酸殘基。
[0177]如果需要取代供體免疫球蛋白中存在的氨基酸殘基，通常采用保守取代的原則，其中該氨基酸殘基天然位于貓Kabat位置并且在大小、電荷、疏水性方面與供體序列中被取代的氨基酸盡可能密切相關(guān)的氨基酸殘基取代。目的是選擇不引起供體抗體的三維結(jié)構(gòu)擾動或破壞或引起最低程度的擾動或破壞。在某些情況下，將沒有清楚的選擇，并且每一選擇都有利弊。最終的決定可能要求各種可選序列的三維建模甚至表達。然而，通常利用明顯的偏好。作為該步驟的結(jié)果，當(dāng)殘基在靶中是外來的并且該取代氨基酸與被取代的氨基酸盡可能密切相關(guān)時，僅對供體序列作出改變。因而，避免了外來表位的產(chǎn)生，但是由于維持了整個三位結(jié)構(gòu)，因此，還維持了親和性和特異性。
[0178]輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域衍生自貓(靶)衍生的抗體。選擇或修飾重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，從而使得它們不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。非常意外的是，由于發(fā)現(xiàn)并沒有產(chǎn)生針對本發(fā)明產(chǎn)生的抗體的中和抗體或者產(chǎn)生了最少的所述抗體，因此驚人地發(fā)現(xiàn)該抗體具有長循環(huán)半衰期和重復(fù)劑量給藥的相關(guān)益處。而且，由于以不影響CDR區(qū)的三位構(gòu)造的方式進行框架殘基取代，使得其的結(jié)合特異性沒有變化。
[0179]在人類和小鼠中存在四種主要的IgG同種型，雖然術(shù)語是類似的，但它們在行為和功能上是不同的，其包括對細(xì)菌產(chǎn)物例如蛋白A和蛋白G的親和性，激活補體依賴性細(xì)胞溶解(CDC)的能力以及通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)誘導(dǎo)殺死靶細(xì)胞的能力。當(dāng)將抗體設(shè)計為清除具有它們的同源抗原的靶細(xì)胞時，用CDC和ADCC活性或“防護的”恒定結(jié)構(gòu)域選擇IgG同種型在臨床上被認(rèn)為是有益的，例如在腫瘤控制或感染控制方面(例如，為了上述目的，在人類醫(yī)學(xué)應(yīng)用中優(yōu)選人IgGl同種型)。相比之下，在其他情況中，例如緩解炎癥、疼痛或自身免疫中，激活免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是不可取的，因此優(yōu)選具有最小CDC和ADCC活性的人IgG同種型(例如，在這樣的人類醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，常常優(yōu)選IgG4同種型)。當(dāng)將抗體設(shè)計為例如在腫瘤控制或感染控制中清除具有同源抗原的靶細(xì)胞時，選擇具有CDC和ADCC活性恒定結(jié)構(gòu)域的IgG同種型是有利的，例如在人類醫(yī)學(xué)應(yīng)用中優(yōu)選人IgGl同型。相比之下，在其他情況中，例如緩解炎癥、疼痛或自身免疫中，激活免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是不可取的，因此優(yōu)選具有最小或“非防衛(wèi)”的CDC和ADCC活性的人IgG同型，例如在人類醫(yī)療用途中，選擇IgG4同種型。雖然尚不清楚貓MAb同種型是否具有類似的或不同的活性頻譜，但是推測“防衛(wèi)的”或“非防衛(wèi)”的重鏈的選擇具有類似的價值。
[0180]本發(fā)明的貓源化抗體和嵌合抗體都包含貓來源的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和貓來源的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。而且，在所述貓源化抗體和嵌合抗體中，互補性決定區(qū)(CDR)衍生自大鼠a Dll抗-小鼠NGF抗體。aDll抗體首先描述于Cattaneo et al.(CattaneoA, Rapposelli B, Calissano P.(1988)“Three distinct types of monoclonal antibodiesafter long-term immunization of rats with mouse nerve growth factor”.JNeurochem50 (4): 1003-1010,)。隨后 Ruberti et al.(Ruberti, F.et al.(1993)“Cloningand Expression of an Ant1-Nerve Growth Factor (NGF)Antibody for Studies Usingthe Neuroantibody Approach，，.Cellular and Molecular Neurobiology.13(5):559-568)克隆了 a Dll抗體。
[0181]在本發(fā)明的嵌合抗體中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是來源于aDll抗體的完整可變結(jié)構(gòu)域。
[0182]在本發(fā)明的貓源化抗體中，來源于a Dll抗體的CDR區(qū)與框架區(qū)序列結(jié)合，雖然該框架區(qū)序列基于a Dll抗體中存在的框架區(qū)，但其已通過取代特定氨基酸殘基的方式被修飾。該過程導(dǎo)致除去了將抗體施用至貓后被T細(xì)胞作為靶標(biāo)的表位。而且，以這樣的方式選擇框架殘基修飾，使得CDR區(qū)的三級結(jié)構(gòu)得以維持，同時當(dāng)將抗體施用至貓時，阻止針對所述抗體產(chǎn)生中和抗體。
[0183] 每一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域都包含四個框架區(qū)，稱為FR1-FR4。對于這些框架區(qū)中的每一個，本發(fā)明人已經(jīng)確定了每一特定位置的優(yōu)選氨基殘基(所謂的優(yōu)選殘基)，和還可能在該位置提供的可選的氨基酸殘基。以下表1至表8示出每一重鏈和輕鏈的四個框架區(qū)。這些表相對特定框架區(qū)，并且進一步根據(jù)用于沿完整的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的長度識別特定殘基位置的編號系統(tǒng)，提供了氨基酸位置。組I示出的一個殘基或多個殘基是優(yōu)選的殘基，而組2的殘基是可選的殘基。然而，對于涉及該特定位置的組I所示的殘基來說，這些殘基通常不是優(yōu)選的。使用單字母系統(tǒng)確定氨基酸殘基。
[0184]表1-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域FRl殘基
【權(quán)利要求】
1.一種制備適用于貓的抗體的方法，包括以下步驟: 從貓以外的物種提供供體抗體，其中所述供體抗體對所述貓中存在的靶抗原具有結(jié)合特異性； 將所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列的每一氨基酸殘基與一個或多個貓抗體框架區(qū)氨基酸序列中對應(yīng)位置存在的每一氨基酸殘基進行比較，以鑒別出所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)與所述一個或多個貓抗體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)對應(yīng)位置的一個或多個氨基酸殘基不同的一個或多個氨基酸殘基；以及 用所述一個或多個貓抗體中對應(yīng)位置存在的一個或多個氨基酸殘基取代所述供體抗體中的一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基的步驟包括:用對應(yīng)位置存在的與一個或多個被取代的氨基酸殘基具有最高同源性的一個或多個氨基酸殘基取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法進一步包括下述步驟:用來源于貓抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域取代所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中用HC2型貓恒定結(jié)構(gòu)域取代所述重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述靶抗原是神經(jīng)生長因子(NGF)。
6.特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)并中和貓NGF與p75或TrkA貓NGF受體結(jié)合的能力的嵌合抗體或其結(jié)合片段，所述嵌合抗體包含來源于與貓之外的物種中的神經(jīng)生長因子結(jié)合的抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和從貓來源抗體獲得的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。
7.如權(quán)利要求6所述的嵌合抗體，其中所述嵌合抗體包含輕鏈和/或重鏈，其中所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或者與所述氨基酸序列具有至少85%氨基酸同一'I"生的序列。
8.如權(quán)利要求6或7所述的嵌合抗體，其中通過氨基酸取代或缺失的方式選擇或修飾所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，使得所述恒定結(jié)構(gòu)域不介導(dǎo)下游效應(yīng)子功能。
9.如權(quán)利要求8所述的嵌合抗體，其中所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域是具有氨基酸序列SEQIDNO: 19的非糖基化的氨基酸序列，或者與所述氨基酸序列具有至少85%氨基酸同一性的序列。
10.能夠特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)的中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗體結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求10所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈包含氨基酸序列SEQID NO:25或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求10或11所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24或與 所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
13.能夠特異性結(jié)合貓神經(jīng)生長因子(NGF)的中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗體結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID N0:3或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
14.如權(quán)利要求10-13中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或貓源化抗體。
15.如權(quán)利要求10-14中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中通過氨基酸取代或缺失的方式選擇或修飾所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，使得所述恒定結(jié)構(gòu)域不介導(dǎo)下游效應(yīng)子功倉泛。
16.如權(quán)利要求10-15中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體與貓NGF的結(jié)合抑制貓NGF與p75或TrkA貓NGF受體結(jié)合的能力。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求13-17中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈包含選自 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18 的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
19.抗貓NGF抗體或其貓NGF結(jié)合片段，包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含以下中的至少一個: 由氨基酸序列SEQ ID NO:26組成或包含所述氨基酸序列的FRl框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:27組成或包含所述氨基酸序列的FR2框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:28組成或包含所述氨基酸序列的FR3框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:29組成或包含所述氨基酸序列的FR4框架區(qū)； 所述重鏈可變區(qū)包含以下中的至少一個: 由氨基酸序列SEQ ID NO:30組成或包含所述氨基酸序列的FRl框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:31組成或包含所述氨基酸序列的FR2框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:32組成或包含所述氨基酸序列的FR3框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成或包含所述氨基酸序列的FR4框架區(qū)。
20.如權(quán)利要求19所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQID NO: 26的FRl區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 26通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:D1是E或N，12是V、P或T，E3是V或M，M4是L或I，S7是T，SlO是F，S12是P 或 A，T14 是 I 或 A，E17 是 D，S18 是 P 或 A，V19 是 A，121 是 F 以及 S22 是 F。
21.如權(quán)利要求19或20所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQIDNO:27的FR2區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO:27通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:Y2是F，L3是F或R，Κ5是R，R8是Q，L12是R，114是M以及Υ15是H或A0
22.如權(quán)利要求19-21中任一項所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 28的FR3區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 28通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾=Gl是R，F(xiàn)6是I，S7是Τ，Τ13是A或S，Τ16是I或Α，Κ18是R或Τ, S20 是 A、G 或 T，R21 是 G，V22 是 M，Q23 是 Ε，Τ24 是 Α、V 或 P，Ε25 是 D，V29 是 1、H 或 L以及F31是Y。
23.如權(quán)利要求19-22中任一項所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 29的FR4區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 29通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾=Fl是S，Q3是P，K6是H、Q、E、S或T，E8是D，L9是V、I或M以及KlO 是 R、D 或 T。
24.如權(quán)利要求19-23中任一項所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO:30的FRl區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO:30通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:Q1是D或E，V2是E，Q3是L或R，L4是V，V5是M，E6是Q或D，A9 是 G，ElO 是 D 或 N，Lll 是 V 或 R，V12 是 R 或 K，Q13 是 K、Τ、E、N 或 R，P14 是 T，G15 是Ε, E16 是 G、A 或 T，S17 是 A，L18 是 V，R19 是 K 或 E，L20 是 I 或 P，T21 是 F 或 S，A23 是 K、V或Q，A24是T或D以及G26是A。
25.如權(quán)利要求19-24中任一項所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 31的FR2區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 31通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:V2是L，F(xiàn)或I，R3是C或H，A5是S、V或T，G7是A、E或S，K8是Q或E，LlO是F或P，Ell是Q，W12是C或L，M13是V或I以及G14是A或S。
26.如權(quán)利要求19-25中任一項所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 32的FR3區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 32通過被選自以下的一個或多 個氨基酸取代進行修飾:R1是Q或K，L2是F，T3是I，14是L、M或V，T5是S，R6是A，T、K、G 或 V，T8 是 N、D、A 或 S，S9 是 A、D 或 T，KlO 是 Τ、E、Q、N 或 R，Nll 是 D 或 K，T12 是 I 或A, V13 是 A、L 或 G，F(xiàn)14 是 Y、V、A、S 或 W，L15 是 M，Q16 是 E、D、H 或 V，M17 是 L，H18 是 N、S、T、D、G 或 R, S19 是 N, Q21 是 R、K 或 T，S22 是 T、1、A 或 V，E23 是 A、T、D、G 或 S，A26 是G 或 S，T27 是 V、M、I 或 A，Y28 是 H，Y29 是 H 或 F 以及 A31 是 T、V、G、L、I 或 M。
27.如權(quán)利要求19-26中任一項所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 33的FR4區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 33通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾=Wl是R、C或L，G2是A，Q3是H、R、P或V，G4是D，T5是A或V，T6是 L、1、Q、M 或 S，V7 是 I，T8 是 A、I 或 R，V9 是 G，SlO 是 P 以及 All 是 S 或 Q。
28.如權(quán)利要求19-27中任一項所述的抗貓NGF抗體或貓NGF結(jié)合片段，其中所述抗體具有HC2型貓恒定結(jié)構(gòu)域。
29.通過權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法制備的抗體或其結(jié)合片段。
30.如權(quán)利要求6-29中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其中當(dāng)與貓NGF結(jié)合時，中和貓NGF結(jié)合p75或TrkA貓NGF受體的能力。
31.如權(quán)利要求6-30中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其以平衡解離常數(shù)為IX 10_8或更小的結(jié)合親和性與貓NGF特異性結(jié)合。
32.如權(quán)利要求6-31中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述抗體是多特異性抗體或多價抗體。
33.如權(quán)利要求6-32中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述抗體或結(jié)合片段在貓中不是免疫原性的。
34.如權(quán)利要求6-33中任一項所述的結(jié)合片段，其中所述結(jié)合片段選自單鏈Fv(scFV)抗體片段、Fab抗體片段、Fab’抗體片段和F(ab’)2抗體片段。
35.治療、抑制或減輕貓?zhí)弁吹姆椒ǎ龇椒òㄒ韵虏襟E: 提供治療有效量的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或貓源化抗體；以及 將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求6_9中任一項所述的嵌合抗體。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求10-12中任一項所述的貓源化抗體。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求13-18中任一項所述的抗體。
39.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求19-28中任一項所述的抗體。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求29-34中任一項所述的抗體。
41.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
42.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
43.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:25或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含選自SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:24 的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
44.如權(quán)利要求35-43中任一項所述的方法，其中所述疼痛選自神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、圍術(shù)期疼痛、手術(shù)后疼痛和外科手術(shù)后疼痛。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中手術(shù)后疼痛選自矯形外科手術(shù)、軟組織外科手術(shù)、卵巢子宮切除術(shù)和閹割手術(shù)引起的疼痛。
46.治療貓個體關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或貓源化抗體；以及 將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
49.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
50.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:25或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含選自SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:24 的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
51.如權(quán)利要求46-50中任一項所述的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥包括選自免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的病癥。
52.如權(quán)利要求46-51中任一項所述的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥的治療包括減輕、抑制、降低、壓制或延遲與所述關(guān)節(jié)炎病癥相關(guān)或由其引起的疼痛的發(fā)作。
53.治療貓個體由貓NGF表達增強或?qū)GF敏感性增強引起的或與其相關(guān)的或由其導(dǎo)致的病癥的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或貓源化抗體；以及 將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體。`
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
56.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
57.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:25或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含選自SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:24 的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
58.治療貓中由NGF誘發(fā)增殖的腫瘤和與其相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或貓源化抗體；以及 將所述抗貓NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的貓。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體是權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
62.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述抗貓NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:25或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含選自SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:24 的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
63.如權(quán)利要求58-62中任一項所述的方法,其中所述腫瘤由自分泌或旁分泌NGF誘導(dǎo)增殖。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
65.如權(quán)利要求35-64中任一項所述的方法，其進一步包括共施用至少一種另外的治療劑的步驟。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇和類固醇。
67.如權(quán)利要求65所述的方法，`其中所述至少一種治療劑選自抗生素、抗真菌治療劑、抗原生動物治療劑和抗病毒治療劑。
68.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自炎癥介質(zhì)的抑制劑、PGE受體拮抗劑、免疫抑制劑、環(huán)孢霉素、抗炎糖皮質(zhì)激素、用于治療認(rèn)知功能障礙或損傷的藥劑、抗高血壓藥劑、用于治療心血管功能障礙的化合物、利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑和HMG-CoA還原酶抑制劑。
69.如權(quán)利要求35-68中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結(jié)合片段以約0.01mg/kg體重至約10mg/kg體重的劑量施用至貓。
70.如權(quán)利要求35-68中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結(jié)合片段以約0.03mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量施用至貓。
71.用于治療貓?zhí)弁椿蛴韶執(zhí)弁匆鸹驅(qū)е碌牟“Y的藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗貓NGF抗體或其結(jié)合片段，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
72.如權(quán)利要求71所述的藥物組合物，進一步包含至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇。
73.如權(quán)利要求71或72所述的藥物組合物，其中所述導(dǎo)致疼痛的病癥選自風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、急性疼痛、炎癥、瘙癢、慢性疼痛、外科手術(shù)疼痛和外科手術(shù)后疼痛。
74.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
75.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO: 3或SEQ ID NO: 23的抗貓NGF貓源化抗體或抗體片段的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有氨基酸序列SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:25的輕鏈。
76.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID N0:4或SEQ ID N0:22的抗貓NGF貓源化抗體或抗體片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有選自SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重鏈。
77.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO:1的抗貓NGF嵌合抗體或其抗體片段的輕鏈。
78.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO: 2,SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 19的抗貓NGF嵌合抗體或其抗體片段的重鏈。
79.如權(quán)利要求74-78中任一項所述的分離的核酸，其可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列。
80.表達載體,其包含權(quán)利要求74-78中任一項所述的核酸。
81.如權(quán)利要求80所述的表達載體，其進一步包含一個或多個調(diào)控序列。
82.如權(quán)利要求80或81所述的表達載體，其中所述載體是質(zhì)?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒載體。
83.宿主細(xì)胞，其整合了權(quán)利要求80-82中任一項所述的表達載體。
84.產(chǎn)生貓源化抗貓NGF中和抗體的方法，所述方法包括:培養(yǎng)權(quán)利要求83所述的宿主細(xì)胞，以使所述細(xì)胞表達貓源化抗貓NGF中和抗體。
85.治療、減輕或抑制貓?zhí)弁吹姆椒ǎ龇椒ò▽⒅委熡行Я康臋?quán)利要求74-78中任一項所述的核酸施用至所述貓。
86.權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求71-73中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求74-78中任一項所述的核酸，權(quán)利要求80-82所述的表達載體，或者權(quán)利要求83所述的宿主細(xì)胞，用于治療或預(yù)防貓的痛。
87.如權(quán)利要求86所述的抗體或抗體結(jié)合片段，其中所述疼痛選自:急性疼痛、慢性疼痛、圍術(shù)期疼痛、手術(shù)后疼痛、矯形外科手術(shù)引起的疼痛、與軟組織外科手術(shù)相關(guān)的疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、由卵巢子宮切除術(shù)引起的疼痛、由閹割手術(shù)引起的疼痛、與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛以及與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的或由其引起的疼痛。
88.權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求71-73中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求74-78中任一項所述的核酸，權(quán)利要求80-82所述的表達載體，或者權(quán)利要求83所述的宿主細(xì)胞，用于治療關(guān)節(jié)炎。
89.如權(quán)利要求88中所述的抗體或抗體結(jié)合片段，其中所述關(guān)節(jié)炎是骨關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
90.權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求71-73中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求74-78中任一項所述的核酸，權(quán)利要求80-82所述的表達載體，或者權(quán)利要求83所述的宿主細(xì)胞，用于治療貓中由NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤及其相關(guān)病癥。
91.如權(quán)利要求90所述的抗體或抗體結(jié)合片段，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
92.權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求71-73中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求74-78中任一項所述的核酸，權(quán)利要求80-82所述的表達載體，或者權(quán)利要求83所述的宿主細(xì)胞，在制備用于治療或預(yù)防貓的疼痛的藥物中的用途。
93.如權(quán)利要求92所述的用途，其中所述疼痛選自急性疼痛、慢性疼痛、圍術(shù)期疼痛、手術(shù)后疼痛、矯形外科手術(shù)引起的疼痛、與軟組織外科手術(shù)相關(guān)的疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、由卵巢子宮切除術(shù)引起的疼痛、由閹割手術(shù)引起的疼痛、與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛以及與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的或由其引起的疼痛。
94.權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求71-73中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求74-78中任一項所述的核酸，權(quán)利要求80-82所述的表達載體，或者權(quán)利要求83所述的宿主細(xì)胞，在制備用于治療、抑制、減輕或預(yù)防貓關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
95.如權(quán)利按要求94所述的用途，其中所述關(guān)節(jié)炎是骨關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
96.權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求71-73中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求74-78中任一項所述的核酸或者權(quán)利要求80-82所述的表達載體，或者權(quán)利要求83所述的宿主細(xì)胞，在制備用于治療貓中由NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤和其相關(guān)病癥的藥物中的用途。
97.如權(quán)利按要求96所述的用途，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
98.細(xì)胞系或其衍生細(xì)胞或后代細(xì)胞，其產(chǎn)生權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗貓NGF中和單克隆抗體或其片段。
99.用于治療貓的疼痛，或者用于治療與疼痛相關(guān)的病癥，或者用于治療、減輕或抑制與骨關(guān)節(jié)炎、炎癥、瘙癢、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗貓NGF抗體或片段及其使用說明。
100.用于檢測抗貓NGF單克隆抗體或結(jié)合片段的診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求6-34中任一項所述的抗貓NGF抗體或結(jié)合片段。
【文檔編號】C07K16/46GK103732621SQ201280033596
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月6日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·吉爾芮 申請人:Nvip私人有限公司