專利名稱：神經(jīng)生長因子偶聯(lián)物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供包含 與至少一種抗原連接的病毒樣顆粒(VLP)的組合物，其中所述抗原是NGF抗原。本發(fā)明還 提供制備所述組合物的方法。本發(fā)明的組合物和方法可以用于生產(chǎn)疫苗，特別是用于治療 慢性疼痛。而且，本發(fā)明的組合物能夠誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長因子(NGF)也被稱為NGFii，是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族 的成員，除NGF以外，該家族還包括腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3和神 經(jīng)營養(yǎng)蛋白 4/5 (Pezet 和 McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29 :507_38 (2006))。如同所有 神經(jīng)營養(yǎng)蛋白一樣，NGF表達(dá)為大約27kDa的蛋白原，并且被切割為大約14kDa的成熟形 式(Edwards 等人，J Biol Chem. 263(14) 6810-5 (1988) ；Seidah 等人，Biochem J. 314 951-60(1996))。這種成熟形式通過結(jié)合兩種受體發(fā)揮其生物功能共同受體p75N ，該受體 以低親和力結(jié)合所有神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，和高親和力原肌球蛋白受體激酶A(trkA)受體。TrkA 是受體酪氨酸激酶，它在配體結(jié)合時(shí)二聚化，并且激活不同的信號(hào)途徑(Patapontian和 Reichardt, Curr Opin Neurobiol. 11 (3) :272_802001))。在早期發(fā)育過程中，被 NGF-trkA 相互作用激活的這些信號(hào)途徑阻斷細(xì)胞凋亡并且促進(jìn)傷害感受系統(tǒng)的感覺神經(jīng)元的存活 和神經(jīng)生長(Patel等人，Neuron 25(2) :345_57 (2000))。在出生后，這些神經(jīng)元的存活 對(duì)NGF的依賴性降低，但是在出生后時(shí)期NGF繼續(xù)對(duì)傷害性感受器發(fā)揮深刻的生物學(xué)效 應(yīng)。它調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、受體和電壓門控性離子通道的表達(dá)，由此控制傷害性感受器的響應(yīng) 性。NGF的另一功能上重要的作用是通過翻譯后控制使傷害性感受器響應(yīng)敏感，這導(dǎo)致瞬 時(shí)感受器電位香草酸受體1 (TRPVl)離子通道的響應(yīng)性增強(qiáng)(Pezet和McMahon，Annu. Rev. Neurosci. 29 :507_38(2006))。NGF由于其在調(diào)節(jié)成人中傷害性感受器響應(yīng)性中的作用，參與動(dòng)物和人的痛覺的 介導(dǎo)。皮下或肌肉注射少量NGF導(dǎo)致持續(xù)數(shù)日的疼痛和壓痛(Pezet和McMahon，Annu. Rev. Neurosci. 29 :507-38 (2006))。在人體中，NGF水平與疼痛強(qiáng)度之間的相關(guān)性可在大量疼 痛條件如慢性前列腺炎(Miller等人，Urology，2002. 59(4) :603_8 (2002))、間質(zhì)性膀胱炎 (Lowe等人，Br J Urol. 79 (4) :572_7 (1997))等中進(jìn)行評(píng)估。基本上，可以區(qū)別兩種類型的 疼痛傷害性疼痛和神經(jīng)性疼痛。傷害性疼痛由組織損傷引起的傷害性感受器的刺激引起， 例如在炎癥過程中、損傷或手術(shù)切口后，而神經(jīng)性疼痛來源于神經(jīng)系統(tǒng)本身的病理，例如在 神經(jīng)受壓迫或創(chuàng)傷后，或在影響感覺神經(jīng)元的感染或自身免疫后。在炎癥過程中，NGF作為產(chǎn)生疼痛的炎癥介質(zhì)起作用。它是由外周的大量不同細(xì) 胞型產(chǎn)生的，如角質(zhì)形成細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和許旺細(xì)胞，以及在炎癥過程中，特別 是由肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的。NGF水平在動(dòng)物和人的炎癥和慢性疼痛狀況下顯著升 高。已經(jīng)在大量嚙齒類動(dòng)物傷害性疼痛模型中證明，NGF的阻斷顯著降低疼痛敏感性。例 如，它降低皮下注射CFA后的熱和機(jī)械痛覺過敏(Woolf等人，Br. J. Pharmacol. 121(3)417-24(1997)并且抑制關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛(Shelton等人，Pain 116(1-2) :8_16 (2005))和 骨癌痛(Sevcik等人，Painl 15 (1-2) 128-41 (2005))。盡管NGF在神經(jīng)性疼痛中的作用沒 有在炎癥疼痛中的作用那么確定，但是一些研究小組也已經(jīng)表明在嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)性疼痛 模型中成功進(jìn)行了抗 NGF 治療(Ramer 等人，Neurosci. Lett. 251 (1) :53_6 (1998)，Ramer 等 人，Eur. J. Neurosci. 11 (3) :837_46 (1999))。美國專利5，147，294請(qǐng)求保護(hù)NGF拮抗劑，尤其是NGF單克隆抗體，用于治療疼痛 的用途。自此以后，已申請(qǐng)了大量的專利來請(qǐng)求保護(hù)抗NGF單克隆抗體在治療慢性疼痛中 的用途。慢性疼痛是嚴(yán)重的健康問題，影響到歐洲和美國人群的大約20%。只有不到 30%的慢性疼痛患者使用當(dāng)前的治療能夠獲得足夠的緩解(Pezet和McMahon，Annu. Rev. Neurosci. 29 :507_38 (2006)。而且，現(xiàn)有的用于治療慢性疼痛的藥物，主要是阿片類藥物和 非甾體抗炎藥(NSAID)，如果使用較長的一段時(shí)間，將伴隨有嚴(yán)重的副作用。

發(fā)明內(nèi)容
此處公開的新的治療策略是基于針對(duì)NGFβ的主動(dòng)免疫。公開了誘導(dǎo)患者的免疫 系統(tǒng)產(chǎn)生NGF-中和抗體的組合物。主動(dòng)免疫可以導(dǎo)致NGFii的持久中和，因此可以減少對(duì) 每日藥物攝取的需要。我們現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)，分別包含至少一種NGF抗原的本發(fā)明的組合 物和疫苗能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答，導(dǎo)致針對(duì)NGF的高抗體效價(jià)。而且，我們已 經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，分別包含至少一種NGF抗原的本發(fā)明的組合物和疫苗能夠在慢性疼痛動(dòng)物 模型中減輕疼痛。這表明本發(fā)明的組合物和疫苗分別產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，特別是抗體，能夠在 體內(nèi)特異性結(jié)合NGF，并且中和及抑制其功能。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是一種組合物，其包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn) 的核心顆粒；和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原 是NGF抗原，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附 著位點(diǎn)連接。NGFii是具有生物活性的受體配體，當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)，該生物活性可以導(dǎo)致不 希望的副作用。本發(fā)明因此提供組合物，其中所述NGF蛋白是NGF突變蛋白，并且其中所述 NGF突變蛋白具有降低的生物活性或沒有生物活性，而同時(shí)保持誘導(dǎo)NGFii中和抗體的能 力。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述NGF抗原是NGF突變蛋白。通常，非常不希望的副作用可能與抗NGF β疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)。然而，本發(fā) 明的組合物特別可用于有效誘導(dǎo)針對(duì)特定環(huán)境內(nèi)的NGF抗原的強(qiáng)抗體應(yīng)答，同時(shí)降低或消 除不希望的T細(xì)胞應(yīng)答。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物因此進(jìn)一步包含至少一 種聚陰離子大分子，其中所述聚陰離子大分子包裝于所述VLP內(nèi)，并且其中優(yōu)選地所述聚 陰離子大分子是聚陰離子多肽，并且其中優(yōu)選地所述聚陰離子多肽是聚谷氨酸或聚天冬氨 酸，最優(yōu)選聚谷氨酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含治療有效量的本發(fā)明組合物的疫苗組合物。本發(fā)明的另一方面是包含(a)本發(fā)明的組合物和(b)藥學(xué)可接受的載體的藥物組 合物。本發(fā)明的另一方面是免疫方法，優(yōu)選針對(duì)NGF3的免疫方法，所述方法包括給動(dòng) 物，優(yōu)選地給人施用本發(fā)明的組合物、本發(fā)明的疫苗組合物或本發(fā)明的藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面是用作藥物的本發(fā)明的組合物、本發(fā)明的疫苗組合物或本發(fā)明 的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的組合物或本發(fā)明的疫苗組合物用于制備治療疼痛， 優(yōu)選治療慢性疼痛的藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面是用于治療疼痛，優(yōu)選治療慢性疼痛的本發(fā)明的組合物或本發(fā) 明的疫苗組合物或本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面是一種生產(chǎn)本發(fā)明的組合物的方法，所述方法包括(a)提供 具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的VLP ;(b)提供具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種NGF抗 原；和(c)將所述VLP與所述NGF抗原連接，產(chǎn)生所述組合物，其中所述NGF抗原和所述VLP 通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。


圖1 免疫小鼠的純化總IgG對(duì)mNGFP的體外中和。TF-I細(xì)胞響應(yīng)于mNGF3 的增殖通過BrdU摻入法進(jìn)行測定。在10 μ g/ml來自Qi3免疫動(dòng)物的總IgG存在下響應(yīng) 于lOng/ml mNGF^的增殖設(shè)定為100 %，響應(yīng)于所有其它條件的TF-I增殖相對(duì)于該值 進(jìn)行計(jì)算。圓形代表與來自Q0免疫動(dòng)物的IgG預(yù)溫育后獲得的值，正方形代表與來自 Q β -mNGFii -His-GGC免疫動(dòng)物的IgG預(yù)溫育后獲得的值。給出了重復(fù)三次的平均值+/-SD。圖2 =CIA小鼠中臨床評(píng)分和平均體重的發(fā)展。小鼠在第0、10、20天免疫，并在第 27和48天誘導(dǎo)CIA。Α)用Qi3 (實(shí)心正方形)或Qβ-mNGFβ-His-GGC(空心圓形)免疫的 小鼠的臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分。數(shù)值作為每只小鼠全部四肢和組(η = 8)的平均得分+/-SEM給 出。B)用Qi3 (實(shí)心正方形)或Qi3-mNGFii-His-GGC(空心圓形)免疫的小鼠的平均體重。 數(shù)值作為平均體重(η = 8)+/-SEM給出。圖3 酵母聚糖A誘導(dǎo)的炎性痛的熱超敏性和機(jī)械異常性疼痛。小鼠在第0、10、20 天免疫，并且在第31天通過向左后足爪注射酵母聚糖A誘導(dǎo)炎性痛。Α)用Qi3 (實(shí)心正方 形)或Qi3-mNGFii-His-GGC(空心圓形)免疫的小鼠的熱超敏性，以爪回縮時(shí)間確定。數(shù) 值作為平均值(η = 4) +/-SEM給出。B)用Q β (實(shí)心正方形)或Q β -mNGF β -His-GGC (空 心圓形)免疫的小鼠的機(jī)械異常性疼痛，以導(dǎo)致爪回縮的施加的壓力確定。數(shù)值作為平均 值(η = 4)+/-SEM 給出。圖4 在Q β - (PolyGlu) -mNGF β -His-GGC免疫的小鼠中用酵母聚糖A誘導(dǎo)的 炎性痛的熱超敏性和機(jī)械異常性疼痛。小鼠在第0、14、28、42天免疫，并且在第62天 通過向左后足爪注射酵母聚糖A誘導(dǎo)炎性痛。A)用Qi3 (PolyGlu)(實(shí)心正方形)、 Q β (PolyGlu) -mNGF β -His-GGC (實(shí)心三角形)或 Q β -mNGF β -His-GGC (空心圓形)免 疫的小鼠的熱超敏性，以爪回縮時(shí)間確定。數(shù)值作為平均值(n = 4)+/-SEM給出。B) 用 (PolyGlu)(實(shí)心正方形)、Qi3 (PolyGlu)-mNGF β-His-GGC (灰色實(shí)心圓形)或 Q^-mNGFβ-His-GGC(空心圓形)免疫的小鼠的機(jī)械異常性疼痛，以導(dǎo)致爪回縮的施加的 壓力確定。數(shù)值作為平均值(η = 4)+/-SEM給出。發(fā)明詳述除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員的通常理解具有相同的含義。
抗原本文所用的術(shù)語“抗原”指如果被MHC分子呈遞，則能夠被抗體或T細(xì)胞受 體(TCR)結(jié)合的分子。本文所用的術(shù)語“抗原”也包括T細(xì)胞表位?？乖€能夠被免疫系 統(tǒng)識(shí)別，以及/或者能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞 的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有Th細(xì)胞表位或者連接于Th細(xì)胞表 位上，并且包含于佐劑中。一個(gè)抗原可能具有一個(gè)或多個(gè)表位(B和T表位)。上面提到的 特異性反應(yīng)表示抗原優(yōu)選地一般以高選擇性方式與其相應(yīng)的抗體或TCR反應(yīng)，而不與可能 由其它抗原誘導(dǎo)的其它許多抗體或TCR反應(yīng)。本文所用的抗原也可以是幾種不同抗原的混 合物。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是NGF抗原。表位術(shù)語“表位”是指多肽的連續(xù)或不連續(xù)部分，它可以被抗體或被MHC分子環(huán) 境內(nèi)的T細(xì)胞受體免疫特異性地結(jié)合。免疫特異性結(jié)合不包括非特異性結(jié)合，但是不一定 不包括交叉反應(yīng)性。一個(gè)表位在該表位獨(dú)特的空間構(gòu)象中一般包含5-10個(gè)氨基酸。聯(lián)接的(associated)本文所用的術(shù)語“聯(lián)接的”(或其名詞聯(lián)接)是指所有可 能的方式，優(yōu)選化學(xué)相互作用，通過這種方式，兩個(gè)分子聯(lián)接在一起?；瘜W(xué)相互作用包括共 價(jià)和非共價(jià)的相互作用。非共價(jià)相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫 鍵，而共價(jià)相互作用例如基于共價(jià)鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或 酰亞胺鍵。第一附著位點(diǎn)本文所用的短語“第一附著位點(diǎn)”是指VLP(優(yōu)選RNA噬菌體的 VLP)中天然存在的或者人工添加到VLP(優(yōu)選RNA噬菌體的VLP)中的一種元件，第二附著 位點(diǎn)可與之連接。第一附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成 的聚合物、次級(jí)代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基 磺酰氟)、或化學(xué)反應(yīng)基如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；蚱浣M合。作為第一附著 位點(diǎn)的化學(xué)反應(yīng)基的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是氨基酸(如賴氨酸)的氨基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基的氨基，其中優(yōu)選地所述賴氨酸殘基是天然存 在于所述VLP、優(yōu)選地存在于RNA噬菌體的所述VLP的賴氨酸殘基。第一附著位點(diǎn)一般位于VLP、優(yōu)選RNA噬菌體的VLP、最優(yōu)選RNA噬菌體Q β的VLP 的表面上，優(yōu)選外表面上。多個(gè)第一附著位點(diǎn)典型且優(yōu)選地以重復(fù)構(gòu)型存在于病毒樣顆粒、 優(yōu)選RNA噬菌體的VLP、最優(yōu)選RNA噬菌體Q β的VLP的表面上，優(yōu)選外表面上。在一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)與VLP通過至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選通過至少一個(gè)肽鍵聯(lián)接。 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)天然存在于VLP中。可替代地，在另一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)被人工添加到VLP上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)與 所述VLP通過至少一個(gè)共價(jià)鍵、優(yōu)選地通過至少一個(gè)肽鍵聯(lián)接，其中所述VLP是RNA噬菌體 的VLP，優(yōu)選RNA噬菌體Q β的VLP。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是賴 氨酸殘基的氨基，其中所述賴氨酸殘基是外殼蛋白的賴氨酸殘基，優(yōu)選RNA噬菌體的外殼 蛋白的賴氨酸殘基，最優(yōu)選RNA噬菌體Qβ的外殼蛋白的賴氨酸殘基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是RNA噬菌體的外殼蛋白的賴氨酸殘基的氨基，其中優(yōu)選地 所述外殼蛋白包含或者優(yōu)選地由氨基酸序列SEQ ID NO :1組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述第一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地所述賴氨酸殘基是外殼蛋白的賴氨酸殘 基，優(yōu)選RNA噬菌體的外殼蛋白的賴氨酸殘基，最優(yōu)選RNA噬菌體Q β的外殼蛋白的賴氨酸 殘基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是RNA噬菌體Qi3的外殼蛋白的賴氨酸殘基。第二附著位點(diǎn)本文使用的短語“第二附著位點(diǎn)”是指天然存在于或者人工添加到 NGF抗原上的一種元件，第一附著位點(diǎn)可以與之連接。NGF抗原的第二附著位點(diǎn)可以是蛋白 質(zhì)、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級(jí)代謝物或化合物(生物素、 熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)、或化學(xué)反應(yīng)基例如氨基、羧基、巰 基、羥基、胍基、組氨?；?、或其組合。作為第二附著位點(diǎn)的化學(xué)反應(yīng)基的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案是巰基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二附著位點(diǎn)是巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰 基。本文使用的術(shù)語“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原”和可互換使用的術(shù)語“具有至少 一個(gè)第二附著位點(diǎn)的NGF抗原”是指包含NGF抗原和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的構(gòu)建體。在 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二附著位點(diǎn)天然存在于NGF抗原中。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，第二附著位點(diǎn)被人工添加到NGF抗原上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二附著位點(diǎn)與NGF 抗原通過至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選地通過至少一個(gè)肽鍵聯(lián)接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有至 少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的NGF抗原進(jìn)一步包含連接體，其中優(yōu)選地所述連接體包含至少一個(gè) 第二附著位點(diǎn)，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述連接體與NGF抗原通過肽鍵融合。外殼蛋白術(shù)語“外殼蛋白”是指能夠摻入病毒衣殼或VLP內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選 病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的天然衣殼的亞單位。外殼蛋白也被稱為衣殼蛋白。連接的本文所用的術(shù)語“連接的”(或其名詞連接)是指所有可能的方式，優(yōu) 選化學(xué)相互作用，通過這種方式，至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接在 一起?；瘜W(xué)相互作用包括共價(jià)和非共價(jià)的相互作用。非共價(jià)相互作用的典型例子是離子 相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價(jià)相互作用例如基于共價(jià)鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、 碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)和第二附著 位點(diǎn)通過至少一個(gè)共價(jià)鍵連接，優(yōu)選通過至少一個(gè)非肽鍵連接，更優(yōu)選只通過非肽鍵連接。 然而，本文所用的術(shù)語“連接”應(yīng)當(dāng)不僅包括至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位 點(diǎn)的直接連接，而且可替代地并且優(yōu)選地，包括至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附 著位點(diǎn)通過中間分子的間接連接，典型且優(yōu)選地通過使用至少一個(gè)、優(yōu)選一個(gè)異雙功能交 聯(lián)劑進(jìn)行連接。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè) 第二附著位點(diǎn)通過至少一個(gè)、優(yōu)選恰好一個(gè)異雙功能交聯(lián)劑共價(jià)連接，其中優(yōu)選地所述第 一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基的氨基，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸殘基的 巰基。連接體本文所用的“連接體”將第二附著位點(diǎn)與NGF抗原聯(lián)接，或者已經(jīng)包含第 二附著位點(diǎn)、基本由、或者由第二附著位點(diǎn)組成。優(yōu)選地，本文所用的“連接體”已經(jīng)包含第 二附著位點(diǎn)，典型且優(yōu)選地_但不是必需地_是一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸殘基。在一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述連接體是氨基酸連接體。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述連接 體由恰好一個(gè)半胱氨酸殘基組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述連接體包含或由恰好 一個(gè)半胱氨酸殘基組成，且所述第二附著位點(diǎn)是所述恰好一個(gè)半胱氨酸殘基的巰基?？捎?于本發(fā)明的其他連接體有包含C1-C6烷基_、環(huán)烷基如環(huán)戊基或環(huán)己基、環(huán)烯基、芳基或雜 芳基部分的分子。而且，優(yōu)選包含C1-C6烷基-、環(huán)烷基_(C5，C6)、芳基-或雜芳基-部分 和另外的氨基酸的連接體也可以用作本發(fā)明的連接體，并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。連接 體與NGF抗原的聯(lián)接優(yōu)選地通過至少一個(gè)共價(jià)鍵，更優(yōu)選地通過至少一個(gè)肽鍵。在非天然存在于NGF抗原中的第二附著位點(diǎn)的情況下，連接體與至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)例如半胱氨 酸優(yōu)選地通過至少一個(gè)共價(jià)鍵，更優(yōu)選通過至少一個(gè)肽鍵聯(lián)接。氨基酸連接體術(shù)語“氨基酸連接體”是指包含至少一個(gè)氨基酸殘基的連接體。通 常，術(shù)語“氨基酸連接體”并不意味著所述氨基酸連接體僅由氨基酸殘基組成。然而，在一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸連接體僅由氨基酸殘基組成。連接體的氨基酸殘基優(yōu)選包 含本領(lǐng)域已知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸，全L型或全D型或其混合物，最優(yōu)選全 L型。本發(fā)明的連接體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是包含巰基或半胱氨酸殘基的分子，因此這 些分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。NGF抗原本文使用的術(shù)語“NGF抗原”是指NGF蛋白、NGF片段或NGF突變蛋白。 非常優(yōu)選地，所述NGF抗原是NGF突變蛋白。本文使用的術(shù)語“NGF抗原，，還包括翻譯后修 飾，包括但不限于如上定義的NGF抗原的糖基化、乙?；?、磷酸化。典型且優(yōu)選地，但是不是 必須地，所述NGF抗原被單克隆和/或多克隆抗NGFii抗體特異性結(jié)合。NGF蛋白本文使用的術(shù)語“NGF蛋白”應(yīng)當(dāng)包括任何如下多肽該多肽包含或者可 替代地或優(yōu)選地由SEQ ID NO 22的人NGF、SEQID NO 24的小鼠NGF或來自任何其它動(dòng)物 的相應(yīng)直向同源物(ortholog)組成。來自各種動(dòng)物物種的非常優(yōu)選的NGF直向同源物是 SEQ IDNO :32-39的多肽。NGF蛋白一般但是不是必須包含生物活性，優(yōu)選地在細(xì)胞增殖試 驗(yàn)中。而且，本文使用的術(shù)語“NGF蛋白”應(yīng)當(dāng)也包括任何如下多肽該多肽包含或者可替 代地或優(yōu)選地由任何天然或遺傳工程變體組成，該變體具有與SEQ ID N0:22的人NGF、SEQ IDNO 24的小鼠NGF或來自任何其它動(dòng)物的相應(yīng)直向同源物高于70%，優(yōu)選地高于80%， 優(yōu)選地高于85 %，更優(yōu)選地高于90 %，更優(yōu)選地高于95 %，最優(yōu)選地高于97 %的氨基酸序 列同一性。本文使用的術(shù)語“NGF蛋白”應(yīng)當(dāng)還包括翻譯后修飾，包括但不限于如本文定義 的NGF蛋白的糖基化、乙?；⒘姿峄?。優(yōu)選地，本文定義的NGF蛋白由長度最多200個(gè)氨 基酸、甚至更優(yōu)選地長度最多150個(gè)氨基酸、更優(yōu)選地長度最多130個(gè)氨基酸組成。典型且 優(yōu)選地，所述NGF蛋白被單克隆和/或多克隆抗NGFii抗體特異性結(jié)合。此外，可用于本發(fā) 明的目的的NGF蛋白典型且優(yōu)選地當(dāng)以免疫原性偶聯(lián)物的形式、優(yōu)選地以含有噬菌體Qi3 的VLP的偶聯(lián)物的形式施用于所述動(dòng)物時(shí)，能夠誘導(dǎo)在動(dòng)物中形成抗NGF抗體。最優(yōu)選的 是當(dāng)以免疫原性偶聯(lián)物的形式、優(yōu)選地以含有噬菌體Q0的VLP的偶聯(lián)物的形式施用于所 述動(dòng)物時(shí)能夠誘導(dǎo)在動(dòng)物中形成抗NGF抗體的NGF蛋白，其中所述抗NGF抗體在體外和/ 或體內(nèi)試驗(yàn)中能夠中和NGF蛋白的生物活性，優(yōu)選地如本文所述(參見實(shí)施例9至12和 15)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，典型且優(yōu)選地，用含有特定物種的NGF蛋白的本發(fā)明組合 物誘導(dǎo)的抗體能夠特異性結(jié)合和/或中和所述物種的NGF蛋白。NGF片段本文使用的術(shù)語“NGF片段”包括包含、基本由或者可替代地或優(yōu)選地 由NGF蛋白的至少8個(gè)，優(yōu)選地至少12個(gè)，更優(yōu)選地至少20個(gè)，更優(yōu)選地至少30個(gè)相鄰氨 基酸組成的任何多肽，以及包含、基本由或者可替代地或優(yōu)選地由本文定義的NGF蛋白的 最多60個(gè)，更優(yōu)選地最多50個(gè)，更優(yōu)選地最多45個(gè)，更優(yōu)選地最多40個(gè)相鄰氨基酸組成的 相同的多肽，以及與它們具有高于70 %，更優(yōu)選地高于80 %，更優(yōu)選地高于90 %，甚至更優(yōu) 選地高于95%的氨基酸序列同一性的任何多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述NGF片段包 含、基本由或優(yōu)選地由選自以下的多肽組成(a)由本文定義的NGF蛋白(優(yōu)選SEQ ID NO 22)的8-60個(gè)、優(yōu)選12-60個(gè)、更優(yōu)選20-60個(gè)、更優(yōu)選30-60個(gè)相鄰氨基酸組成的多肽，和(b)具有與(a)的多肽高于70%、優(yōu)選地高于80%、更優(yōu)選地高于90%、甚至更優(yōu)選地高 于95%的氨基酸序列同一性的多肽。優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語“NGF片段”包括包含、基本 由或可替代地或優(yōu)選地由SEQ ID NO :22的NGF蛋白的至少12個(gè)相鄰氨基酸組成的任何多 肽，以及包含、基本由或可替代地或優(yōu)選地由SEQ ID NO :22的NGF蛋白的最多45個(gè)，更優(yōu) 選地最多40個(gè)相鄰氨基酸組成的相同的多肽。本文使用的術(shù)語“NGF片段”應(yīng)當(dāng)還包括翻 譯后修飾，包括但不限于如本文定義的NGF片段的糖基化、乙酰化、磷酸化。NGF片段一般但 不是必須包含生物活性，優(yōu)選地在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中。典型且優(yōu)選地，所述NGF片段被單克隆 和/或多克隆抗NGFii抗體特異性結(jié)合。此外，可用于本發(fā)明的目的的NGF片段典型且優(yōu) 選地當(dāng)以免疫原性偶聯(lián)物的形式，優(yōu)選地以含有噬菌體Q0的VLP的偶聯(lián)物的形式施用于 所述動(dòng)物時(shí)，能夠誘導(dǎo)在動(dòng)物中形成抗NGF抗體。最優(yōu)選的是當(dāng)以免疫原性偶聯(lián)物的形式， 優(yōu)選地以含有噬菌體Q β的VLP的偶聯(lián)物的形式施用于所述動(dòng)物時(shí)能夠誘導(dǎo)在動(dòng)物中形成 抗NGF抗體的NGF片段，其中所述抗NGF抗體在體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)中能夠中和NGF蛋白 的生物活性，優(yōu)選地如本文所述(參見實(shí)施例9至12和15)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白， 典型且優(yōu)選地，用含有特定物種的NGF片段的本發(fā)明組合物誘導(dǎo)的抗體能夠特異性結(jié)合和 /或中和所述物種的NGF蛋白。NGF突變蛋白本文使用的術(shù)語“NGF突變蛋白，，包括包含或可替代地或優(yōu)選地由 突變的氨基酸序列組成的任何多肽，其中將要突變的氨基酸序列是NGF蛋白，優(yōu)選人NGF蛋 白，最優(yōu)選SEQ ID NO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序列在至少一個(gè)且最多20個(gè)、 優(yōu)選地至少一個(gè)且最多10個(gè)、更優(yōu)選地至少一個(gè)且最多5個(gè)位置處加以改變，其中所述位 置中的氨基酸殘基通過置換、缺失、插入或其任何組合改變。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述NGF突變蛋白是突變的氨基酸序列，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ ID NO 22, 并且其中所述將要突變的氨基酸序列在至少一個(gè)且最多4個(gè)位置處通過置換、缺失或其任 何組合加以改變，其中優(yōu)選地所述位置處的氨基酸殘基通過置換進(jìn)行改變。典型地，但不是 必須地，所述NGF突變蛋白被單克隆和/或多克隆抗NGFii抗體特異性結(jié)合。NGF突變蛋白 包括與所述將要突變的氨基酸序列相比降低的生物活性。最優(yōu)選地，所述NGF突變蛋白不 包括可檢測到的生物活性。此外，可用于本發(fā)明的目的的NGF突變蛋白典型且優(yōu)選地當(dāng)以 免疫原性偶聯(lián)物的形式，優(yōu)選地以含有噬菌體Q β的VLP的偶聯(lián)物的形式施用于所述動(dòng)物 時(shí)，能夠誘導(dǎo)在動(dòng)物中形成抗NGF抗體。最優(yōu)選的是當(dāng)以免疫原性偶聯(lián)物的形式，優(yōu)選地以 含有噬菌體Q β的VLP的偶聯(lián)物的形式施用于所述動(dòng)物時(shí)能夠誘導(dǎo)在動(dòng)物中形成抗NGF抗 體的NGF突變蛋白，其中所述抗NGF抗體在體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)中能夠中和NGF蛋白的生 物活性，優(yōu)選地如本文所述(參見實(shí)施例9至12)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，典型且優(yōu)選 地，用含有NGF突變蛋白的本發(fā)明組合物誘導(dǎo)的抗體(其中所述將要突變的氨基酸序列是 特定物種的序列)能夠特異性結(jié)合和/或中和所述物種的NGF蛋白。在本申請(qǐng)中，抗體(優(yōu)選單克隆抗體或多克隆抗體)與抗原的特異性結(jié)合是指特 征為親和力(Ka)為IO6M4或更高，優(yōu)選IO7M4或更高，更優(yōu)選IO8M4或更高，最優(yōu)選IO9M4 或更高的結(jié)合?？贵w的親和力可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地測定(例如，通過Scatchard 分析、基于Biacore或基于ELISA的方法)。最優(yōu)選地，單克隆和/或多克隆抗NGF抗體與 NGF抗原的特異性結(jié)合通過ELISA進(jìn)行測定，最優(yōu)選地在基本如本申請(qǐng)實(shí)施例5所述的條件 下測定。
生物活性本文使用的術(shù)語“生物活性”是指細(xì)胞增殖試驗(yàn)中抗原的活性，優(yōu)選 NGF抗原的活性，最優(yōu)選NGF蛋白、NGF片段和/或NGF突變蛋白的活性，其中優(yōu)選地所述細(xì) 胞增殖試驗(yàn)是基于NGF依賴的人紅白血病(erythr0leukemiC)TF-l細(xì)胞系，其中更進(jìn)一步 優(yōu)選地所述細(xì)胞增殖試驗(yàn)是在基本如本申請(qǐng)實(shí)施例6所述的條件下進(jìn)行的。如果NGF抗原 能夠誘導(dǎo)可檢測水平的細(xì)胞增殖，則認(rèn)為它具有生物活性。典型且優(yōu)選地，如果NGF抗原能 夠誘導(dǎo)使用適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到的最大增殖的至少20%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少80%的細(xì)胞 增殖，則NGF抗原具有生物活性。如果NGF抗原(優(yōu)選NGF突變蛋白)不誘導(dǎo)可檢測水平 的細(xì)胞增殖，則它不具有生物活性。典型且優(yōu)選地，如果NGF抗原誘導(dǎo)使用適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到的 最大增殖的最多20%、優(yōu)選最多15%、更優(yōu)選最多10%、更優(yōu)選最多5%的細(xì)胞增殖，則它 不具有生物活性。如果NGF突變蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖與包含所述將要突變的氨基酸序列的 多肽相比低于100 %、優(yōu)選低于80 %、更優(yōu)選低于60 %、更優(yōu)選低于40 %、更優(yōu)選低于20 %， 則認(rèn)為該NGF突變蛋白具有降低的生物活性。在本發(fā)明上下文中，NGF抗原，特別是NGF蛋白、NGF片段和NGF突變蛋白，如果當(dāng) 以免疫原性偶聯(lián)物的形式施用于測試動(dòng)物時(shí)誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，其中在所述抗體應(yīng)答中產(chǎn)生的 抗體特異性結(jié)合所述NGF抗原，則被認(rèn)為“能夠誘導(dǎo)抗體”。典型且優(yōu)選地，所述NGF蛋白以 包含病毒樣顆粒的偶聯(lián)物的形式，最優(yōu)選地以包含RNA噬菌體Qβ的病毒樣顆粒的偶聯(lián)物 的形式施用于所述測試動(dòng)物。最優(yōu)選地，所述NGF抗原以本文公開的組合物、疫苗組合物或 藥物組合物的形式施用于所述測試動(dòng)物。非常優(yōu)選地，NGF抗原誘導(dǎo)抗體的能力在基本如 實(shí)施例8所述的條件下檢測。在本發(fā)明上下文中，如果NGF抗原，特別是NGF蛋白、NGF片段和NGF突變蛋白，當(dāng) 以免疫原性偶聯(lián)物的形式施用于測試動(dòng)物時(shí)誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，其中所述抗體應(yīng)答產(chǎn)生的抗體 能夠中和NGF蛋白，則被認(rèn)為“能夠誘導(dǎo)中和抗體”?？贵w中和NGF蛋白的能力在使用細(xì)胞增 殖試驗(yàn)的體外分析中進(jìn)行測定，其中優(yōu)選地所述細(xì)胞增殖試驗(yàn)是基于NGF依賴的人紅白血 病TF-I細(xì)胞系，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述細(xì)胞增殖試驗(yàn)在基本如本申請(qǐng)實(shí)施例6和9所述的 條件下進(jìn)行。當(dāng)一種抗體在所述細(xì)胞增殖試驗(yàn)中降低或消除所述NGF蛋白的生物活性時(shí)， 認(rèn)為該抗體能夠中和NGF蛋白。可替代地，抗體中和NGF蛋白的能力在體內(nèi)試驗(yàn)中測定，優(yōu) 選地在疼痛動(dòng)物模型中測定，其中所述抗體中和NGF蛋白的能力最終被檢測為所述動(dòng)物模 型中疼痛的好轉(zhuǎn)。優(yōu)選的疼痛動(dòng)物模型是在小鼠中用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、小鼠中用酵母聚 糖A誘導(dǎo)的炎性痛、紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛，其中優(yōu)選地所述試驗(yàn)基本在如實(shí)施例10、11 或15中公開的條件下進(jìn)行。有序且重復(fù)的抗原陣列本文所用的術(shù)語“有序且重復(fù)的抗原陣列”通常是指抗原 的重復(fù)模式，或者其特征在于抗原相對(duì)于病毒樣顆粒的空間排列具有典型且優(yōu)選地高度的 均一性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這種重復(fù)模式可以是幾何模式。本發(fā)明的某些實(shí)施 方案，例如RNA噬菌體的VLP，是合適的有序且重復(fù)的抗原陣列的典型且優(yōu)選的實(shí)例，其具 有嚴(yán)格重復(fù)的類晶體抗原排列，優(yōu)選間隔1-30納米，優(yōu)選2-15納米，更優(yōu)選2-10納米，更 優(yōu)選2-8納米，進(jìn)一步更優(yōu)選1. 6-7納米。多肽本文所用的術(shù)語“多肽”是指由單體(氨基酸)通過酰胺鍵(也稱為肽鍵) 線性連接組成的分子。它是指氨基酸分子鏈，而不是指特定長度的產(chǎn)物。因此，多肽的定義 內(nèi)包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白質(zhì)。該術(shù)語也包括多肽的翻譯后修飾，例如.糖基化、乙酰化、磷酸化等。多肽的氨基酸序列同一性可以使用諸如Bestfit程序等已知計(jì)算機(jī)程序常規(guī)確 定。當(dāng)使用Bestfit或其它任何序列比對(duì)程序，優(yōu)選使用Bestfit來確定一種特定序列與 參照氨基酸序列是否例如95%相同時(shí)，將參數(shù)設(shè)置為使得在參照氨基酸序列的全長上計(jì)算 同一性百分比，并且允許最多占參照序列中氨基酸殘基總數(shù)的5%的同源性缺口。上述確定 多肽之間百分同一性的方法適用于本發(fā)明公開的所有蛋白質(zhì)、多肽或其片段。如技術(shù)人員所理解的，保守氨基酸置換包括電子等排置換，即其中氨基酸的帶電、 極性、芳香族、脂肪族或疏水性質(zhì)得以保持的置換。典型的保守氨基酸置換是下組之一內(nèi)的 氨基酸之間的置換(a)Gly,Ala ；Val，Ile 和 Leu ； (b)Asp,Glu ；Asn,Gln ；Ser,Thr,Cys ；Lys 禾口 Arg ；禾口(c) Phe 禾口 Tyr。病毒顆粒在此使用的術(shù)語“病毒顆粒”是指病毒的形態(tài)學(xué)形式。在某些病毒類型 中，它包含由蛋白質(zhì)衣殼圍繞的基因組；另外一些具有額外的結(jié)構(gòu)(例如被膜、尾等)。病毒樣顆粒(VLP)在此使用的病毒樣顆粒是指非復(fù)制性或非傳染性的，優(yōu)選非 復(fù)制性且非傳染性的病毒顆粒，或者非復(fù)制性或非傳染性的，優(yōu)選非復(fù)制性且非傳染性的 類似于病毒顆粒(優(yōu)選病毒衣殼)的結(jié)構(gòu)。這里使用的術(shù)語“非復(fù)制性”是指不能復(fù)制VLP 所含的基因組。這里使用的術(shù)語“非傳染性”是指不能進(jìn)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的病 毒樣顆粒是非復(fù)制性和/或非傳染性的，因?yàn)樗捎谖锢?、化學(xué)滅活或者由于遺傳操作而 缺乏全部或部分的病毒基因組或基因組功能。典型且優(yōu)選地，病毒樣顆粒缺少病毒基因組 的全部或部分復(fù)制性和傳染性部分。本發(fā)明的病毒樣顆?？赡芎信c其基因組不同的核 酸。本發(fā)明的病毒樣顆粒的一個(gè)典型且優(yōu)選的實(shí)施方案是病毒衣殼，如相應(yīng)病毒、噬菌體 (優(yōu)選RNA噬菌體)的病毒衣殼。術(shù)語“病毒衣殼”或“衣殼”是指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組 成的大分子裝配體。典型地，有60、120、180、240、300、360個(gè)和360個(gè)以上的病毒蛋白亞單 位。一般且優(yōu)選地，這些亞單位的相互作用導(dǎo)致形成具有固有重復(fù)組織的病毒衣殼或病毒 衣殼樣結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)一般是球形或管狀。重組VLP 本文使用的術(shù)語“重組VLP”是指通過包括重組DNA技術(shù)的至少一個(gè)步 驟的方法獲得的VLP。包裝的本文所用的術(shù)語“包裝的”是指聚陰離子大分子相對(duì)于VLP的狀態(tài)。本 文所用的術(shù)語“包裝”包括結(jié)合，該結(jié)合可以是共價(jià)的，例如通過化學(xué)偶聯(lián)，也可以是非共價(jià) 的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語“包裝的”是 指聚陰離子大分子被VLP包封或部分包封。因此，聚陰離子大分子可以被VLP包封，而不需 存在實(shí)際上的結(jié)合，特別是共價(jià)結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種聚陰離子大分子被包 裝在VLP內(nèi)，最優(yōu)選地以非共價(jià)的方式包裝。將聚陰離子大分子如聚谷氨酸包裝于VLP內(nèi)、 特別是RNA噬菌體的VLP內(nèi)的方法在W02006/037787中公開。特別參考W02006/037787的 實(shí)施例4。聚陰離子大分子本文所用的術(shù)語“聚陰離子大分子”是指包含重復(fù)負(fù)電荷基團(tuán)的 高相對(duì)分子量的分子，其結(jié)構(gòu)基本包括實(shí)際上或概念上來源于低相對(duì)分子量的分子的多個(gè) 重復(fù)單位。本文所用的術(shù)語“聚陰離子大分子”典型且優(yōu)選地指不能活化toll-樣受體的分 子。因此術(shù)語“聚陰離子大分子”典型且優(yōu)選地不包括Toll-樣受體配體，不包括能夠誘導(dǎo) 和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)，如Toll-樣受體配體，能夠誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的核酸，和脂多糖(LPS)。更優(yōu)選地，本文所用的術(shù)語“聚陰離子大分子”是指不能誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn) 生的分子。優(yōu)選地，聚陰離子大分子是聚陰離子多肽或陰離子葡聚糖。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 案中，所述聚陰離子大分子是聚陰離子多肽，其中優(yōu)選地所述聚陰離子多肽選自(a)聚谷 氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d) (a)至(c)的任意化學(xué)修飾。化學(xué)修飾的例 子包括但不限于糖基化、乙?；土姿峄?。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚陰離子大分 子是陰離子葡聚糖，所述陰離子葡聚糖選自(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙 基葡聚糖；(d)磺酸甲酯葡聚糖(methyl sulfonatedextran)；和(e)磷酸葡聚糖。聚天冬氨酸本文使用的術(shù)語“聚天冬氨酸”應(yīng)當(dāng)是指一種多肽，在所述多肽包含 的氨基酸總數(shù)中包含至少50%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選 至少99%，更優(yōu)選100%的天冬氨酸殘基。所述多肽的天冬氨酸殘基因此是全L-、全D-或 L-和D-天冬氨酸的混合物。最優(yōu)選地，所述多肽只包含L-天冬氨酸殘基。聚谷氨酸本文使用的術(shù)語“聚谷氨酸”是指一種多肽，在所述多肽包含的氨基 酸總數(shù)中包含至少50 %，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少 99 %，最優(yōu)選100 %的谷氨酸殘基。所述多肽的谷氨酸殘基因此是全L-、全D-或L-和D-天 冬氨酸的混合物。最優(yōu)選地，所述多肽只包含L-谷氨酸殘基。聚(GluAsp)本文使用的術(shù)語“聚(GluAsp)”是指一種多肽，在所述多肽包含的氨 基酸總數(shù)中包含至少50 %，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少 99 %，最優(yōu)選100 %的谷氨酸殘基和天冬氨酸殘基。所述谷氨酸分子和天冬氨酸分子因此是 全L-、全D-或其混合物。最優(yōu)選地，所述多肽只包含L-谷氨酸殘基和L-天冬氨酸殘基。疼痛疼痛起因于疼痛感受器的刺激(傷害性疼痛)，例如由于損傷，或者是由 神經(jīng)系統(tǒng)的障礙引起的，導(dǎo)致疼痛信號(hào)被傳送到大腦，而沒有明顯的物理原因(神經(jīng)性疼 痛)。疼痛包括，例如，骨關(guān)節(jié)痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎痛、癌癥痛、內(nèi)臟痛、慢性腰背痛和慢性頭 痛、纖維肌痛、糖尿病神經(jīng)病變、幻肢痛和皰疹后神經(jīng)痛。傷害性疼痛本文使用的術(shù)語“傷害性疼痛”是指由疼痛感受器的刺激引起的疼 痛，該刺激是由于損傷、手術(shù)或影響組織的疾病，如關(guān)節(jié)炎和癌癥。傷害性疼痛也包括慢性 疼痛。優(yōu)選的傷害性疼痛類型是骨關(guān)節(jié)痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎痛、癌癥痛、內(nèi)臟痛、慢性腰背痛 和慢性頭痛。神經(jīng)性疼痛本文使用的術(shù)語“神經(jīng)性疼痛”是指神經(jīng)系統(tǒng)的障礙引起的疼痛，導(dǎo) 致疼痛信號(hào)被傳送到大腦，而沒有明顯的物理原因，如糖尿病神經(jīng)病變、幻肢痛和皰疹后神經(jīng)痛。病毒顆粒和病毒樣顆粒的一個(gè)共同特征是其高度有序且重復(fù)的亞單位排列。RNA噬菌體的病毒樣顆粒本文使用的術(shù)語“RNA噬菌體的病毒樣顆?！笔侵赴?RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段或者優(yōu)選地基本由其組成或者由其組成的病毒樣 顆粒。另外，RNA噬菌體的病毒樣顆粒類似于RNA噬菌體的結(jié)構(gòu)。此外，RNA噬菌體的病毒 樣顆粒是非復(fù)制性和非傳染性的。典型且優(yōu)選地，術(shù)語“RNA噬菌體的病毒樣顆?！边M(jìn)一步 指RNA噬菌體的病毒樣顆粒，該RNA噬菌體缺少編碼RNA噬菌體的復(fù)制機(jī)制的至少一個(gè)基 因，優(yōu)選缺少所有基因，典型且進(jìn)一步優(yōu)選地，甚至缺少編碼負(fù)責(zé)病毒附著或進(jìn)入宿主的一 種或多種蛋白質(zhì)的至少一個(gè)基因，優(yōu)選缺少所有基因。然而，該定義應(yīng)當(dāng)也包括上述一種或 多種基因仍然存在但是無活性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒，因此產(chǎn)生非復(fù)制性和非傳染性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒。在其最廣的定義中，術(shù)語“RNA噬菌體的病毒樣顆?！币虼艘?包括RNA噬菌體的病毒樣顆粒，其基因組已通過物理或化學(xué)或遺傳方法滅活，使得該病毒 顆粒是非復(fù)制性和/或非傳染性的。優(yōu)選的RNA噬菌體的VLP顯示二十面體對(duì)稱，并且由 180個(gè)亞單位組成。一種或一個(gè)術(shù)語“一種”或“一個(gè)”在本申請(qǐng)中使用時(shí)，除非另外說明，是指“至少 一種(個(gè))”或“一種(個(gè))或一種(個(gè))以上”。本發(fā)明提供用于增強(qiáng)動(dòng)物或人體中對(duì)NGF的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明的 組合物包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個(gè)第 二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是NGF抗原，并且其中(a)和(b)通過 所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。優(yōu)選地，NGF抗原與VLP連 接，從而形成有序且重復(fù)的抗原-VLP陣列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，至少20個(gè)，優(yōu)選 至少30個(gè)，更優(yōu)選至少60個(gè)，更優(yōu)選至少120個(gè)，最優(yōu)選至少180個(gè)NGF抗原與VLP連接?？梢赃x擇本領(lǐng)域公知的任何具有有序且重復(fù)的結(jié)構(gòu)的病毒作為本發(fā)明的VLP。其 外殼蛋白能夠用于制備VLP的示例性的DNA或RNA病毒已經(jīng)在WO 2004/009124的第25頁 第10-21行，第26頁的第11-28行，和第28頁的第4行到第31頁的第4行公開。這些公 開的內(nèi)容通過參考在此引入。病毒或病毒樣顆?？梢詮牟《靖腥镜募?xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)和純化。為了接種的目 的，獲得的病毒或病毒樣顆粒需要不含毒力。除了遺傳工程以外，可以使用化學(xué)或物理方法 滅活病毒基因組功能，例如紫外線照射、甲醛處理。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP是一種重組VLP。幾乎所有公知的病毒都已經(jīng)被測 序，并且可以容易地被公眾獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定編碼外殼蛋白的基因。通 過在宿主中重組表達(dá)外殼蛋白來制備VLP是本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含選自下組的病毒的重組蛋白、其突變 體或片段或者由其組成a)RNA噬菌體；b)噬菌體；c)乙型肝炎病毒，優(yōu)選其外殼蛋白 (Ulrich 等人，Virus Res. 50 :141_182 (1998))或其表面蛋白(W0 92/11291) ；d)麻疹病毒 (Warnes 等人，Genel60 173-178 (1995)) ；e)辛德畢斯病毒；f)輪狀病毒(US 5，071，651 和 US 5, 374, 426) ；g) 口蹄疫病毒(Twomey 等人，Vaccine 13 :1603_1610，(1995))； h)諾瓦克病毒(Jiang, X.等人，Science 250:1580-1583(1990) ；Matsui，S. M.等人， J. Clin. Invest. 87 1456-1461 (1991)) ；i)甲病毒；j)逆轉(zhuǎn)錄病毒，優(yōu)選其 GAG 蛋白(W0 96/30523) ；k)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty，優(yōu)選蛋白pi ；1)人乳頭瘤病毒(W0 98/15631) ；m)多瘤病 毒；η)煙草花葉病毒；和ο)禽獸棚病毒。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP包含重組蛋白、其突變體或片段的一種以上的氨基酸 序列(優(yōu)選兩種氨基酸序列)或者由該氨基酸序列組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案 中，VLP包含至少一個(gè)第一多肽和至少一個(gè)第二多肽或者由這些多肽組成，其中所述第一多 肽和所述第二多肽包含外殼蛋白或其突變體或片段的氨基酸序列，其中所述第一多肽和所 述第二多肽的氨基酸序列不同。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一多肽包含第一 外殼蛋白或其突變體或片段的氨基酸序列，所述第二多肽包含第二外殼蛋白或其突變體或 片段的氨基酸序列，其中所述第一外殼蛋白和所述第二外殼蛋白是相同病毒的外殼蛋白， 并且其中優(yōu)選地所述病毒是RNA噬菌體。包含一種以上的多肽種類或由其組成的VLP被稱為嵌合VLP。本文使用的術(shù)語“重組蛋白的片段”或術(shù)語“外殼蛋白的片段”被定義為分別為野 生型重組蛋白或外殼蛋白長度的至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少 95%，并且優(yōu)選地保留形成VLP的能力的多肽。優(yōu)選地，該片段通過至少一個(gè)內(nèi)部缺失、至 少一個(gè)截短或至少一個(gè)其組合而獲得。進(jìn)一步優(yōu)選地，該片段通過最多5、4、3或2個(gè)內(nèi)部 缺失、最多2個(gè)截短或恰好一個(gè)其組合而獲得。術(shù)語“重組蛋白的片段”或術(shù)語“外殼蛋白的片段”還包括與以上定義的“重組蛋 白的片段”或“外殼蛋白的片段”分別具有至少80 %，優(yōu)選90 %，最優(yōu)選95 %的氨基酸序列 同一性并且優(yōu)選地能夠裝配為病毒樣顆粒的多肽。在本發(fā)明中可以交換使用的術(shù)語“突變重組蛋白”或術(shù)語“重組蛋白突變體”，或者 在本發(fā)明中可以交換使用的術(shù)語“突變外殼蛋白”或術(shù)語“外殼蛋白突變體”，分別是指具有 來源于野生型重組蛋白或外殼蛋白的氨基酸序列的多肽，其中該氨基酸序列與野生型序列 至少80 %，優(yōu)選至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少97 %或至少99 %相同，并且其中優(yōu)選 地所述多肽保留裝配為VLP的能力。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒是乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒。 乙型肝炎病毒樣顆粒的制備尤其在W000/32227、W001/85208和W002/056905中公開，所 有三篇文獻(xiàn)都通過參考引入本文。適合在本發(fā)明的實(shí)施中使用的HBcAg的其他變體在 W001/056905中，特別是在其中的第34-39頁公開。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將賴氨酸殘基導(dǎo)入HBcAg多肽中，來介導(dǎo) NGF抗原與HBcAg的VLP的連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用包含、或由SEQ ID NO 20的氨 基酸1-144、或1-149、1-185組成的HBcAg制備本發(fā)明的VLP和組合物，其中該氨基酸被修 飾使得第79和80位的氨基酸被替代為具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽。這個(gè) 修飾將SEQ ID N0:20改變?yōu)镾EQ ID N0:21。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO 21 的第48和110位的半胱氨酸殘基，或其相應(yīng)片段，優(yōu)選1-144或1-149，被突變?yōu)榻z氨酸。 本發(fā)明進(jìn)一步包括包含具有上述相應(yīng)氨基酸改變的乙型肝炎核心蛋白突變體的組合物。本 發(fā)明進(jìn)一步包括分別包含HBcAg多肽的組合物和疫苗，該HBcAg多肽包含與SEQ ID NO 21 至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列，或由該氨基酸序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，其中 優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自a)噬菌體Q β ；b)噬菌體R17 ；c)噬菌體fr ；d)噬菌體GA ；e) 噬菌體SP ；f)噬菌體MS2 ；g)噬菌體Mll ；h)噬菌體MXl ；i)噬菌體NL95 ；k)噬菌體f2 ；1) 噬菌體PP7 ；和m)噬菌體AP205。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒是RNA噬 菌體Q β的病毒樣顆粒。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含、基本由、或者由RNA噬菌體的 重組外殼蛋白、其突變體或片段組成，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自a)噬菌體Qi3 ；b) 噬菌體R17 ；c)噬菌體fr ；d)噬菌體GA ；e)噬菌體SP ；f)噬菌體MS2 ；g)噬菌體Mll ；h)噬 菌體MXl ；i)噬菌體NL95 ；k)噬菌體f2 ；1)噬菌體PP7 ；和m)噬菌體AP205。在進(jìn)一步優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌體的重組外殼蛋白、 其突變體或片段組成，其中所述RNA噬菌體選自Qi3、fr、AP205或GA。在一個(gè)非常優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含、基本由、或者由RNA噬菌體Qi3的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突 變體或片段，其中優(yōu)選地所述外殼蛋白包含選自以下序列的氨基酸序列或者優(yōu)選地由該氨 基酸序列組成(a) SEQ IDNO 1 ；涉及 Q β CP ； (b) SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的混合物 (涉及 Q β Al 蛋白)；(c) SEQ ID NO 3 ； (d) SEQ ID NO 4 ； (e) SEQ IDNO 5 ； (f) SEQ ID NO 6 ； (g) SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的混合物；(h) SEQ ID NO 8 ； (i) SEQ ID NO 9 ； (j) SEQ ID NO 10 ； (k) SEQID NO: 11; (I)SEQ ID NO 12 ； (m) SEQ ID NO 13 ； (n) SEQ IDNO 14 ； (ο) SEQ ID NO 40 ； (p) SEQ ID NO 41 ；禾口(q) SEQ IDNO :42。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌 體的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包 含、或者基本由、或者由RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。其中所述外殼 蛋白包含或者優(yōu)選地由選自以下序列的氨基酸序列組成(a) SEQ IDNO 1 ；涉及Qi3 CP ； (b) SEQ ID NO: IfPSEQ ID NO 2 的混合物(涉及 Q β Al 蛋白)；(c) SEQ ID NO 3 ； (d) SEQ ID NO 4 ； (e) SEQ IDNO 5 ； (f) SEQ ID NO 6 ； (g) SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的混合物；(h) SEQ ID NO 8 ；⑴ SEQ ID NO 9 ； (j)SEQ ID NO 10 ； (k) SEQID NO 11 ； (I)SEQ ID NO 12 ； (m) SEQ ID NO 13 ； (n) SEQ IDNO 14 ； (ο) SEQ ID NO 40 ； (p) SEQ ID NO 41 ；禾口(q) SEQ IDNO 42。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含重組外殼蛋白、或者基本由、或 者由重組外殼蛋白組成，其中所述重組外殼蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO :1或者優(yōu)選地 由該序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP是嵌合VLP，包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其 突變體或片段的一種以上的氨基酸序列(優(yōu)選兩種氨基酸序列)或者由該序列組成。在一 個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP包含RNA噬菌體的兩種不同的外殼蛋白或者由該外殼蛋白 組成，其中所述兩種外殼蛋白分別包含SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2，或SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或者優(yōu)選地該氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述VLP是RNA噬菌體Q β的VLP。Q β的衣殼或病毒 樣顆粒顯示為二十面體噬菌體樣衣殼結(jié)構(gòu)，直徑25nm，T = 3半對(duì)稱。該衣殼含有180個(gè) 拷貝的外殼蛋白，它們通過二硫鍵連接為共價(jià)五聚體和六聚體(Golmohammadi R.等人， Structure4 :543-5554(1996))，使Qi3衣殼具有顯著的穩(wěn)定性。然而，由重組Q3外殼蛋 白構(gòu)成的衣殼或VLP可能含有不通過二硫鍵與衣殼內(nèi)的其它亞單位連接的或不完全連接 的亞單位。Q β的衣殼或VLP顯示對(duì)有機(jī)溶劑和變性劑具有不平常的抗性。我們驚奇地發(fā) 現(xiàn)，高至30%的DMSO和乙腈濃度和高至IM的胍鹽濃度不影響衣殼的穩(wěn)定性。Qi3的衣殼 或VLP的高穩(wěn)定性是一個(gè)有利的特征，特別是對(duì)于根據(jù)本發(fā)明免疫和接種哺乳動(dòng)物和人的 用途而言。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的RNA噬菌體的病毒樣顆粒，特別是RNA噬菌體Q β和RNA 噬菌體fr的病毒樣顆粒，已經(jīng)在W002/056905中公開，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。具 體地，W002/056905的實(shí)施例18給出了制備RNA噬菌體Q β的VLP的詳細(xì)描述。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述VLP是RNA噬菌體ΑΡ205的VLP。在本發(fā)明的實(shí)踐 中也可以使用AP205VLP的能夠裝配的突變形式，包括氨基酸第5位的脯氨酸被置換為蘇氨 酸的ΑΡ205外殼蛋白，或氨基酸第14位的天冬酰胺被置換為天冬氨酸的ΑΡ205外殼蛋白，導(dǎo)致本發(fā)明的其他優(yōu)選的實(shí)施方案。W02004/007538，特別是在實(shí)施例1和實(shí)施例2中，描 述了如何獲得包含AP205外殼蛋白的VLP，以及特別是其表達(dá)和純化。W02004/007538在此 引入作為參考。AP205VLP具有高度免疫原性，并且能夠與抗原連接，以典型且優(yōu)選地產(chǎn)生以 定向和重復(fù)方式展示抗原的疫苗構(gòu)建體。產(chǎn)生了針對(duì)這樣展示的抗原的高抗體效價(jià)，這表 明連接的抗原能夠與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞相互作用，典型且優(yōu)選地與B細(xì)胞相互作用，并且因 此具有免疫原性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述VLP包含病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的突 變外殼蛋白或者由該突變外殼蛋白組成，其中通過置換和/或通過刪除而除去至少一個(gè)賴 氨酸殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP包含病毒 (優(yōu)選RNA噬菌體)的突變外殼蛋白或者由該突變外殼蛋白組成，其中通過置換和/或通過 插入而添加至少一個(gè)賴氨酸殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。至少一個(gè)賴氨酸殘基的缺 失、置換或添加可以改變偶聯(lián)程度，即允許改變VLP每個(gè)亞單位上，優(yōu)選RNA噬菌體的VLP 的每個(gè)亞單位上抗原的量。因此，可以滿足設(shè)計(jì)特定疫苗的要求。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和疫苗具有0. 5到4. 0的抗原密度。 本文使用的術(shù)語“抗原密度”是指VLP每個(gè)亞單位上，優(yōu)選RNA噬菌體的VLP的每個(gè)亞單位 上，優(yōu)選每個(gè)外殼蛋白上連接的抗原分子的平均數(shù)。因此，該值可以計(jì)算為在本發(fā)明的組合 物或疫苗中所述VLP的所有亞單位上，優(yōu)選RNA噬菌體的所述VLP的所有亞單位上的平均 數(shù)。 Q β外殼蛋白的VLP或衣殼在它們的表面展示數(shù)目確定的賴氨酸殘基，具有3個(gè)賴 氨酸殘基指向衣殼內(nèi)部并與RNA相互作用，而另外4個(gè)賴氨酸殘基暴露于衣殼外部的確定 的拓?fù)鋵W(xué)。優(yōu)選地，至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基，指向或位于VLP的外部。更優(yōu)選 地，至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)是指向或位于VLP外部的賴氨酸殘基的氨基。在進(jìn)一步優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是RNA噬菌體Q β的外殼蛋白的賴氨酸殘基的氨基。在進(jìn) 一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是SEQ ID NO :1的賴氨酸殘基的氨基。在進(jìn)一 步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是SEQ ID Ν0:1第2、13、16、46、60、63和67位賴 氨酸殘基中任一個(gè)的氨基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)是暴露于衣殼 外部的任一個(gè)賴氨酸殘基的氨基。其中暴露的賴氨酸殘基被精氨酸置換的Q β突變體可以用于本發(fā)明。因此，在本 發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該病毒樣顆粒包含突變Qi3外殼蛋白、或者基本由或由突 變Q3外殼蛋白組成。優(yōu)選地，這些突變外殼蛋白包含選自下組的氨基酸序列或由該序列 組成(a) Q β-240 (SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO : 1 的 Lysl3_Arg) ； (b) Q β -243 (SEQ ID NO: 16，SEQ ID NO 1 的 AsnlO-Lys) ； (c)Q β-250(SEQ ID NO:17，SEQ ID NO 1 的 Lys2_Arg)； (d) Q β-251 (SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO 1 的 Lysl6_Arg)；和(e) Q β -259 (SEQ ID NO :19， SEQ ID NO :1的Lys2-Arg，Lys 16_Arg)。上述突變外殼蛋白、突變外殼蛋白VLP 和衣殼的構(gòu)建、表達(dá)和純化分別在WO 02/056905中進(jìn)行了描述。特別是WO 02/056905的 實(shí)施例18。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含或者基本由或者由Qi3的突 變外殼蛋白、或其突變體或片段和相應(yīng)的Al蛋白組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中， 病毒樣顆粒包含或者基本由或者由突變外殼蛋白和相應(yīng)的Al蛋白組成，其中所述突變外
17殼蛋白選自SEQ ID NO :15、16、17、18和19中的任一個(gè)。其它一些RNA噬菌體外殼蛋白在細(xì)菌宿主中表達(dá)時(shí)也顯示自裝配(Kastelein， RA.等人，Gene 23 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM.等人，Dokl. Akad. Nauk SSSR 287 452-455(1986), Adhin, MR.等人，Virologyl70 :238_242 (1989)，Priano, C.等人， J. Mol. Biol. 249 :283-297 (1995))。特別是已經(jīng)公開了 GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci. 5 2485-2493 (1996)，Tars，K 等人，J. Mol. Biol. 271 :759-773 (1997))和 fr (Pushko P.等人， Prot. Eng. 6 883-891 (1993), Liljas, L 等人· J Mol. Biol. 244 :279_290，(1994))的生物 學(xué)和生化性質(zhì)。幾種RNA噬菌體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4 543-554 (1996))。利用這些信息，能夠確定表面暴露的殘基，從而能夠修飾RNA噬菌體的 外殼蛋白，以便能夠通過插入或置換插入一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性氨基酸殘基。來源于RNA噬菌 體的VLP的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)诩?xì)菌中的高表達(dá)產(chǎn)量，這允許以可承受的成本產(chǎn)生大量的 物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF抗原是NGF蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF蛋白 選自(a)人NGF蛋白；(b)狗NGF蛋白；(c)貓NGF蛋白；(d)小鼠NGF蛋白，和(e)馬NGF 蛋白。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白是人或其它動(dòng)物的NGF，優(yōu)選哺乳動(dòng)物的 NGF，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述NGF蛋白選自SEQ ID NO :22_25和32-39中的任一個(gè)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF蛋白是人NGF。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，人 NGF包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :22所示的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組成，該氨基酸序列與SEQ ID NO :22至少 80 %，或優(yōu)選地至少85 %，更優(yōu)選地至少90 %，或最優(yōu)選地至少95 %相同。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組成，在該氨 基酸序列中，SEQ ID NO 22通過置換和/或缺失和/或插入或其組合改變了至少1個(gè)且最 多20個(gè)，優(yōu)選至少1個(gè)且最多10個(gè)，更優(yōu)選至少1個(gè)且最多5個(gè)氨基酸。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸序列組成， 其中將要突變的氨基酸序列是SEQ ID NO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序列在至少 1個(gè)且最多20個(gè)，優(yōu)選地在至少1個(gè)且最多10個(gè)、更優(yōu)選地至少1個(gè)且最多5個(gè)位置處發(fā) 生改變，其中所述位置的氨基酸殘基通過置換、缺失、插入或其任意組合發(fā)生改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組成，在該氨 基酸序列中，SEQ ID NO 22通過缺失改變至少1個(gè)且最多20個(gè)，優(yōu)選地最多10個(gè)、優(yōu)選地 最多5個(gè)氨基酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基 酸序列組成，在該氨基酸序列中，SEQ ID NO 22通過1、2或3個(gè)氨基酸缺失發(fā)生改變。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸序列組成， 其中將要突變的氨基酸序列是SEQ ID NO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序列中缺失 最多10、9、8、7、6、5或4個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者 優(yōu)選地由突變的氨基酸序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所 述將要突變的氨基酸序列中缺失3、2或優(yōu)選地1個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組成，其中 SEQ ID NO :22通過插入改變了至少1個(gè)且最多20個(gè)，優(yōu)選地至少1個(gè)且最多10個(gè)，更優(yōu) 選地至少1個(gè)且最多5個(gè)氨基酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組成，其中SEQ ID NO 22通過1、2或3個(gè)氨基酸插入發(fā)生改變。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸序列組成， 其中將要突變的氨基酸序列是SEQ ID NO :22，并且其中最多20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5或4個(gè)氨基酸殘基插入所述將要突變的氨基酸序列中。在一個(gè)非常優(yōu) 選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸序列組成，其中將要突變的氨基 酸序列是SEQ ID NO :22，并且其中3、2或優(yōu)選地1個(gè)氨基酸殘基插入所述將要突變的氨基 酸序列中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組成，其中 SEQ ID NO 22通過置換，優(yōu)選地通過保守置換，改變至少1個(gè)且最多20個(gè)，優(yōu)選地至少1個(gè) 且最多10個(gè)，更優(yōu)選地至少1個(gè)且最多5個(gè)氨基酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組 成，其中SEQ ID NO :22通過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸置換，優(yōu)選地通過保守置換 發(fā)生改變。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列 組成，其中SEQ ID NO 22通過1、2或3個(gè)氨基酸置換，優(yōu)選地通過保守置換發(fā)生改變。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸序列組成， 其中將要突變的氨基酸序列是SEQ ID NO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序列的最多 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4個(gè)氨基酸殘基通過氨基酸置換進(jìn)行 更換，其中優(yōu)選地所述氨基酸置換是保守氨基酸置換。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF 蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ ID NO 22，并且其中所述將要突變的氨基酸序列的3個(gè)、2個(gè)或優(yōu)選地1個(gè)氨基酸殘基通過氨基酸 置換進(jìn)行更換，其中優(yōu)選地所述氨基酸置換是保守氨基酸置換。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF蛋白是人NGF前體。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案 中，人NGF前體包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :23所示的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，NGF蛋白包含或者優(yōu)選地由一種氨基酸序列組成，該序列與SEQ ID NO :23至 少80 %，優(yōu)選地至少85 %，更優(yōu)選地至少90 %，最優(yōu)選地至少95 %相同。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF抗原是NGF片段，其中所述NGF片段包含或者可替 代地由至少一個(gè)表位組成。確定蛋白質(zhì)的表位的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。PCT/ EP2005/004980從第26頁第一段至第27頁第四段已經(jīng)詳述了一些這樣的方法，這些具體公 開內(nèi)容通過參考引入本文。應(yīng)當(dāng)指出，這些方法通常適用于其它多肽抗原，因此不限于PCT/ EP2005/004980 中公開的 IL_23pl9。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF抗原是NGF片段。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述NGF片段包含或者可替代地或優(yōu)選地由SEQ ID NO 22的人NGF的至少8個(gè)、優(yōu)選 地至少12個(gè)、更優(yōu)選地至少20個(gè)、更優(yōu)選地至少30個(gè)相鄰氨基酸組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述 NGF 片段由 SEQ ID NO 22 的 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)相鄰氨基酸組成，其中優(yōu)選地所述NGF片段由 SEQ ID NO 22的10個(gè)相鄰氨基酸組成，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述NGF片段由SEQ ID NO 22 的10個(gè)N末端氨基酸組成。因此，在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF片段由氨基酸 序列SEQ ID NO 44組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF抗原是NGF突變蛋白，其中優(yōu)選地所述NGF突變蛋白具有降低的生物活性，并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述NGF突變蛋白當(dāng)以免疫原性偶聯(lián)物的形 式施用于動(dòng)物時(shí)能夠誘導(dǎo)中和抗體。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白不 具有生物活性，并且所述NGF突變蛋白當(dāng)以免疫原性偶聯(lián)物的形式施用于動(dòng)物時(shí)能夠誘導(dǎo) 中和抗體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸 序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序 列在至少1個(gè)且最多9個(gè)，優(yōu)選地至少1個(gè)且最多3個(gè)，更優(yōu)選地至少1個(gè)且最多2個(gè)位置 處，最優(yōu)選地在恰好一個(gè)位置處發(fā)生改變，其中所述位置的氨基酸殘基通過置換或通過缺 失發(fā)生改變，最優(yōu)選地通過置換發(fā)生改變。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白由突變的氨基酸序列組成，其中 將要突變的氨基酸序列是SEQ ID NO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序列在至少1個(gè) 且最多9個(gè)位置處發(fā)生改變，其中所述位置的氨基酸殘基從SEQ ID NO :22中缺失，并且其 中優(yōu)選地所述缺失的氨基酸殘基選自SEQ ID NO :22的氨基酸殘基1-9，并且其中進(jìn)一步 優(yōu)選地所述缺失的氨基酸殘基選自SEQ ID NO 22的氨基酸殘基4H、5P、7F或8H中的任 一個(gè)(Kullander 等人 J Biol Chem, 1997. 272(14) :p. 9300-7 ；Woo, S. B.和 K. Ε· Neet J Biol Chem, 1996. 271(40) :ρ· 24433-41 ；和 Beglova，N.，等人 J Biol Chem, 1998. 273(37) p. 23652-8)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白由SEQID NO 45組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸 序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序 列在至少1個(gè)且最多3個(gè)，優(yōu)選地至少1個(gè)且最多2個(gè)，最優(yōu)選地恰好1個(gè)位置處發(fā)生改變， 其中所述位置的氨基酸殘基通過置換發(fā)生改變。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸 序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序 列在至少1個(gè)且最多3個(gè)，優(yōu)選地至少1個(gè)且最多2個(gè)，最優(yōu)選地恰好1個(gè)位置處發(fā)生改變， 其中所述位置的氨基酸殘基通過置換發(fā)生改變，其中置換的氨基酸殘基選自SEQ ID N0:22 的氨基酸殘基 4H、5P、7F 或 8H 中的任一個(gè)(Kullander 等人 J Biol Chem, 1997. 272(14) p. 9300-7 ；Woo, S. B.和 K. Ε· Neet J Biol Chem, 1996. 271(40) :ρ· 24433-41 ；和 Beglova， N.，等人J Biol Chem, 1998. 273(37) :p. 23652-8.)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述 NGF突變蛋白由SEQ ID NO :46_52中的任一個(gè)組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸 序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序 列在至少1個(gè)且最多3個(gè)，優(yōu)選地至少1個(gè)且最多2個(gè)，最優(yōu)選地恰好1個(gè)位置處發(fā)生改變， 其中所述位置的氨基酸殘基通過置換發(fā)生改變，其中置換的氨基酸殘基選自SEQ ID N0:22 的氨基酸殘基 43-45、48 和 49 中的任一個(gè)(Kullander 等人 J Biol Chem, 1997. 272(14) p. 9300-7 ；Beglova, N.，等人 J Biol Chem, 1998. 273 (37) :ρ· 23652-8，和 Xie, Y.，等人 J Biol Chem, 2000. 275(38) :ρ· 29868-74.)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋 白由SEQ ID NO 53-60中的任一個(gè)組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸 序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序
20列在至少1個(gè)且最多3個(gè)，優(yōu)選地至少1個(gè)且最多2個(gè)，最優(yōu)選地恰好1個(gè)位置處發(fā)生改變， 其中所述位置的氨基酸殘基通過置換發(fā)生改變，其中置換的氨基酸殘基選自SEQ ID N0:22 的氨基酸殘基 94G、95K 和 96Q 中的任一個(gè)(Kullander 等人 J Biol Chem, 1997. 272(14) p. 9300-7 ；Beglova, N.，等人 J Biol Chem, 1998. 273 (37) :ρ· 23652-8，和 Xie, Y.，等人 J BiolChem, 2000. 275(38) :ρ. 29868-74)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白 由SEQ ID NO 61-66中的任一個(gè)組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸 序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸 序列在恰好一個(gè)位置處通過置換發(fā)生改變，其中置換的氨基酸殘基選自氨基酸殘基75Η、 84H、100R、111V、112L、114R、115K、113S 中的任一個(gè)(Kullander，K.等人 J Biol Chem, 1997. 272 (14) :ρ· 9300-7 ；Larsson, E.等人 Neurobiol Dis, 2008，Kruttgen, A.，等人 J Biol Chem, 1997. 272(46) :p. 29222-8)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白 由SEQID NO 67-74中的任一個(gè)組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白包含或者優(yōu)選地由突變的氨基酸 序列組成，其中將要突變的氨基酸序列是SEQ IDNO :22，并且其中所述將要突變的氨基酸序 列在正好2個(gè)位置處發(fā)生改變，其中所述位置的氨基酸殘基通過置換發(fā)生改變，其中置換 的氨基酸殘基是 75H 和 84H(Kullander 等人.J Biol Chem, 1997. 272(14) :p. 9300-7)。在 一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NGF突變蛋白由SEQID NO :75組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含或者基本由或者由以下成分組成(a)具有 至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒；和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗 原，其中所述至少一種抗原是NGF抗原；并且其中(a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位 點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接，并且其中所述連接是通過至少一個(gè)肽鍵，優(yōu)選地只 通過肽鍵。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒和 所述至少一種抗原通過基因融合連接。編碼NGF抗原的基因符合讀框地內(nèi)部連接或者優(yōu)選 地連接至編碼VLP的外殼蛋白的基因的N端或C端。也可以通過將NGF抗原的序列插入部 分外殼蛋白序列已經(jīng)缺失的外殼蛋白突變體(其進(jìn)一步稱為截短突變體)中實(shí)現(xiàn)融合。截 短突變體可以具有外殼蛋白的部分序列的N末端或C末端缺失或者內(nèi)部缺失。該融合蛋白 優(yōu)選保留了在表達(dá)時(shí)裝配為VLP的能力，這可以通過電子顯微鏡進(jìn)行檢查?？上騈GF抗原中加入側(cè)翼氨基酸殘基來增加外殼蛋白和NGF抗原之間的距離。甘 氨酸和絲氨酸殘基是用于側(cè)翼序列的特別有利的氨基酸。這種側(cè)翼序列賦予融合構(gòu)建體額 外的柔性。這可減少外源序列融合進(jìn)入VLP亞單位序列時(shí)可能的去穩(wěn)定效應(yīng)，并且因此可 減少外源序列對(duì)VLP裝配的干擾。在其它實(shí)施方案中，NGF抗原能夠與大量其它病毒外殼蛋白融合，例如，與 Qβ的Al蛋白的截短形式的C末端融合(Kozlovska，Τ.Μ.，等人，Intervirology 39: 9-15(1996))?；蛘撸琋GF抗原可以插入CP延伸的位點(diǎn)72和73之間。例如，Kozlovska等 人(Intervirology，39 :9-15(1996))描述了 Q β Al融合蛋白，其中表位在第19位處截短的 Q3CP延伸的C末端融合。作為另一個(gè)實(shí)例，NGF抗原可以插入fr CP的氨基酸2和3之間 (Pushko P.等人，Prot. Eng. 6 :883-891(1993))。此外，NGF 抗原可以與 RNA 噬菌體 MS-2 的 外殼蛋白的N末端突出β-發(fā)夾融合(W0 92/13081)。此外，NGF抗原也可以與乳頭瘤病毒外殼蛋白融合，優(yōu)選與1型牛乳頭瘤病毒(BPV-I)的主要外殼蛋白Ll融合(Chackerian， B.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 2373-2378 (1999) ,WO 00/23955)。將 BPV-1L1 的氨 基酸130-136置換為NGF抗原也是本發(fā)明的實(shí)施方案。將NGF抗原與病毒的外殼蛋白、或 其突變體或片段融合的實(shí)施方案已經(jīng)在WO 2004/009124的第62頁第20行至第68頁第17 行公開，在此引入作為參考。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF抗原與RNA噬菌體AP205的外殼蛋白、其突變體或 片段的N末端或C末端融合，其中優(yōu)選地所述外殼蛋白或其突變體或片段包含或者優(yōu)選地 由選自SEQ ID NO 14和40至42中任一個(gè)、最優(yōu)選SEQ ID NO 41的氨基酸序列組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白進(jìn)一步包含間隔區(qū)，其中所述間隔區(qū) 位于RNA噬菌體AP205的所述外殼蛋白或其突變體或片段與所述NGF抗原之間。優(yōu)選地， 所述間隔區(qū)由不到20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5個(gè)氨基酸組成。非 常優(yōu)選地，所述間隔區(qū)由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含或者基本由或者由以下成分組成(a)具有 至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒；和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗 原，其中所述至少一種抗原是NGF抗原；并且其中(a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位 點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接，并且其中所述連接是通過至少一個(gè)非肽共價(jià)鍵，并 且其中優(yōu)選地所述第一附著位點(diǎn)不包含或者不是巰基，并且其中更優(yōu)選地所述第一附著位 點(diǎn)不包含或者不是半胱氨酸的巰基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)包含或者優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴氨酸殘基 的氨基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)包含或者優(yōu)選地是賴氨酸殘基的 氨基，其中所述賴氨酸殘基是所述VLP包含的重組外殼蛋白的賴氨酸殘基。在進(jìn)一步優(yōu)選 的實(shí)施方案中，所述第一附著位點(diǎn)包含或者優(yōu)選地是賴氨酸殘基的氨基，其中所述賴氨酸 殘基是所述VLP包含的RNA噬菌體的重組外殼蛋白的賴氨酸殘基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒 是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，優(yōu)選RNA噬菌體Q β的病毒樣顆粒，并且所述第一附著位點(diǎn)包 含或者優(yōu)選地是賴氨酸殘基的氨基，其中優(yōu)選地所述賴氨酸殘基是重組外殼蛋白的賴氨酸 殘基，優(yōu)選RNA噬菌體Q β的重組外殼蛋白的賴氨酸殘基，其中所述重組外殼蛋白被RNA噬 菌體的所述病毒樣顆粒包含。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒包 含、基本由或者由RNA噬菌體(優(yōu)選RNA噬菌體Qi3)的重組外殼蛋白、其突變體或片段組 成，并且所述第一附著位點(diǎn)包含或者優(yōu)選地是賴氨酸殘基的氨基，其中優(yōu)選地所述賴氨酸 殘基是所述RNA噬菌體(優(yōu)選RNA噬菌體Qi3)的所述重組外殼蛋白、其突變體或片段所包 含的賴氨酸殘基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒包 含、基本由、或者由RNA噬菌體的重組外殼蛋白組成，其中所述重組外殼蛋白包含或者優(yōu)選 地由氨基酸序列SEQ ID NO :1組成；并且其中所述第一附著位點(diǎn)包含或者優(yōu)選地是SEQ ID NO 1的賴氨酸殘基的氨基。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二附著位點(diǎn)包含或者優(yōu)選地是巰基，優(yōu)選 半胱氨酸殘基的巰基。在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)是
22氨基，優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基，并且至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)是巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NGF抗原通過化學(xué)交聯(lián)，典型且優(yōu)選地通過使用 異雙功能交聯(lián)劑與VLP連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有能夠與VLP的 優(yōu)選的第一附著位點(diǎn)(優(yōu)選氨基，更優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基)反應(yīng)的一個(gè)官能團(tuán)，和能夠與 NGF抗原上固有的或人工添加的優(yōu)選的第二附著位點(diǎn)(即巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基) 反應(yīng)的另一個(gè)官能團(tuán)，任選地也可通過還原用于反應(yīng)。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公 知。包括優(yōu)選的交聯(lián)劑 SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 和例如可從 PierceChemical Company 獲得的、具有一 個(gè)氨基反應(yīng)性官能團(tuán)和一個(gè)巰基反應(yīng)性官能團(tuán)的其它交聯(lián)劑。上述交聯(lián)劑均導(dǎo)致在與氨基 反應(yīng)后形成酰胺鍵和與巰基反應(yīng)后形成硫醚鍵。適用于實(shí)施本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑的特征 在于偶聯(lián)時(shí)在NGF抗原與VLP之間引入二硫鍵。屬于這一類的優(yōu)選交聯(lián)劑包括，例如SPDP 和 Sulfo-LC-SPDP (Pierce)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含連接體。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容， 通過連接優(yōu)選包含至少一個(gè)適合作為第二附著位點(diǎn)的氨基酸的連接體，實(shí)現(xiàn)向NGF抗原上 構(gòu)建第二附著位點(diǎn)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體通過至少一個(gè)共價(jià)鍵、 優(yōu)選通過至少一個(gè)、通常一個(gè)肽鍵與NGF抗原連接。優(yōu)選地，連接體包含或者由第二附著位 點(diǎn)組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體包含巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基。在 另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸連接體是半胱氨酸殘基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨 基酸連接體是CGG-或GCG-連接體，優(yōu)選CGG-連接體。適用于本發(fā)明的目的的連接體在 W02005/108425A1第32-33頁公開，其通過引入并入本文。根據(jù)上述優(yōu)選方法利用異雙功能交聯(lián)劑連接NGF抗原與VLP，允許NGF抗原以 定向方式與VLP偶聯(lián)。連接NGF抗原和VLP的其它方法包括使用碳二亞胺EDC和NHS交 聯(lián)NGF抗原和VLP的方法。NGF抗原也可以首先通過反應(yīng)，例如與SATA、SATP或亞氨硫 醇(iminothiolane)反應(yīng)而硫醇化。必要時(shí)，在去保護(hù)之后，NGF抗原可以與VLP如下所 述偶聯(lián)。在分離過量的硫醇化試劑之后，NGF抗原與預(yù)先用含有半胱氨酸反應(yīng)性部分的異 雙功能交聯(lián)劑活化的VLP反應(yīng)，該活化的VLP展示至少一個(gè)或幾個(gè)對(duì)半胱氨酸殘基具有反 應(yīng)性的官能團(tuán)，如上所述的硫醇化的NGF抗原能夠與該官能團(tuán)反應(yīng)。任選地，在反應(yīng)混合 物中含有少量的還原劑。另外一些方法使用同型雙功能交聯(lián)劑，如戊二醛、DSG、BM[PEOJ4, BS3 (Pierce)或含有對(duì)VLP的氨基或羧基有反應(yīng)性的官能團(tuán)的其它已知同型雙功能交聯(lián) 劑，使NGF抗原與VLP連接。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述組合物包含或者基本由通過化學(xué)相互作用連接 到NGF抗原的病毒樣顆粒組成，其中這些化學(xué)相互作用中的至少一個(gè)不是共價(jià)鍵。這些相 互作用包括但不限于抗原_抗體相互作用、受體_配體相互作用。VLP與NGF抗原的連接可 以通過將VLP生物素化并將NGF抗原表達(dá)為鏈霉抗生物素蛋白_融合蛋白而實(shí)現(xiàn)。一種或幾種抗原分子，即NGF抗原，如果空間允許，可以優(yōu)選地通過RNA噬菌體VLP 外殼蛋白上暴露的賴氨酸殘基連接到VLP (優(yōu)選RNA噬菌體外殼蛋白)的一個(gè)亞單元上。因 此，RNA噬菌體的VLP，特別是RNA噬菌體Q β的VLP的一個(gè)具體特征是每個(gè)亞單元有偶聯(lián) 數(shù)個(gè)抗原的可能性。這樣就允許產(chǎn)生密集的抗原陣列。
在本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，NGF抗原通過已添加到NGF抗原的N末端或C末 端上的半胱氨酸殘基，或NGF抗原內(nèi)的天然半胱氨酸殘基，與RNA噬菌體VLP的外殼蛋白的 賴氨酸殘基連接，特別是與RNA噬菌體Qi3的外殼蛋白的賴氨酸殘基連接。如上所述，4個(gè)賴氨酸殘基暴露于Qβ外殼蛋白的VLP的表面。典型且優(yōu)選地，這 些殘基在與交聯(lián)劑分子反應(yīng)時(shí)被衍生化。當(dāng)不是所有的暴露賴氨酸殘基都能與抗原偶聯(lián) 時(shí)，已與交聯(lián)劑反應(yīng)的賴氨酸殘基使得交聯(lián)劑分子在衍生化步驟后附著到ε_(tái)氨基上。這 就使可能對(duì)VLP的溶解性和穩(wěn)定性不利的一個(gè)或幾個(gè)正電荷消失。通過例如公開的Qi3外 殼蛋白突變體中那樣用精氨酸取代某些賴氨酸殘基，我們防止了正電荷的過度消失，因?yàn)?精氨酸殘基并不能與優(yōu)選的交聯(lián)劑反應(yīng)。此外，用精氨酸殘基取代賴氨酸殘基會(huì)產(chǎn)生更確 定的抗原陣列，因?yàn)橹挥休^少的位點(diǎn)可與抗原反應(yīng)。因此，在下列Qi3外殼蛋白突變體中，暴露的賴氨酸殘基被置換為精氨酸 Q^ -240 (Lysl3-Arg ； SEQ ID NO 15)、Q β-250 (Lys 2-Arg, Lys 13-Arg ； SEQ ID N0:17)、 Q^ -259(Lys 2-Arg, Lys 16-Arg ； SEQ IDNO : 19)禾口 Q β-251 (Ly s 16-Arg, SEQ ID N0:18)。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，我們公開了具有一個(gè)額外的賴氨酸殘基的RNA噬菌體Qi3的突變 外殼蛋白QP-243 (Asn IO-Lys ；SEQ ID NO 16)，它適合于獲得比RNA噬菌體Q β的野生型 外殼蛋白(SEQ ID NO 1)密度更高的抗原陣列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒由宿主重組產(chǎn)生，并且其中所 述病毒樣顆粒基本不含宿主RNA，并且其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒基本不含宿主核酸，其中 優(yōu)選地所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所 述組合物還包含至少一種與VLP結(jié)合、優(yōu)選包裝或包封于VLP內(nèi)部的聚陰離子大分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，優(yōu)選RNA噬 菌體Q β的病毒樣顆粒，其中所述RNA噬菌體的病毒樣顆粒，優(yōu)選所述RNA噬菌體Q β的病 毒樣顆粒，由宿主重組產(chǎn)生，并且其中所述RNA噬菌體的病毒樣顆粒，優(yōu)選所述RNA噬菌體 Q β的病毒樣顆粒，基本不含宿主RNA，并且其中所述組合物還包含至少一種聚陰離子大分 子，其中所述至少一種聚陰離子大分子包裝于所述RNA噬菌體的病毒樣顆粒內(nèi)，優(yōu)選地包 裝于所述RNA噬菌體Qi3的病毒樣顆粒內(nèi)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚陰離 子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，優(yōu)選聚谷氨酸。在上下文中，術(shù)語“基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、 優(yōu)選宿主核酸的量，該量典型且優(yōu)選地為每mgVLP不到30 μ g，優(yōu)選不到20 μ g，更優(yōu)選不 到10 μ g，甚至更優(yōu)選不到8 μ g，甚至更優(yōu)選不到6 μ g，甚至更優(yōu)選不到4 μ g，最優(yōu)選不到 2 μ g。更優(yōu)選地，所述VLP和/或所述本發(fā)明組合物所含的宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸低于檢 測限度。在上述內(nèi)容中使用的宿主是指在其中重組產(chǎn)生VLP的宿主，其中所述宿主典型且 優(yōu)選地是大腸桿菌。測定RNA、優(yōu)選核酸的量的常規(guī)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。根據(jù)本 發(fā)明測定RNA、優(yōu)選核酸的量的典型且優(yōu)選的方法W02006/037787A2的實(shí)施例17中描述。 對(duì)于含有Q0以外的VLP的本發(fā)明的組合物，測定RNA、優(yōu)選核酸的量典型且優(yōu)選地使用相 同、相似或類似的條件。最終需要的條件的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。確定的量的數(shù) 值應(yīng)當(dāng)?shù)湫颓覂?yōu)選地被理解為包括指定數(shù)值士 10%、優(yōu)選士5%偏差的數(shù)值。宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸術(shù)語“宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸”是指由宿主原始合成的 RNA或優(yōu)選核酸。但是，RNA，優(yōu)選核酸，在減少或消除RNA、優(yōu)選核酸的量的過程中經(jīng)歷化學(xué)和/或物理改變，典型且優(yōu)選地通過本發(fā)明的方法進(jìn)行，例如，RNA、優(yōu)選核酸的大小可以縮 短，或者其二級(jí)結(jié)構(gòu)可以改變。術(shù)語宿主RNA或核酸也包括這些降解產(chǎn)物。減少或消除宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸的量最小化或減少了不希望的T細(xì)胞應(yīng)答，如 炎性T細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，以及其它不希望的副作用，如發(fā)熱，而同時(shí)保持針 對(duì)抗原的強(qiáng)抗體應(yīng)答。一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明的組合物的方法，其中所述方法包括以下步 驟(a)提供具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的VLP ； (b)提供具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至 少一種NGF抗原；和(c)將所述VLP與所述NGF抗原組合，以產(chǎn)生組合物，其中所述NGF抗 原和所述VLP通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。在進(jìn) 一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供所述具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的VLP的步驟還包括以下步 驟(a)將所述病毒樣顆粒、優(yōu)選RNA噬菌體的所述病毒樣顆粒解裝配為所述外殼蛋白、其 突變體或片段，(b)純化所述外殼蛋白、其突變體或片段；(c)將所述純化的外殼蛋白、其突 變體或片段重裝配為病毒樣顆粒，其中優(yōu)選地所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA、優(yōu)選宿主 核酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述純化的外殼蛋白的重裝配在至少一種聚陰離 子大分子的存在下實(shí)現(xiàn)。在至少一種聚陰離子大分子的存在下重裝配RNA噬菌體的外殼蛋 白的方法例如在W02006/037787A2中公開。一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的組合物的疫苗組合物。另一方面，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，其中所述疫苗組合物包含或者由治療有 效量的本發(fā)明的任一種組合物組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗組合物進(jìn)一步包含至少一種佐劑。所述至少一 種佐劑的施用可以在施用本發(fā)明的組合物之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。本文使用的術(shù)語“佐劑” 是指免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產(chǎn)生一種儲(chǔ)庫(depot)的物質(zhì)，當(dāng)分別 與本發(fā)明的疫苗和藥物組合物結(jié)合時(shí)能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。至少一種佐劑的例子包括 且優(yōu)選地由以下成分組成完全和不完全弗氏佐劑、氫氧化鋁和修飾的胞壁酰二肽。其它 佐劑包括礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油狀 乳劑、匙孔蜮血藍(lán)蛋白、二硝基酚，以及潛在的可用于人的佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒狀 桿菌(Corynebacterium parvum)。這些佐劑也是本領(lǐng)域公知的。能夠與本發(fā)明的組合物 一起施用的其它佐劑包括但不限于單磷酰脂質(zhì)免疫調(diào)節(jié)劑、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、 CRL1005、鋁鹽(明礬)、]\^-59、011-174、011-197、011-294和病毒體佐劑技術(shù)。其它佐劑包括 免疫刺激性核酸，優(yōu)選在骨架中含有一個(gè)或多個(gè)修飾(優(yōu)選硫代磷酸修飾)的免疫刺激性 核酸。這種修飾將穩(wěn)定核酸免于降解。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗組合物不含佐劑。本發(fā)明的一個(gè)有利的特征 是組合物的高免疫原性，甚至在不含佐劑時(shí)依然如此。因此，優(yōu)選地給患者施用本發(fā)明的疫 苗組合物而不需在施用該疫苗組合物之前、同時(shí)或之后給同一名患者施用至少一種佐劑。 VLP通常被描述為佐劑。然而，術(shù)語“佐劑”在本申請(qǐng)上下文中使用時(shí)，是指不是用于本發(fā)明 的組合物的VLP的佐劑，而是除所述VLP以外的佐劑。如果接受個(gè)體能夠耐受本發(fā)明的疫苗組合物的施用，則認(rèn)為該疫苗組合物是“藥 學(xué)可接受的”。進(jìn)而，本發(fā)明的疫苗組合物將以“治療有效量”(即產(chǎn)生希望的生理學(xué)效應(yīng)的 量)施用。在本發(fā)明的上下文中，希望的生理學(xué)效應(yīng)典型且優(yōu)選地是疼痛的抑制或減輕。
一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述藥物組合物包含本發(fā)明的組合物 或疫苗組合物以及藥學(xué)可接受的載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含治療 有效量的本發(fā)明的組合物。當(dāng)給個(gè)體施用組合物或疫苗組合物時(shí)，它可以是含有鹽、緩沖 液、佐劑或其他改善偶聯(lián)物的效果所需的物質(zhì)的形式。適合在制備藥物組合物中使用的材 料的例子在許多資料中提供，包括 Remington，sPharmaceutical Sciences (Osol, A, ed.， Mack Publishing Co.，(1990))。藥物組合物的其它成分包括無菌水溶液(例如生理鹽水) 或非水溶液和懸浮液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、和可注射 的有機(jī)酯類例如油酸乙酯。可以使用載體或封閉敷料來增強(qiáng)皮膚滲透性和增強(qiáng)抗原吸收。本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種免疫方法，優(yōu)選地針對(duì)NGF抗原的免疫方法，所述方法 包括給動(dòng)物，優(yōu)選地給人，施用組合物、疫苗組合物或藥物組合物。所述動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng) 物，如小鼠、猴、黑猩猩、狗、貓、馬，特別是人。組合物、疫苗組合物或藥物組合物可以用本領(lǐng) 域所知的各種方法給所述動(dòng)物、優(yōu)選地給所述人施用。典型且優(yōu)選地，組合物、疫苗組合物 或藥物組合物通過注射、輸注、吸入或口服給所述動(dòng)物、優(yōu)選地給所述人施用。進(jìn)一步優(yōu)選 地，組合物、疫苗組合物或藥物組合物經(jīng)肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下 施用。一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或者特別是治療疼痛的方法，其中所述方法包括給 動(dòng)物，優(yōu)選地給人施用所述組合物、所述疫苗組合物或所述藥物組合物，其中典型且優(yōu)選地 所述動(dòng)物和優(yōu)選地所述人患有疼痛。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疼痛是傷害性疼痛。在 一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疼痛是慢性炎性痛。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述傷 害性疼痛是骨關(guān)節(jié)痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎痛、癌癥痛、內(nèi)臟痛、慢性腰背痛或慢性頭痛、胰腺炎 痛、膀胱炎痛或前列腺炎痛。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疼痛是骨癌痛。在一個(gè)優(yōu) 選實(shí)施方案中，所述疼痛是由損傷引起的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疼痛是神經(jīng)性疼痛，它可以由例如以下原因引起損 傷引起的神經(jīng)壓迫/神經(jīng)創(chuàng)傷，神經(jīng)細(xì)胞感染，如皰疹后神經(jīng)痛，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的狀 況，如中風(fēng)或退行性神經(jīng)性障礙或幻肢痛。本發(fā)明的另一方面是所述組合物、所述疫苗組合物或所述藥物組合物作為藥物的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供所述組合物或所述疫苗組合物在制備用于治療動(dòng)物(優(yōu)選 人)的疼痛的藥物中的用途，其中優(yōu)選地所述疼痛是傷害性疼痛或神經(jīng)性疼痛。在一個(gè)非 常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疼痛是慢性炎性痛。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疼痛是骨 關(guān)節(jié)痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎痛、癌癥痛、內(nèi)臟痛、慢性腰背痛或慢性頭痛、胰腺炎痛、膀胱炎痛 或前列腺炎痛。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疼痛是骨癌痛。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案 中，所述疼痛是由損傷引起的。另一方面，本發(fā)明提供此處所述的用于治療動(dòng)物(優(yōu)選人)的疼痛的如此處所述 的組合物、疫苗組合物或藥物組合物，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述組合物、所述疫苗或所述藥物 組合物將要對(duì)所述動(dòng)物、優(yōu)選地對(duì)所述人施用，并且其中再進(jìn)一步優(yōu)選地所述疼痛是傷害 性疼痛或神經(jīng)性疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含、基本由或優(yōu)選地由以 下成分組成(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌體Q0的VLPjn (b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗 原包含NGF蛋白和連接體，并且其中優(yōu)選地所述NGF蛋白由SEQ ID NO 22組成；并且其中 (a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接，并且其中 所述第一附著位點(diǎn)是RNA噬菌體Q β的所述VLP的賴氨酸殘基的氨基，并且其中所述第二 附著位點(diǎn)被所述連接體包含，并且其中所述連接體通過肽鍵融合到所述NGF蛋白上，并且 其中所述第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基；并且其中優(yōu)選地所述第一附著位點(diǎn)和所述第二 附著位點(diǎn)通過異雙功能交聯(lián)劑連接，優(yōu)選地通過SMPH連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含、基本由或優(yōu)選地由以 下成分組成(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬 菌體Q0的VLPjn (b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗 原包含NGF片段和連接體，并且其中優(yōu)選地所述NGF片段由SEQ ID NO 44組成；并且其中 (a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接，并且其中 所述第一附著位點(diǎn)是RNA噬菌體Q β的所述VLP的賴氨酸殘基的氨基，并且其中所述第二 附著位點(diǎn)被所述連接體包含，并且其中所述連接體通過肽鍵融合到所述NGF蛋白上，并且 其中所述第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基；并且其中優(yōu)選地所述第一附著位點(diǎn)和所述第二 附著位點(diǎn)通過異雙功能交聯(lián)劑連接，優(yōu)選地通過SMPH連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含、基本由或優(yōu)選地由以 下成分組成(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬 菌體Q0的VLPjn (b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗 原包含NGF突變蛋白和連接體，并且其中優(yōu)選地所述NGF突變蛋白由SEQID NO 45-75中的 任一個(gè)組成；并且其中(a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附 著位點(diǎn)連接，并且其中所述第一附著位點(diǎn)是RNA噬菌體Q β的所述VLP的賴氨酸殘基的氨 基，并且其中所述第二附著位點(diǎn)被所述連接體包含，并且其中所述連接體通過肽鍵融合到 所述NGF蛋白上，并且其中所述第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基；并且其中優(yōu)選地所述第 一附著位點(diǎn)和所述第二附著位點(diǎn)通過異雙功能交聯(lián)劑連接，優(yōu)選地通過SMPH連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含、基本由或優(yōu)選地由以 下成分組成(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含或者 優(yōu)選地由SEQ ID NO :1組成，和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所 述至少一種抗原包含NGF抗原和連接體，并且其中所述NGF抗原選自(i) NGF蛋白，優(yōu)選 SEQ ID NO :22 ;(ii)NGF 片段，優(yōu)選 SEQ ID NO :44 ；禾口(iii) NGF 突變蛋白，優(yōu)選 SEQ ID NO: 45-75中的任一個(gè)；并且其中(a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè) 第二附著位點(diǎn)連接，并且其中所述第一附著位點(diǎn)是所述SEQ ID NO :1的賴氨酸殘基的氨基， 并且其中所述第二附著位點(diǎn)被所述連接體包含，并且其中所述連接體通過肽鍵融合到所述 NGF抗原上，并且其中所述第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基；并且其中優(yōu)選地所述第一附 著位點(diǎn)和所述第二附著位點(diǎn)通過異雙功能交聯(lián)劑連接，優(yōu)選地通過SMPH連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含、基本由或優(yōu)選地由以 下成分組成(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬 菌體Q0的VLPjn (b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗 原包含NGF抗原和連接體，并且其中所述NGF抗原選自(i)NGF蛋白，優(yōu)選SEQ ID NO 22 ；
27(ii) NGF片段，優(yōu)選SEQ ID NO :44 ；和(iii) NGF突變蛋白，優(yōu)選SEQ ID N0:45_75中的任一 個(gè)；并且其中(a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連 接，并且其中所述第一附著位點(diǎn)是RNA噬菌體Q β的所述VLP的賴氨酸殘基的氨基，并且其 中所述第二附著位點(diǎn)被所述連接體包含，并且其中所述連接體通過肽鍵融合到所述NGF抗 原上，并且其中所述第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基；并且其中優(yōu)選地所述第一附著位點(diǎn) 和所述第二附著位點(diǎn)通過異雙功能交聯(lián)劑連接，優(yōu)選地通過SMPH連接，其中所述組合物進(jìn) 一步包含至少一種聚陰離子大分子，其中所述聚陰離子大分子包裝于所述VLP內(nèi)，并且其 中優(yōu)選地所述聚陰離子大分子是聚谷氨酸。
實(shí)施例實(shí)施例1mproNGF β cDNA向原核表達(dá)載體中的克隆使用以下引物通過PCR從鼠胚腦組織的cDNA文庫擴(kuò)增小鼠proNGF β Nde-proNGF-F (SEQ ID NO 26)和 proNGF-Xho-R (SEQ IDNO 27)。PCR 產(chǎn)物用 NdeI 禾口 XhoI 消化，并且連接到pM-His-GGC載體中。得到的質(zhì)粒被命名為pM-proNGF-HisGGC，它編碼包 含小鼠NGF β、His6標(biāo)簽和含有兩個(gè)甘氨酸及隨后的C末端半胱氨酸的連接體的融合蛋白。實(shí)施例2pCB28_proNGF β -His-GGC真核表達(dá)載體的構(gòu)建使用以下兩條引物通過PCR從pM-proNGF-Hi sGGC載體擴(kuò)增mproNGF β序列 mproNGFeuk_varl_f (SEQ ID NO 28)和 mproNGFeuk_varl_r (SEQ ID NO :29)。將 PCR 產(chǎn)物 連接至Ij pCRII-TOPO載體(Invitrogen)。用PacI和XhoI消化pCRIΙ-Τ0Ρ0載體，并將得到 的mproNGF β -HisGGC片段連接到pCB28載體中。得到的質(zhì)粒被命名為pCB28_mproNGF_His_ C，其編碼來源于pSECTag2/HygroA，B，C載體(Invitrogen)的、免疫球蛋白κ輕鏈的信 號(hào)序列，隨后是mproNGF β序列、His6標(biāo)簽和含有兩個(gè)甘氨酸及隨后的C末端半胱氨酸的連 接體。實(shí)施例3pCB28-proNGF β -His-GGC 在 293Τ HEK 細(xì)胞中的表達(dá)1 μ g含有嘌呤霉素抗性基因的pCB28_proNGF_His_C表達(dá)載體與200 μ 1 Opti-MEM(Invitrogen)和 7. 5 μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)混合，并轉(zhuǎn)染到 1.5*106ΗΕΚ 293Τ細(xì)胞中。4小時(shí)后，再向細(xì)胞補(bǔ)充含有10 % FCS和1 %非必需氨基酸 (Invitrogen)的D-MEM培養(yǎng)基。24小時(shí)后，向培養(yǎng)基中加入lmg/1嘌呤霉素(Invitrogen)， 以允許對(duì)嘌呤霉素抗性進(jìn)行選擇。嘌呤霉素抗性細(xì)胞在聚-L-賴氨酸包被的中在不含F(xiàn)CS、 含有10mg/l還原型谷胱甘肽(Fluka)、161mg/l N-乙?；?L-半胱氨酸(Fluka)、1%非必 需氨基酸、青霉素/鏈霉素(Invitrogen)和lmg/1嘌呤霉素的D-MEM培養(yǎng)基中生長。收集嘌呤霉素抗性細(xì)胞的上清液，并通過Amicon超速離心過濾裝置(Millipore) 濃縮5倍，在還原條件下在12% NUPAGE Bis/Tris凝膠(Invitrogen)上電泳。通過使用 抗五組氨酸特異性抗體(Qiagen)進(jìn)行免疫印跡分析顯示NGF的表達(dá)。顯示的大約15kDa 的條帶證明了表達(dá)，該條帶對(duì)應(yīng)于含有His標(biāo)簽和連接體的成熟mNGF β (SEQ IDNO 30)的 14. 7kDa的預(yù)期大小。從表達(dá)mproNGF β -His-GGC的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞釋放到上清液中的成熟mNGF β -HisGGC的正確加工通過Edman降解得到證實(shí)，并且顯示SSTHP為成熟mNGF β的五 個(gè)N末端氨基酸。這對(duì)應(yīng)于成熟mNGFii的五個(gè)預(yù)期的氨基酸并且證實(shí)mproNGFβ-His-GGC 被HEK 293Τ細(xì)胞正確地表達(dá)和加工為mNGF β -His-GGC0實(shí)施例4mNGF β -Hi s_GGC 的純化通過Ni2+-親和力純化從HEK 293T上清液純化mNGF β -His-GGC0簡言之，上清液 中補(bǔ)充1/10體積的鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)-結(jié)合緩沖液(500mM NaH2PO4,1. 5M NaCl, IOOmM Imidazol, IOOmM^-巰基乙醇，pH8)，然后使用蠕動(dòng)泵在4°C下泵送流經(jīng)填充到柱中 的平衡的Ni-NTA超流珠(Qiagen) 16小時(shí)。結(jié)合后，將柱連接到AEKTAPurifier FPLC系 統(tǒng)，并且用四倍柱體積的洗滌緩沖液(50mM NaH2PO4,150mM NaCl,20mM imidazol, pH8)洗 滌M-NTA超流珠，以減少非特異性結(jié)合的雜質(zhì)的量。隨后用從洗滌到洗脫緩沖液(50mM NaH2PO4,150mM NaCl,500mM imidazol, pH8)的2倍柱體積的梯度洗脫mNGF β。洗脫的蛋白 質(zhì)在還原條件下在12% NUPAGE Bis/Tris凝膠上電泳，以檢查純化質(zhì)量。這樣可以得到高 純度的mNGF β -His-GGC,并且用于如實(shí)施例7所述進(jìn)一步產(chǎn)生Q β -mNGF β -His-GGC0實(shí)施例5單克隆抗體對(duì)mNGF β -His-GGC的識(shí)別與從小鼠頌下腺純化的不含天然標(biāo)簽和連接體的mNGF β相比，mNGF β -His-GGC 的結(jié)合通過夾心ELISA測定，其中使用用于捕獲的單克隆抗NGFi3抗體(Chemicon International)和用于檢測的多克隆綿羊抗mNGF β抗體(Chemicon International)。簡 言之，單克隆抗mNGF3抗體在碳酸鹽緩沖液(0. IM NaHCO3, pH 9.6)中稀釋至0. 85 μ g/ml， 并且在微量滴定板孔上4°C包被過夜。然后用PBS-0. 05% Tween20 (PBS-T)洗板3次，之后 在37°C下用含有2% BSA的PBS-T封閉2小時(shí)。然后將板在室溫下與濃度逐漸提高的在含有 1 % BSA的PBS-T中稀釋的從頌下腺分離的0. 2至200ng/ml的mNGF β -His-GGC或mNGF β 溫育2小時(shí)。然后用PBS-T洗板6次，并且與10 μ g/ml綿羊抗mNGF β抗體在室溫下溫育 1小時(shí)。用PBS-T洗滌6次后，將板在室溫下與60 μ g/ml過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗綿羊抗體 (Chemicon International)溫育30分鐘。使用PBS-T進(jìn)行最后6次洗滌步驟后，通過向所 有孔中添加由在25ml檸檬酸緩沖液(66mM NaH2P04，35mM檸檬酸，pH5)中的IOmg OPD底物 (Fluka)和8 μ 1 H2O2 (30% )組成的100 μ 1溶液開始酶反應(yīng)。用5% H2SO4終止顏色反應(yīng)， 使用ELISA讀數(shù)儀(BioRad)在450nm測量吸光度。ELISA顯示重組表達(dá)的mNGF β-His-GGC 和mNGF β被同樣識(shí)別，表明mNGF β -Hi s-GGC正確表達(dá)并且以正確的三級(jí)構(gòu)象折疊。實(shí)施例6mNGF β -His-GGC 的生物活性mNGF β-His-GGC的生物活性在體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)中進(jìn)行檢測，該試驗(yàn)使用 mNGF β響應(yīng)性因子依賴的人紅白血病TF-I細(xì)胞系(ATCC)作為讀出系統(tǒng)，如其他人(R&D NGF^產(chǎn)品表)所述。簡言之，將IO4TF-I細(xì)胞接種于96孔平底板每孔中的100 μ 1 DMEM 培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% FCS，IOmM HEPES，1 %青霉素/鏈霉素和1 % Glutamax)中。向細(xì)胞中 添加從頌下腺純化的濃度逐漸提高的0. 8至100ng/ml mNGF β -HisGGC或mNGF β。48小時(shí) 后，將細(xì)胞用將要摻入增殖的細(xì)胞中的BrdU標(biāo)記試劑(Roche Diagnostics)標(biāo)記。24小 時(shí)后，固定細(xì)胞，隨后與過氧化物酶偶聯(lián)的抗BrdU單克隆抗體(Roche Diagnostics)溫育。充分洗滌后，向每孔加入100 μ 1四芐基-聯(lián)苯胺底物溶液。用5% H2SO4終止顏色反應(yīng)，并 且使用ELISA讀數(shù)儀(BioRad)在450nm測量吸光度。來自頌下腺的mNGF β -His-GGC和 mNGF β都以類似的方式刺激增殖，表明mNGF β -His-GGC具有生物活性。實(shí)施例7mNGF β -His-GGC 與 Q β -VLP 的偶聯(lián)Q^-VLP(2mg/ml)與5倍摩爾過量的異雙功能交聯(lián)劑琥珀酰亞胺基_6_(β -馬來 酰亞氨基丙酰胺基)己酸酯(SMPH，PierCe)在室溫下反應(yīng)30分鐘。SMPH從溶解于二甲亞 砜的50mM貯存液獲得。使用IOkDa的分子量截?cái)嘀?Slide-A-Lyzer，Pierce)，更換兩次偶 聯(lián)緩沖液(20mMMES，300mM NaCl，10%甘油，pH6)，透析反應(yīng)產(chǎn)物。透析在室溫下進(jìn)行。以 這種方式衍生化的Qβ -VLP然后用于偶聯(lián)靶蛋白質(zhì)。偶聯(lián)前，如實(shí)施例4所述獲得的純化的mNGF β -His-GGC在偶聯(lián)緩沖液中透析，并 且在室溫(RT)下用5倍摩爾過量的TCEP還原1小時(shí)。還原的mNGF β -His-GGC (0. 25mg/ ml)與衍生化的Q β (0. 25mg/ml)在總體積100 μ 1中4°C溫育4小時(shí)。反應(yīng)完成后，離心反 應(yīng)管以除去可能的沉淀。通過將偶聯(lián)產(chǎn)物在還原條件下在12% NuPAGE Bis/Tris凝膠上進(jìn) 行電泳并使用抗五His抗體進(jìn)行免疫印跡分析來分析偶聯(lián)反應(yīng)，顯示mNGF β與Q β -VLP有 效偶聯(lián)。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford進(jìn)行測定。實(shí)施例8Q β -mNGF β -His-GGC 的免疫原性在第0、10、20天在不含佐劑的情況下，用50μ g從實(shí)施例7獲得的與 mNGF β -Hi s-GGC偶聯(lián)的Q β VLP皮下免疫雄性DBA/1小鼠。作為陰性對(duì)照的小鼠只 用QP-VLP免疫。在第10、20、30天采血。通過以10，OOOg在血清管(Mirotainer，BD Biosciences)中離心血液樣品10分鐘制備血清。血清樣品中mNGF β特異性抗體的檢測通 過ELISA進(jìn)行，其中使用從小鼠頌下腺純化的不含標(biāo)簽和連接體的mNGF β進(jìn)行包被。簡言 之，將mNGF β在碳酸鹽緩沖液(0. IM NaHCO3, ρΗ 9. 6)中稀釋至濃度為2. 5μ g/ml，并且在 4°C在微量滴定孔上包被過夜。然后用PBS-0. 05% Tween20 (PBS-T)洗板三次，之后用含有 2% BSA的PBS-T在37°C封閉2小時(shí)。然后板與在PBS_T+2% BSA中稀釋的血清樣品在室溫 下溫育2小時(shí)，其中使用3倍稀釋步驟，并且開始于1 200的初始稀釋度。然后用PBS-T 洗板6次，并且與1 1000稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG-Fc抗體(Jackson ImmunoResearchLaboratories)在室溫下溫育1小時(shí)。洗滌6次后，通過向所有孔中添加 由在25ml檸檬酸緩沖液(66mM NaH2P04, 35mM檸檬酸，pH5)中的IOmg OPD底物和8 μ 1 H2O2 (30% )組成的100 μ 1溶液啟動(dòng)酶反應(yīng)。用5% H2SO4終止顏色反應(yīng)，使用ELISA讀數(shù) 儀(BioRad)在450nm測量吸光度。ELISA顯示使用上述免疫方案，Q β -mNGF β -His-GGC可 以誘導(dǎo)針對(duì)mNGF β的強(qiáng)自身抗體應(yīng)答。實(shí)施例9抗Q β -mNGF β -His-GGC抗體的中和活性如實(shí)施例6所述在體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)中檢測Q β -mNGF β -His-GGC免疫產(chǎn)生的抗 體的體外中和活性。簡言之，如實(shí)施例8所述用Qβ或Qi3-mNGFi3-His-GGC免疫小鼠。收 集免疫動(dòng)物的血清，通過蛋白G純化從血清中分離總IgG部分。然后在TF-I細(xì)胞增殖試驗(yàn) 中檢測從Q β或Q β -mNGF β -His-GGC免疫的小鼠中純化的總IgG中和mNGF β生物活性的能力。簡言之，將IO4TF-I細(xì)胞接種于96孔平底板每孔中的100 μ 1 DMEM培養(yǎng)基(補(bǔ)充 有10% FCS, IOmM HEPES，青霉素/鏈霉素和1 % Glutamax)中。從頌下腺純化的濃度 逐漸提高的0. 2至10ng/ml mNGF β與從Q β或Q β -mNGF β -His-GGC免疫小鼠的血清中 純化的總IgG在室溫下預(yù)溫育30分鐘，然后向細(xì)胞中添加。48小時(shí)后，將細(xì)胞用將要摻入 增殖的細(xì)胞中的BrdU標(biāo)記試劑(Roche Diagnostics)標(biāo)記。24小時(shí)后，固定細(xì)胞，隨后與 過氧化物酶偶聯(lián)的抗BrdU單克隆抗體(Roche Diagnostics)溫育。充分洗滌后，向每孔 加入100 μ 1四芐基-聯(lián)苯胺底物溶液。用5% H2SO4終止顏色反應(yīng)，并且使用ELISA讀數(shù) 儀(BioRad)在450nm測量吸光度。用與來自Qi3免疫的小鼠的10 μ g/ml或50 μ g/ml總 IgG預(yù)溫育的濃度逐漸增高的mNGF β刺激的細(xì)胞顯示沒有增殖抑制。另一方面，用與來自 Qβ -mNGFβ -His-GGC免疫的小鼠的10 μ g/ml或50 μ g/ml總IgG預(yù)溫育的濃度逐漸增高 的mNGF β刺激的細(xì)胞顯示增殖速率顯著降低，證明Q β -mNGF β -His-GGC免疫產(chǎn)生的抗體 具有NGF中和活性(圖1)。實(shí)施例10Q^-mNGF-His-GGC接種在膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎中抑制惡病質(zhì)的效能在小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型，即所謂的膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)中，評(píng)價(jià)了 Qβ -mNGF-His-GGC疫苗減輕自身免疫關(guān)節(jié)炎中惡病質(zhì)的能力。在該模型中，通過真皮內(nèi)注 射完全弗氏佐劑(CFA)中的2型膠原(MD Biosciences)，然后在21天后真皮內(nèi)注射不完 全弗氏佐劑(IFA)中的II型膠原，來誘導(dǎo)RA。炎癥穩(wěn)定進(jìn)展，并且最終達(dá)到關(guān)節(jié)強(qiáng)直和永 久性關(guān)節(jié)損壞伴體重減輕。雄性DBA/1小鼠(η = 8)在第-35天、第-21天和第-7天用 50 μ gQ β mNGF-Hi s-GGC免疫，陰性對(duì)照小鼠只用Q β免疫。三次免疫后，在第0天誘導(dǎo)RA。 在7-9周中監(jiān)測炎癥過程，并根據(jù)以下定義給每肢賦予臨床得分0正常，1輕度紅斑和/或 腳趾/爪腫脹，2紅斑且腫脹延伸到整個(gè)爪/關(guān)節(jié)，3爪/關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹、變形，具有關(guān)節(jié)強(qiáng) 直。圖2Α顯示Qi3和Qi3-mNGF-His-GGC免疫的動(dòng)物中的關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。兩組中關(guān)節(jié)炎進(jìn)展 至非常類似的程度。在相同時(shí)期，每日稱量小鼠體重(圖2B)，顯示特別是在發(fā)病后，兩組之 間平均體重具有顯著偏差，表明Qi3-mNGF-His-GGC免疫小鼠中自身免疫性相關(guān)的惡病質(zhì) 得到抑制。實(shí)施例11在酵母聚糖A誘導(dǎo)的小鼠炎性痛模型中，Qβ -HiNGFP -His-GGC接種在抑制炎性痛 方面的效能向雄性BL/6小鼠的后足跖側(cè)注射酵母提取物酵母聚糖A(Sigma)可引起熱和機(jī)械 刺激，Qi3 -mNGF-His-GGC疫苗減輕這種刺激引起的炎癥超敏性的能力通過以下方式進(jìn)行評(píng) 價(jià)雄性BL/6小鼠(η = 4)在第0、10和20天用50 μ g Q β -mNGF β -His-GGC或單獨(dú)的Q β 進(jìn)行免疫。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測定兩個(gè)后足的跖側(cè)響應(yīng)于熱和機(jī)械刺激的熱超敏性。為了測 定熱敏感性，確定在用特定強(qiáng)度的熱源(紅外光束)刺激后足回縮的潛伏期。使用電子控 制的儀器(Plantartest，Ugo Basile)確定潛伏期。調(diào)節(jié)熱源強(qiáng)度，使得對(duì)于未處理的動(dòng) 物，潛伏期大約為16秒。對(duì)于每個(gè)后足，進(jìn)行6次測量，并且計(jì)算平均值。為了測定機(jī)械敏 感性，測量對(duì)使用所謂的Von Frey絲的刺激的響應(yīng)。Von Frey絲是校準(zhǔn)的塑料絲，使用它 可以向小鼠足的跖側(cè)施加逐漸增大的壓力。使用電子控制的儀器(IITC，W00dland Hills, USA)，測量施加的導(dǎo)致足回縮的壓力。每足進(jìn)行6次測量，并計(jì)算平均值。第31天，通過向
31左后足跖側(cè)注射20 μ 1 3mg/ml酵母聚糖A溶液誘導(dǎo)炎性痛。誘導(dǎo)炎性痛2小時(shí)、4小時(shí)、6 小時(shí)、8小時(shí)、1天、2天、3天、4天和7天后，如上所述根據(jù)爪回縮測定酵母聚糖A誘導(dǎo)的炎 癥發(fā)病后立即產(chǎn)生的響應(yīng)于熱和機(jī)械刺激的超敏性。如圖3所證明的，與只用Qi3免疫的 動(dòng)物相比，用Q0 -mNGF-His-GGC免疫的動(dòng)物在熱刺激(圖3A)和機(jī)械刺激(圖3B)后顯示 顯著降低的超敏性。實(shí)施例12在慢性壓迫性損傷誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)性疼痛模型中，NGF-His-GGC抑制神經(jīng)性疼痛 的效能雄性BL/6 小鼠(η = 6)在第 0、14 和 28 天用 50 μ g Q β -mNGF β -His-GGC 或單獨(dú) 的免疫。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)如實(shí)施例11所述確定兩個(gè)后足的跖側(cè)響應(yīng)于熱和機(jī)械刺激的熱 超敏性。在第42天通過結(jié)扎坐骨神經(jīng)誘導(dǎo)慢性壓迫性損傷(CCI)或者不進(jìn)行操作(假手 術(shù)對(duì)照組)。坐骨神經(jīng)的結(jié)扎導(dǎo)致各肢在14天內(nèi)發(fā)展超敏性，并且在下降前持續(xù)另外2-3 周。CCI是建立的嚙齒動(dòng)物神經(jīng)性疼痛模型。CCI手術(shù)后，如實(shí)施例11所述每隔一天測定 響應(yīng)于熱和機(jī)械刺激的敏感性。實(shí)施例13人NGF3的克隆、表達(dá)、純化以及與Q β-VLP的偶聯(lián)通過PCR從人胎腦組織cDNA文庫擴(kuò)增人proNGF β，并且將PCR產(chǎn)物連接到pCB28 表達(dá)載體中。得到的質(zhì)粒被命名為pCB28_hupr0NGF_His_C，其編碼來自于、免疫球蛋白的 κ輕鏈的信號(hào)序列，隨后是huproNGFii序列、His6標(biāo)簽和含有兩個(gè)甘氨酸及隨后的C末端 半胱氨酸的連接體?；救鐚?shí)施例3所述將真核表達(dá)載體pCB28_hupr0NGF_His_C轉(zhuǎn)染到 HEK 293T細(xì)胞中，并且收集含有成熟huNGF β -His-GGC的上清液用于基本如實(shí)施例4所述 通過Ni-NTA純化。純化的蛋白質(zhì)具有SEQ ID Ν0:31所示的序列。根據(jù)實(shí)施例7所述的方 案，將純化的huNGF β -His-GGC與SMPH衍生的Qb-VLP進(jìn)行偶聯(lián)。實(shí)施例14接種與含有聚陰離子大分子聚谷氨酸的Qi3 -顆粒偶聯(lián)的mNGFii -His-GGC的效能含有聚陰離子大分子聚谷氨酸的Qi3-顆粒，后面被稱為Qi3 (P0IyGlu)^TO 06/037787的實(shí)施例4所述產(chǎn)生。如前面實(shí)施例7所述將mNGF β -His-GGC與Q β (PolyGlu) 偶聯(lián)。Q β (PolyGlu) -mNGF β -His-GGC的免疫原性如下測定雌性BL6小鼠(每組η = 4只) 在第0、14、28和42天使用與作為佐劑的0. 33% Alhydrogel混合的50ug Qβ (PolyGlu)、 Q β (PolyGlu)-mNGF β-His-GGC 或 Q β-mNGF β-His-GGC 皮下免疫。在第 0、14、28、42 和56天采血。制備血清，如實(shí)施例8所述通過ELISA測定mNGFii特異性抗體。通過 Q^ (PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC免疫誘導(dǎo)的抗mNGFii特異性抗體的效價(jià)顯著低于使用 Q β -mNGFii -His-GGC誘導(dǎo)的效價(jià)，并且顯示Th2 IgG同種型模式，如IgG2a效價(jià)降低但I(xiàn)gGl 效價(jià)升高所表明的(表1)。表1 :Q β (PolyGlu) -mNGF β -His-GGC 或 Q β -mNGF β -His-GGC 免疫后 mNGF β 特異 性抗體的誘導(dǎo)。小鼠在第 O、14、28 和 42 天用 Q β (PolyGlu)、Q β (PolyGlu) -mNGF β -His-GGC 或Q β -mNGF β -His-GGC免疫。在第O、14、28、42和56天采血，產(chǎn)生血清，并通過ELISA分 析血清樣品中mNGFii特異性總IgG、IgGl同種型和IgG2a同種型的效價(jià)。
權(quán)利要求
一種組合物，包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是NGF抗原；并且其中(a)和(b)通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
2.前述權(quán)利要求的組合物，其中所述至少一種抗原是NGF蛋白、NGF片段或NGF突變蛋白。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種抗原是NGF蛋白，其中所述NGF 蛋白由一種氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列包含與氨基酸序列SEQ ID N0:22至少 90%的序列同一性，并且其中優(yōu)選地所述NGF蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO 22組成。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種抗原是NGF片段，其中優(yōu)選地 所述NGF片段由SEQ ID NO 44組成。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種抗原是NGF突變蛋白，其中優(yōu) 選地所述NGF突變蛋白具有降低的生物活性，并且其中最優(yōu)選地所述NGF突變蛋白不具有 生物活性。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少一種抗原是NGF突變蛋白，并且其 中所述NGF突變蛋白由選自SEQ ID NO 45-75的任一的氨基酸序列組成。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述VLP是RNA噬菌體的VLP，其中優(yōu)選地所 述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ ；(b)噬菌體Rl7；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體Mll；(h)噬菌體MXl； ⑴噬菌體NL95 ； (k)噬菌體f2 ； (1)噬菌體PP7，和 (m)噬菌體AP205。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述VLP包含RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其 突變體或片段，其中優(yōu)選地所述外殼蛋白包含SEQ ID NO 1或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 1組 成。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第一附著位點(diǎn)與所述第二附著位點(diǎn)通過 至少一個(gè)共價(jià)鍵連接。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述共價(jià)鍵是非肽鍵。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第一附著位點(diǎn)包含或者優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第二附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是巰基，優(yōu) 選半胱氨酸殘基的巰基。
13.權(quán)利要求9的組合物，其中所述至少一個(gè)共價(jià)鍵是肽鍵，并且其中優(yōu)選地所述VLP 是RNA噬菌體AP205的VLP。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述VLP是重組VLP，并且其中所述重組VLP 基本不含宿主RNA。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含至少一種聚陰離子大分子，其 中所述聚陰離子大分子包裝到所述VLP內(nèi)，并且其中優(yōu)選地所述聚陰離子大分子是聚陰離 子多肽或陰離子葡聚糖。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述聚陰離子大分子是選自下組的聚陰離子多肽(a) 聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d) (a)至(c)的任何化學(xué)修飾，并且其中 優(yōu)選地所述聚陰離子多肽是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，并且其中更優(yōu)選地所述聚陰離子 多肽是聚谷氨酸。
17.權(quán)利要求15的組合物，其中所述聚陰離子大分子是陰離子葡聚糖，并且其中優(yōu)選 地所述陰離子葡聚糖選自(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙基葡聚糖；(d)磺酸甲酯葡聚糖；和(e)磷酸葡聚糖。
18.一種疫苗組合物，包含治療有效量的前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中優(yōu)選地 所述疫苗組合物還包含佐劑。
19.一種藥物組合物，包含(a)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的組合物；和(b)藥學(xué)可接受的載體。
20.一種免疫方法，包括給動(dòng)物，優(yōu)選地給人施用權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的組合物、權(quán) 利要求18的疫苗組合物或權(quán)利要求19的藥物組合物。
21.用作藥物的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求18的疫苗組合物或權(quán)利要 求19的藥物組合物。
22.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求18的疫苗組合物在制備用于治療疼 痛、優(yōu)選慢性疼痛、最優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛的藥物中的用途。
23.用于治療疼痛、優(yōu)選慢性疼痛、最優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛的權(quán)利要求1-17中任 一項(xiàng)的組合物、權(quán)利要求18的疫苗組合物或權(quán)利要求19的藥物組合物。
24.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的組合物的方法，所述方法包括(a)提供具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的VLP；(b)提供具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種NGF抗原；和(c)將所述VLP與所述NGF抗原連接，以產(chǎn)生所述組合物，其中所述NGF抗原和所述VLP 通過所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供包含與至少一種抗原連接的病毒樣顆粒(VLP)的組合物，其中所述抗原是NGF抗原。本發(fā)明也提供制備所述組合物的方法。本發(fā)明的組合物可以用于生產(chǎn)疫苗，特別是用于治療疼痛。而且，本發(fā)明的組合物能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答。
文檔編號(hào)C07K14/48GK101951943SQ200880121616
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者G·詹寧斯, M·巴克曼, T·羅恩 申請(qǐng)人:賽托斯生物技術(shù)公司