專利名稱：通過施用神經(jīng)生長因子拮抗劑和nsaid和含有它們的組合物治療疼痛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及通過對(duì)患者組合施用神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID來預(yù)防和治療疼痛的方法和組合物。
背景技術(shù)：
當(dāng)前推薦包括施用非類固醇抗炎藥(NSAID)的一些治療用于減輕疼痛。已經(jīng)證明施用NSAID表現(xiàn)出疼痛減輕的特征。然而，已知用NSAIDs治療具有缺點(diǎn)，包括有害的副作用，如胃腸道刺激和腎和肝毒性。此外，NSAID即使以它們最大的批準(zhǔn)治療劑量也不能足夠減輕某些疼痛狀態(tài)中的疼痛。
神經(jīng)生長因子(NGF)是首先鑒定的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，其在外周和中樞神經(jīng)元的發(fā)育和存活中的角色已被充分表征。已經(jīng)證明NGF是外周交感和胚胎感覺神經(jīng)元和基底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)育中關(guān)鍵的生存和維持因子(Smeyne等，Nature 368246-249(1994)；Crowley等，Cell 761001-1011(1994))。NGF上調(diào)感覺神經(jīng)元中神經(jīng)肽的表達(dá)(Lindsay等，Nature 337362-364(1989))并且其活性通過兩種不同的膜結(jié)合的受體——TrkA酪氨酸激酶受體和p75受體介導(dǎo)，所以受體在結(jié)構(gòu)上與腫瘤壞死因子受體家族的其他成員相關(guān)(Chao等，Science 232518-521(1986))。
除了在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，已日益顯示NGF與神經(jīng)系統(tǒng)外的過程有關(guān)。例如，外源施用的NGF已經(jīng)表現(xiàn)出增強(qiáng)血管通透性(Otten等，Eur.J.Pharmacol.106199-201(1984))，增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答(Otten等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610059-10063(1989))，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化和肥大細(xì)胞增殖和導(dǎo)致從肥大細(xì)胞釋放可溶生物信號(hào)(Matsuda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.856508-6512(1988)；Pearce等，J.Physiol.372379-393(1986)；Bischoff等，Blood 792662-2669(1992)；Horigome等，J.Biol.Chem.26814881-14887(1993))。
NGF是由許多類型的細(xì)胞產(chǎn)生，這些細(xì)胞包括肥大細(xì)胞(Leon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913739-3743(1994))、B淋巴細(xì)胞(Torcia等，Cell 85345-356(1996))、角質(zhì)形成細(xì)胞(Di Marco等，J.Biol.Chem.26822838-22846)、平滑肌細(xì)胞(Ueyama等，J Hypertens.111061-1065(1993))、成纖維細(xì)胞(Lindholm等，Eur.J.Neurosci.2795-801(1990))、支氣管上皮細(xì)胞(Kassel等，Clin.Exp.Allergy 311432-40(2001))、腎系膜細(xì)胞(Steiner等，Am.J.Physiol.261F792-798(1991))及骨骼肌肌管(Schwartz等，J Photochem.Photobiol.B66195-200(2002))。已在神經(jīng)系統(tǒng)外的多種細(xì)胞型上發(fā)現(xiàn)了NGF受體。例如，已在人單核細(xì)胞、T細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞以及肥大細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了TrkA。
在人患者以及若干動(dòng)物模型中觀察到NGF水平增加與多種炎性疾病相關(guān)。這些疾病包括全身性紅斑狼瘡(Bracci-Laudiero等，Neuroreport 4563-565(1993))、多發(fā)性硬化(Bracci-Laudiero等，Neurosci.Lett.1479-12(1992))、牛皮癬(Raychaudhuri等，Acta Derm.l′enereol.7884-86(1998))、關(guān)節(jié)炎(Falcim等，Ann.Rheum.Dis.55745-748(1996))、間質(zhì)性膀胱炎(Okragly等，J.Urology 161438-441(1999))及哮喘(Braun等，Eur.J Immunol.283240-3251(1998))。
同樣，外周組織中NGF水平升高與痛覺過敏及炎癥相關(guān)并在許多關(guān)節(jié)炎形式中觀察到?；碱愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜表達(dá)高水平的NGF，而報(bào)道非炎癥患者的滑膜未檢測到NGF(Aloe等，Arch.Rheum.35351-355(1992))。在實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠中觀察到相似結(jié)果(Aloe等，Clin.Exp.Rheumatol.10203-204(1992))。已報(bào)道在轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠中伴隨肥大細(xì)胞數(shù)量的增加，NGF水平升高(Aloe等，Int.J TissueReactions-Exp.Clin.Aspects 15139-143(1993))。
有兩類用于治療疼痛的藥物，每一類通過不同的機(jī)理作用并且具有不同的效果，但都具有缺點(diǎn)。第一類包括非類固醇抗炎藥(NSAID)，其用于治療輕微疼痛，但是其治療用途受到不利的胃腸道作用的限制，所述胃腸道作用，如長期使用導(dǎo)致胃腐蝕、形成消化性潰瘍或者十二指腸炎癥，和結(jié)腸和腎毒性。第二類包括阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛劑(如嗎啡)，用于治療中度到嚴(yán)重疼痛，但是它們的治療用途由于不利的作用而受到限制，所述不利的作用如便秘、惡心和嘔吐、呼吸抑制、意識(shí)模糊、腎絞痛、對(duì)長期使用的耐受和成癮的危險(xiǎn)。
顯然需要改進(jìn)的疼痛治療，其提供提高的治療益處(例如減小疼痛的嚴(yán)重性和/或頻率)和/或減小許多當(dāng)前的方案導(dǎo)致的不利的副作用的影響。
將本文引用的所有參考文獻(xiàn)(包括專利申請(qǐng)和出版物)完整引入作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明基于NGF拮抗劑聯(lián)合NSAID可有效治療疼痛這一發(fā)現(xiàn)。這種治療導(dǎo)致出人意料地提高疼痛治療。此外，這種治療通常允許用更小的NSAID劑量實(shí)現(xiàn)相同量的疼痛減輕和/或NSAID疼痛治療的其他形式的增強(qiáng)。
一方面，本發(fā)明的特征是治療(或者在其他實(shí)施方案中預(yù)防)疼痛的方法，該方法包括使用一定量的神經(jīng)生長因子拮抗劑和一定量的NSAID使得它們的聯(lián)合提供有效的疼痛減輕。NGF拮抗劑和NSAID的相對(duì)量和比例可以改變。在一些實(shí)施方案中，將施用足夠的NGF拮抗劑以便允許減小實(shí)現(xiàn)相同程度的疼痛減輕所需的NSAID的通常劑量。在一些實(shí)施方案中，將施用足夠的NGF拮抗劑以允許將實(shí)現(xiàn)相同程度的疼痛減輕所需的NSAID的通常劑量減少至少約5％，至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約40％，至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約80％，或至少約90％，或以上。該減少可以反映在給定施用的所施用量和/或給定時(shí)間內(nèi)的施用量(降低頻率)。
另一方面，本發(fā)明提供了增強(qiáng)NSAID疼痛治療的方法，其包括聯(lián)合施用有效量NSAID與有效量的NGF拮抗劑。如本文所用的聯(lián)合施用包括同時(shí)施用和/或在不同時(shí)間施用。聯(lián)合施用還包括作為共同制劑(即NGF拮抗劑和NSAID存在(組合)于同一的組合物中)施用和/或作為分離的組合物施用。本文所用“聯(lián)合施用”包括任何情況，其中NSAID和NGF拮抗劑以有效量施用于個(gè)體。如本文進(jìn)一步討論的，應(yīng)當(dāng)理解NGF拮抗劑和NSAID可以以不同的給藥頻率和/或間隔施用。例如，抗NGF抗體可以每周施用，而NSAID可以更頻繁地施用。可以理解NGF拮抗劑和NSAID可以經(jīng)相同的施用途徑或者不同施用途徑施用，并且在施用期間可以更換不同的給藥方案?？梢栽谔弁窗l(fā)作前施用。
另一方面，本發(fā)明提供了在個(gè)體中減小疼痛的發(fā)生、減輕疼痛、緩解疼痛和/或延遲疼痛的發(fā)生或進(jìn)展的方法，所述方法包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑與有效量的NSAID。
本發(fā)明的方法適于治療或防止任何病原學(xué)的任何疼痛，其中包括通常使用NSAID治療的疼痛。在一些實(shí)施方案中，疼痛為手術(shù)后疼痛。在一些實(shí)施方案中，疼痛為與燒傷有關(guān)的疼痛。在其他實(shí)施方案中，疼痛為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛。在其他實(shí)施方案中，疼痛為與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛。
適宜用于本發(fā)明的方法的NGF拮抗劑是可以直接或間接導(dǎo)致NGF生物活性降低的任何試劑。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合(生理性相互作用)NGF(例如抗體)，結(jié)合NGF受體(如trkA受體和/或p75)和/或降低(阻礙和/或阻斷)下游NGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如靶細(xì)胞中NGF誘導(dǎo)的激酶信號(hào)或者其他下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑)。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑抑制(降低)NGF合成和/或釋放。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑降低NGF受體TrkA和/或p75的表達(dá)或功能。在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑是不為TrkA免疫黏附素(即TrkA免疫黏附素之外)的NGF拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑選自下面的任何一種或多種抗NGF抗體、針對(duì)編碼NGF的核酸的反義分子(包括針對(duì)編碼NGF的核酸的反義分子)、針對(duì)NGF受體(如TrkA和/或p75)的反義分子、NGF抑制化合物、NGF結(jié)構(gòu)類似物、結(jié)合NGF的TrkA和/或p75受體的顯性失活突變體、抗TrkA抗體、抗p75抗體和激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)結(jié)合NGF(如hNGF)并且不顯著結(jié)合相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，如NT-3、NT4/5和/或BDNF。在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑為抗NGF抗體。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體特異結(jié)合NGF。在其它實(shí)施方案中，抗NGF受體識(shí)別人NGF。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體特異結(jié)合人NGF。在其他實(shí)施方案中，該抗體與選自MAb911、MAb912和MAb938(見Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))的一種或多種抗體結(jié)合基本上相同的NGF表位6。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體經(jīng)人源化(包括人源化Mab 911，如本文描述的抗體E3)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體為抗體E3(如本文描述)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有抗體E3的一個(gè)或多個(gè)CDR(E3的1、2、3、4、5個(gè)CDR或如在一些實(shí)施方案中，為所有6個(gè)CDR)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體為人的。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有表1中所示的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和表2中所示的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有表1中所示的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有表2中所示的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。在其他實(shí)施方案中，所述抗體含有修飾的恒定區(qū)，如免疫惰性的恒定區(qū)，如不引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解，或者不刺激依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。在其他實(shí)施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624；PCT申請(qǐng)No.PCT/GB99/01441和/或UK專利申請(qǐng)No.9809951.8中描述的修飾恒定區(qū)。
在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF分子。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑為特異結(jié)合NGF的抗體。然而，NGF拮抗劑也可以結(jié)合trkA受體。NGF拮抗劑可以是抗人NGF(抗hNGF)單克隆抗體，其能夠結(jié)合hNGF并有效抑制hNGF與人TrkA(hTrkA)的結(jié)合。
抗NGF抗體與NGF(如hNGF)的結(jié)合親和力可以為約0.10nM到約0.80nM，約0.15到約0.75nM和約0.18到約0.72nM。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約2pM到22pM。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約10nM到。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為低于約10nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約0.1nM或約0.07nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為低于約0.1nM或者低于約0.07nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約500pM、約100pM之一，或者約50pM到約2pM、約5pM、約10pM、約1nM、約15pM、約20pM、約40pM、約50pM之一。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、或約50pM之一，或低于約50pM。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為低于約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、或約50pM之一。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM、或高于約40pM。如本領(lǐng)域中熟知的，結(jié)合親和力可以表達(dá)為KD或者解離常數(shù)，增加的結(jié)合親和力相應(yīng)于降低的KD?？筃GF小鼠單克隆抗體911(Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))與人NGF的結(jié)合親和力為約10nM，人源化抗NGF抗體E3(本文描述)與人NGF的結(jié)合親和力為約0.07nM。
當(dāng)NGF拮抗劑為抗體時(shí)，抗體可以為抗體片段，包括選自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、雙抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體和單鏈Fv(scFv)分子的抗體片段。
NSAID可以為非類固醇抗炎化合物。將NSAID通過它們抑制環(huán)加氧酶的能力分類。環(huán)加氧酶1和環(huán)加氧酶2是環(huán)加氧酶的兩種主要的同種型，多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)NSAID是兩種同種型的混合抑制劑。多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)NSAID屬于下面的5種結(jié)構(gòu)類別之一(1)丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、消痛靈、雙氯酚酸鈉，和酮基布洛芬；(2)乙酸衍生物，如托美汀和slindac；(3)芬那酸(fenamicaicid)衍生物，如甲芬那酸和甲氯酚那酸；(4)聯(lián)苯羧酸衍生物，如二氟尼柳和氟苯沙酸；和(5)oxicam，如piroxim，噻氧噻嗪和伊索昔康。
已經(jīng)描述了選擇性抑制環(huán)加氧酶2的另一類別的NSAID。Cox-2抑制劑已經(jīng)在例如美國專利No.5,616,601、5,604,260、5,593,994、5,550,142、5,536,752、5,521,213、5,475,995、5,639,780、5,604,253、5,552,422、5,510,368、5,436,265、5,409,944和5,130,311中有所描述，所有這些文獻(xiàn)在此引入為參考。某些代表性COX-2抑制劑包括塞來昔布(SC-58635)、羅非克西、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、MK-966、nabumetone(6-MNA的前藥)、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614或者它們的組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，其中阿司匹林和/或acetominophen與NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)聯(lián)合使用。
NGF拮抗劑和/或NSAID可以通過任何適宜的途徑施用于個(gè)體。例如，它們可以一起或者分開和/或同時(shí)和/或依次地經(jīng)口、靜脈內(nèi)、舌下、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、直腸、脊柱內(nèi)、胸內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、舌下、透皮或者通過吸入施用。施用可以是全身性的(例如靜脈內(nèi))或者局部的。
另一方面，本發(fā)明的特征是含有神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID的組合物。神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID可以與一種或多種可藥用載體或者賦形劑一起存在，或者它們可以存在于單獨(dú)的組合物中。在另一方面，本發(fā)明提供了NGF拮抗劑和NSAID的增效組合物。
第三方面，本發(fā)明的特征是用于本文公開的任一種方法的試劑盒，所述試劑盒含有NGF拮抗劑和NSAID。該試劑盒可含有關(guān)于本文公開的任一種方法的說明書。所述說明書可以包括NGF拮抗劑(如抗NGF-抗體)與NSAID聯(lián)合施用(即同時(shí)施用和/或在不同時(shí)間施用)。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑和NSAID包裝在一起，但是它們可以在也可以不在同一的容器中。從而，在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有存在于同一容器中的NGF拮抗劑和NSAID和關(guān)于本文公開的任一種方法的說明書。在其他實(shí)施方案中，試劑盒含有存在于單獨(dú)的容器中的NGF拮抗劑和NSAID。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療個(gè)體疼痛的方法，其包括對(duì)個(gè)體施用有效量的抗神經(jīng)生長因子(NGF)抗體和NSAID。在一些實(shí)施方案中，NSAID選自布洛芬、萘普生、消痛靈、雙氯酚酸鈉、酮基布洛芬、托美汀、slindac、甲芬那酸、甲氯芬那酸、二氟尼柳、氟苯沙酸、piroxim、噻氧噻嗪、伊索昔康、塞來昔布、羅非克西、DUP-697、氟舒胺、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸、MK-966、nabumetone、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614。在一些實(shí)施方案中，NSAID是布洛芬。在一些實(shí)施方案中，抗NGF抗體以約10nm或低于約10nm的親和力結(jié)合人NGF。在一些實(shí)施方案中，抗NGF抗體為人抗體。在一些實(shí)施方案中，抗NGF抗體為人源化抗體。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體為含有SEQ ID NO1中所示重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO2中所示輕鏈可變區(qū)的抗體。在一些實(shí)施方案中，疼痛為手術(shù)后疼痛。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療疼痛的藥物組合物，其含有有效量抗NGF抗體和NSAID和可藥用載體。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療疼痛的試劑盒，其含有抗NGF抗體、NSAID、關(guān)于聯(lián)合施用抗NGF抗體與NSAID以治療疼痛的說明書。
附圖簡述

圖1闡明在用10或30mg/kg S[+]布洛芬聯(lián)合NGF拮抗劑(抗NGF拮抗劑Mab 911；見Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))治療的動(dòng)物中累積疼痛得分減少了。將動(dòng)物分成兩組(對(duì)照和抗體治療的)。在手術(shù)前15小時(shí)以1mg/kg劑量腹膜內(nèi)施用NGF拮抗劑(時(shí)間＝-15小時(shí))。在時(shí)間0如所描述的實(shí)施手術(shù)。手術(shù)后24小時(shí)(圖中“0”)評(píng)估靜息疼痛(resting pain)。然后用布洛芬(以300mg/ml于45％β-環(huán)糊精液體中)以10mg/kg或者30mg/kg體重治療所有動(dòng)物。非抗體治療的對(duì)照動(dòng)物也用10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg、和300mg/kg布洛芬治療。布洛芬在頸背皮下遞送。布洛芬劑量后1小時(shí)，檢查靜息疼痛。用抗NGF抗體拮抗劑加布洛芬的治療比僅用布洛芬或者抗NGF抗體拮抗劑治療在減輕靜息疼痛中更有效。
圖2是顯示用5mg/kg雙氯酚酸鈉聯(lián)合NGF拮抗劑(抗NGF抗體Mab 911；見Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))治療的動(dòng)物中累積疼痛得分圖。將動(dòng)物分成兩組(對(duì)照和抗體治療的)。在手術(shù)前15小時(shí)以1mg/kg劑量腹膜內(nèi)施用NGF拮抗劑(時(shí)間＝-15小時(shí))。在時(shí)間0如所描述的實(shí)施手術(shù)。手術(shù)后24小時(shí)(圖中“0”)評(píng)估靜息疼痛。然后用雙氯酚酸鈉以5mg/kg治療所有動(dòng)物。非抗體治療的對(duì)照動(dòng)物也用5mg/kg治療。雙氯酚酸鈉在頸背皮下遞送。布洛芬劑量后1小時(shí)，檢查靜息疼痛。
發(fā)明詳述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和NSAID可以預(yù)防或者治療疼痛。本發(fā)明的方法和組合物可用于治療或者預(yù)防疼痛，其中包括通常使用NSAID治療的任何疼痛。根據(jù)本發(fā)明，通過聯(lián)合使用神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID，現(xiàn)在可以用更低劑量的NSAID治療疼痛，從而減小與NSAID治療有關(guān)的副作用的可能性。在一些實(shí)施方案中，將施用足夠NGF拮抗劑以允許將實(shí)現(xiàn)相同程度的疼痛減輕所需的NSAID的通常劑量減小至少約5％，至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約90％，或以上。
如本文所述，聯(lián)合施用NSAID與NGF拮抗劑還可以加強(qiáng)NSAID對(duì)疼痛的治療。
一方面，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防個(gè)體(如哺乳動(dòng)物，包括人和非人類)疼痛的方法，包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑與有效量的NSAID。另一方面，本發(fā)明提供了加強(qiáng)個(gè)體中NSAID治療或者預(yù)防疼痛的方法，該方法包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)與有效量的NSAID。另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、減輕疼痛和/或防止疼痛發(fā)展或進(jìn)展的方法。
在一些實(shí)施方案中，抗NGF抗體能夠結(jié)合NGF并有效抑制NGF在體內(nèi)與其TrkA或者p75受體的結(jié)合或者有效抑制NGF活化其TrkA或者p75受體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與NGF的結(jié)合親和力為約0.01到約1.00nM，或約0.05nM到約0.25nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約0.1nM或約0.07nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約1pM、約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約50pM、約100pM，或以上。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約2pM到22pM。在一些實(shí)施方案中，該抗體與選自MAb911、MAb912和MAb938的一種或多種抗體基本上相同地結(jié)合NGF表位6。見Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)。
抗體可以為抗體片段，如選自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、雙抗體、單鏈抗體分子和抗體片段形成的多特異性抗體和單鏈Fv(scFv)分子的一種或多種抗體片段。所述抗體還可以是嵌合的，其可以是人源化或人的。所述抗體還可以是雙特異性的。
可用于本發(fā)明的代表性NSAIDs包括(但不限于)(1)丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、消痛靈、雙氯酚酸鈉和酮基布洛芬；(2)乙酸衍生物，如托美汀和slindac；(3)芬那酸衍生物，如甲芬那酸和甲氯酚那酸；(4)聯(lián)苯羧酸衍生物，如二氟尼柳和氟苯沙酸；和(5)oxicam，如piroxim、噻氧噻嗪和伊索昔康。已經(jīng)描述了另一類別的NSAID，其選擇性抑制環(huán)加氧酶2。Cox-2抑制劑已經(jīng)在例如美國專利No.5,616,601、5,604,260、5,593,994、5,550,142、5,536,752、5,521,213、5,475,995、5,639,780、5,604,253、5,552,422、5,510,368、5,436,265、5,409,944和5,130,311中有所描述，所有這些文獻(xiàn)在此引入為參考。某些代表性COX-2抑制劑包括塞來昔布(SC-58635)、羅非克西、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、MK-966、nabumetone(6-MNA的前藥)、尼美舒利、NS-398、SC-5766，SC-58215、T-614，或者它們的組合。在一些實(shí)施方案中，阿司匹林和/或acetominophen與NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)聯(lián)合使用。
本發(fā)明的方法和組合物可用于治療任何病原學(xué)的疼痛，包括急性及慢性疼痛、任何具炎性成分的疼痛，和其中通常使用NSAID治療的任何疼痛。疼痛的實(shí)例包括外科手術(shù)后疼痛、手術(shù)后疼痛(包括牙痛)、偏頭痛、頭痛及三叉神經(jīng)痛及與燒傷、創(chuàng)傷或腎結(jié)石相關(guān)疼痛、與外傷相關(guān)疼痛(包括外傷性顱腦損傷)、神經(jīng)性疼痛、與肌-骨骼疾病相關(guān)的疼痛，這些疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、內(nèi)臟痛、大腸炎、胰腺炎、胃炎、強(qiáng)直性脊柱炎、血清陰性(非類風(fēng)濕)關(guān)節(jié)病、非關(guān)節(jié)性風(fēng)濕病及關(guān)節(jié)周病癥，以及與癌癥相關(guān)的疼痛(包括“突破疼痛(break-through pain)”及與晚期癌癥相關(guān)的疼痛)、外周神經(jīng)病及皰疹后神經(jīng)痛和與鐮刀形細(xì)胞危象相關(guān)的疼痛。具炎性成分的疼痛的實(shí)例(除以上描述的一些外)包括風(fēng)濕性疼痛、與粘膜炎及痛經(jīng)相關(guān)的疼痛。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療或預(yù)防手術(shù)后疼痛和/或癌癥疼痛。在其他實(shí)施方案中，疼痛為通常不使用NSAID治療的疼痛適應(yīng)癥，如神經(jīng)性疼痛。在其他實(shí)施方案中，本文描述的方法和組合物可用于治療和/或預(yù)防與燒傷有關(guān)的疼痛。在其他實(shí)施方案中，本文描述的方法和組合物可用于治療和/或預(yù)防與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疼痛。在其他實(shí)施方案中，本文描述的方法和組合物可用于治療和/或預(yù)防與骨關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疼痛。
另一方面，本發(fā)明提供了用于治療疼痛的試劑盒，其含有適用于本文描述的任何方法的NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和NSAID。
一般技術(shù)除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐將使用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中詳細(xì)解釋，如《Molecular CloningA LaboratoryManual》，第二版，(Sambrook等，1989)Cold Spring Harbor Press；《Oligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait編，1984)；《Methods in MolecularBiology》，Humana Press；《Cell BiologyA Laboratory NOtebook》(J.E.Cellis編，1998)Academic Press；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney編，1987)；《Introduction to Cell and Tissue Culture》(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；《Cell and Tissue CultureLaboratoryProcedures》(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.GNewell，編1993-1998)J.Wiley和Sons；《Methods in Enzymology》(Academic Press，Inc.)；《Handbookof Experimental Immunology》(D.M.Weir和C.C.Blackwell編)；《GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells》(J.M.Miller和M.P.Calos編，1987)；《Current Protocols in Molecular Biology》(E M.Ausubel等，編輯，1987)；《PCRThe Polymerase Chain Reaction》(Mullis等，編輯，1994)；《Current Protocols in Immunology》(J.E.Coligan等，編輯，1991)；《ShortProtocols in Molecular Biology》(Wiley和Sons，1999)；《Immunobiology》(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；《Antibodies》(P.Finch，1997)；《Antibodiesa practical approach》(D.Catty，編輯，IRL Press，1988-1989)；《Monoclonal antibodiesa practical approach》(P.Shepherd和C.Dean，編輯，Oxford University Press，2000)；《Using antibodiesa laboratory manual》(E.Harlow和D.Lane，Cold Spring HarborLaboratory Press，1999)；《The Antibodies》(M.Zanetti和J.D.Capra，編輯，Harwood Academic Publishers，1995)。
定義“抗體”(可以以復(fù)數(shù)形式互換使用)為能夠通過位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)特異結(jié)合靶標(biāo)，如碳水化合物、多核苷酸、脂類、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用的，該術(shù)語不僅僅包含完整多克隆或單克隆抗體，也包含其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和含有所需特異抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構(gòu)型?？贵w包括任一類別的抗體，如IgG、IgA或IgM(或其亞類)并且不必為任何特定類別的抗體。取決于免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的抗體氨基酸序列，可將免疫球蛋白歸入不同類別。免疫球蛋白主要有五類IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且這些中的幾種可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。相應(yīng)于不同類型免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)及三維構(gòu)型是公知的。
“單克隆抗體”指同質(zhì)抗體群，其中單克隆抗體包含參與選擇性結(jié)合抗原的氨基酸(天然存在或非天然存在的)。單克隆抗體高度特異，針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。術(shù)語“單克隆抗體”不僅僅包括完整單克隆抗體及全長單克隆抗體，也包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、和含有所需特異抗原識(shí)別位點(diǎn)且能夠結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子的任何其他經(jīng)修飾的構(gòu)型?？贵w的來源或抗體制備的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等)不受限制。
“人源化”抗體指具有基本上來源于非人物種的免疫球蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)并且基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列保持該分子的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的分子?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以含有融合到恒定結(jié)構(gòu)域的完整可變結(jié)構(gòu)域或者僅僅含有嫁接到可變結(jié)構(gòu)域中適宜構(gòu)架區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以為野生型或者通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換修飾，例如經(jīng)修飾而更像人免疫球蛋白。人源化抗體的某些形式保留了所有CDR序列(例如含有來自小鼠抗體的所有6個(gè)CDR的人源化小鼠抗體)。人源化抗體的其他形式具有相對(duì)于原初抗體具有改變的一個(gè)或多個(gè)CDR(1、2、3、4、5、6個(gè))。在一些情況中，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基或者其他殘基被相應(yīng)的非人殘基代替。此外，人源化抗體可以含有在受體抗體或者供體抗體中沒有的殘基。
如本文所用的，術(shù)語“神經(jīng)生長因子”和“NGF”指保持NGF的至少部分活性的神經(jīng)生長因子和其變體(包括，例如拼接變體和蛋白質(zhì)加工變體)。如本文所用的，NGF包括所有哺乳動(dòng)物物種(包括人、非人靈長類動(dòng)物、犬、貓、馬或牛)的天然序列NGF。
“NGF受體”指NGF結(jié)合或活化的多肽。NGF受體包括任何哺乳動(dòng)物物種(包括但不限于人、犬、貓、馬、靈長類動(dòng)物或牛)的TrkA受體和p75受體。
“NGF拮抗劑”指阻斷、抑制或降低(包括顯著降低)NGF生物活性的任何分子，NGF生物活性包括由NGF信號(hào)介導(dǎo)的下游途徑，如受體結(jié)合和/或引發(fā)對(duì)NGF的細(xì)胞應(yīng)答。術(shù)語“拮抗劑”不含特異的生物學(xué)作用機(jī)制，并且認(rèn)為顯然包括和包含與NGF的所有可能的藥理學(xué)、生理學(xué)或生物化學(xué)相互作用，其可以是與直接或間接的，或者與NGF、其受體相互作用，或者通過另一機(jī)理，該術(shù)語還包括可通過多種不同的、化學(xué)上相異的組分實(shí)現(xiàn)的所述機(jī)制的結(jié)果。代表性NGF拮抗劑包括(但不限于)抗NGF抗體、針對(duì)NGF的反義分子(包括針對(duì)編碼NGF核酸的反義分子)、NGF抑制化合物、NGF結(jié)構(gòu)類似物、結(jié)合NGF的TrkA受體的顯性失活突變體、TrkA免疫黏附素、抗TrkA抗體、抗p75抗體、針對(duì)TrkA和/或p75受體之一或兩者的反義分子(包括針對(duì)編碼TrkA或p75的核酸分子的反義分子)和激酶抑制劑。對(duì)于本發(fā)明，應(yīng)明確理解術(shù)語“拮抗劑”包含所有前述定義的術(shù)語、標(biāo)題、功能狀態(tài)及特征，從而NGF自身、NGF生物活性(包括但不限于它介導(dǎo)疼痛的任何方面的能力)或生物活性的結(jié)果在任何有意義程度上被實(shí)質(zhì)性無效、降低或中和。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合(物理上相互作用)NGF(例如抗體)、結(jié)合NGF受體(如trkA受體或p75受體)、降低(阻礙和/或阻斷)下游NGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或抑制(降低)NGF合成、產(chǎn)生和釋放。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合(物理上相互作用)NGF(例如抗體)、結(jié)合NGF受體(如TrkA受體和/或p75受體)、和/或降低(阻礙和/或阻斷)下游NGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF并阻止TrkA受體二聚化和/或TrkA自身磷酸化。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑抑制或降低NGF合成和/或產(chǎn)生(釋放)。本文提供各類型NGF拮抗劑的實(shí)例。
如本文所用的，“抗NGF抗體”指能夠結(jié)合NGF并抑制NGF生物活性和/或NGF信號(hào)介導(dǎo)的下游途徑的抗體。
“TrkA免疫黏附素”指含有TrkA受體的片段(例如TrkA受體的胞外結(jié)構(gòu)域)和免疫球蛋白序列的可溶性嵌合分子，其保持TrkA受體的結(jié)合特異性。
NGF的“生物活性”通常指結(jié)合NGF受體和/或活化NGF受體信號(hào)途徑的能力。不加限制，生物活性包括下面的一種或多種結(jié)合NGF受體(如p75和/或TrkA)的能力；促進(jìn)TrkA受體二聚化和/或自身磷酸化的能力；活化NGF受體信號(hào)途徑的能力；促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、存活、生長和細(xì)胞生理學(xué)中的其他改變，包括(對(duì)于神經(jīng)元，包括外周和中樞神經(jīng)元)神經(jīng)元形態(tài)的改變、突觸發(fā)生、突觸功能、神經(jīng)遞質(zhì)和/或神經(jīng)肽釋放損傷后再生的能力和介導(dǎo)疼痛的能力。
術(shù)語“表位”用于指抗原(如蛋白質(zhì)抗原)上的(單克隆或多克隆)抗體結(jié)合位點(diǎn)。
如本文所用的，“治療”是得到有益或所希望的臨床結(jié)果的方法。對(duì)于本發(fā)明，有益或所希望的臨床結(jié)果包括(但不限于)下面的一種或多種疼痛的任何方面的改善或減輕，包括急性、慢性、炎性、神經(jīng)性、或手術(shù)后疼痛。對(duì)于本發(fā)明，有益的或所希望的臨床結(jié)果包括(但不限于)一個(gè)或多個(gè)以下內(nèi)容包括降低嚴(yán)重度、減輕一種或多種與疼痛(包括疼痛的任何方面)相關(guān)的癥狀(如縮短疼痛持續(xù)時(shí)間和/或降低疼痛敏感性或感覺)。
疼痛“降低的發(fā)生”指任何降低的嚴(yán)重性(可包括降低對(duì)通常用于此狀況的其它藥物和/或治療劑的需要和/或量(例如暴露于其它藥物和/或治療劑))、持續(xù)時(shí)間和/或頻率(包括例如在個(gè)體中延遲或增加到達(dá)疼痛的時(shí)間)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，不同個(gè)體對(duì)治療的反應(yīng)可發(fā)生變化，并且同樣，例如“在個(gè)體中降低疼痛發(fā)生的方法”反映了聯(lián)合施用本文描述的NGF拮抗劑和本文描述的NSAID，這是基于合理預(yù)期該使用可能導(dǎo)致該具體個(gè)體中這類的疼痛發(fā)生降低。
“緩解”疼痛或疼痛的一種或多種癥狀表示與不聯(lián)合施用NGF拮抗劑與NSAID相比，疼痛的一種或多種癥狀的減輕或改善?！熬徑狻币舶s短或降低癥狀的持續(xù)時(shí)間。
“減輕”疼痛或疼痛的一種或多種癥狀表示在用根據(jù)本發(fā)明的NGF拮抗劑聯(lián)合NSAID治療的個(gè)體中或個(gè)體群中，降低疼痛的一種或多種不希望的臨床表現(xiàn)的程度。
如本文所用的，“延遲”疼痛的發(fā)展表示推遲、阻礙、減慢、阻止、穩(wěn)定和/或延遲疼痛的進(jìn)程。取決于病史和/或所治療個(gè)體，此延遲的時(shí)間長度可變化。如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，足夠的或顯著的延遲可起到包括預(yù)防在內(nèi)的作用，以致個(gè)體不發(fā)生疼痛。與不用此方法相比，“延遲”癥狀發(fā)展的方法為在給定期限降低癥狀發(fā)展可能性和/或在給定期限降低癥狀程度的方法。這些比較一般基于用統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著數(shù)量受試者的臨床研究。
疼痛的“發(fā)展”或“進(jìn)展”指疾病的最初表現(xiàn)和/或隨后發(fā)展。可以用本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)檢測和評(píng)估疼痛的進(jìn)展。然而，發(fā)展也指檢測不到的進(jìn)展。關(guān)于本發(fā)明，發(fā)展或進(jìn)展指癥狀的生物學(xué)過程?！鞍l(fā)展”包括發(fā)生、復(fù)發(fā)和發(fā)作。本文所用的疼痛的“發(fā)作”或“發(fā)生”包括最初的發(fā)作和/或復(fù)發(fā)。
“有效量”為足以引起有利或期望臨床結(jié)果(包括減輕或降低疼痛感覺)的量。對(duì)于本發(fā)明，NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和NSAID的有效量包括足以治療、減輕、減小任何類型的疼痛(包括急性、慢性、炎性、神經(jīng)性或者手術(shù)后疼痛)的強(qiáng)度或預(yù)防疼痛(包括傷害感受和疼痛的感覺)的量。在一些實(shí)施方案中，NSAID和NGF拮抗劑的有效量為能夠?qū)?duì)外部刺激的敏感性閾值調(diào)節(jié)到與健康受試者中觀察到的水平相當(dāng)?shù)腘GF拮抗劑和NSAID的量。在其他實(shí)施方案中，該水平可以不與健康受試者中觀察到的相當(dāng)，但是與未接受聯(lián)合治療的相比降低了。NGF拮抗劑的有效量還包括足以加強(qiáng)如本文所述的疼痛的NSAID治療(治療效果)或者減小如本文所述的治療或預(yù)防疼痛所需的NSAID劑量的NGF拮抗劑量。如本領(lǐng)域中理解的，NGF拮抗劑聯(lián)合NSAID的有效量可以根據(jù)如疼痛類型(和患者病史以及其他因素，如所用的NGF拮抗劑和/或NSAID的類型(和/或劑量))而變。在本發(fā)明上下本文，有效量可以是實(shí)現(xiàn)增效所需的NGF拮抗劑和NSAID拮抗劑的量。在本發(fā)明上下本文拮抗劑的有效量通常指足以導(dǎo)致NSAID對(duì)于疼痛的治療效果增強(qiáng)(其又可以指減少的劑量和/或觀察到某種其他有益效果)和/或?qū)е屡c僅使用NSAID治療相比的有益效果的量。NGF拮抗劑的“有效量”還可以導(dǎo)致與僅使用施用NGF拮抗劑或NSAID相比的增效作用。
“個(gè)體”為脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括(但不限于)飼養(yǎng)動(dòng)物、變種動(dòng)物(sport animal)、寵物、靈長類動(dòng)物、馬、奶牛、狗、貓、小鼠和大鼠。
術(shù)語“NSAID”指非類固醇抗炎化合物。通過NSAIDs抑制環(huán)加氧酶的能力將它們分類。環(huán)加氧酶1和環(huán)加氧酶2是環(huán)加氧酶的兩種主要的同種型，多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)NSAID是兩種同種型的混合抑制劑。多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)NSAID屬于下面的5種結(jié)構(gòu)類別之一(1)丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、消痛靈、雙氯酚酸鈉，和酮基布洛芬；(2)乙酸衍生物，如托美汀和slindac；(3)芬那酸衍生物，如甲芬那酸和甲氯酚那酸；(4)聯(lián)苯羧酸衍生物，如二氟尼柳和氟苯沙酸；和(5)oxicam，如piroxim，噻氧噻嗪、和伊索昔康。
已經(jīng)描述了另一類別的NSAID，其選擇性抑制環(huán)加氧酶2。Cox-2抑制劑已經(jīng)在例如美國專利No.5,616,601、5,604,260、5,593,994、5,550,142、5,536,752、5,521,213、5,475,995、5,639,780、5,604,253、5,552,422、5,510,368、5,436,265、5,409,944和5,130,311中有所描述，引用所有這些文獻(xiàn)作為參考。某些代表性COX-2抑制劑包括塞來昔布(SC-58635)、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、羅非克西、MK-966、nabumetone(6-MNA的前藥)、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614；或者它們的組合。
在一些實(shí)施方案中，阿司匹林和/或acetominophen與NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)聯(lián)合使用。阿司匹林是另一類非類固醇抗炎化合物。
本文所用“聯(lián)合”施用包括同時(shí)施用和/或在不同時(shí)間施用。聯(lián)合施用還包括作為共同制劑施用(即NGF拮抗劑和NSAID存在于同一組合物中)或者作為單獨(dú)組合物施用。本文所用聯(lián)合施用包括將NSAID和NGF拮抗劑施用于個(gè)體的任何情況，該施用可以同時(shí)和/或分開進(jìn)行。如本文進(jìn)一步討論的，可以理解NGF拮抗劑和NSAID可以不同的給藥頻率或者間隔施用。例如，抗NGF抗體可以每周施用，而NSAID可以更頻繁地施用。應(yīng)當(dāng)理解可以使用相同或不同的施用途徑施用NGF拮抗劑和NSAID。
“手術(shù)后疼痛”(可交互稱為“切開后”或者“創(chuàng)傷后疼痛”)指是指外傷如個(gè)體組織中切口、穿刺、切割、撕破或創(chuàng)傷引起或?qū)е碌奶弁?包括無論是侵襲性或非侵襲性的所有外科程序引起的疼痛)。如本文所用的，手術(shù)后疼痛不包括無外部身體創(chuàng)傷發(fā)生(引起或引發(fā))的疼痛。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)后疼痛為內(nèi)部或外部(包括外周)疼痛，并且創(chuàng)傷、切口、外傷、撕傷或切割可偶然(如外傷性創(chuàng)傷)或故意(如外科切口)發(fā)生。如本文所用的，“疼痛”包括疼痛的傷害感受及感覺，并且疼痛可用疼痛分?jǐn)?shù)及其它本領(lǐng)域公知的方法客觀及主觀的評(píng)估。如本文所用的，手術(shù)后疼痛包括異常性疼痛(即對(duì)正常非有害刺激反應(yīng)增強(qiáng)(即有害感受))及痛覺過敏(即對(duì)正常有害或不愉快刺激反應(yīng)增強(qiáng))，其本質(zhì)上又可為熱或機(jī)械(觸覺)的。在一些實(shí)施方案中，疼痛的特征為熱敏感性、機(jī)械敏感性和/或靜息疼痛。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)后疼痛包含經(jīng)機(jī)械誘導(dǎo)疼痛或靜息疼痛。在其它實(shí)施方案中，手術(shù)后疼痛包含靜息疼痛當(dāng)NSAID治療的一方面提高(與施用NSAID而不施用NGF拮抗劑相比)時(shí)，疼痛的NSAID治療“加強(qiáng)”了。例如，相對(duì)于不存在NGF拮抗劑時(shí)NSAID的功效，存在NGF拮抗劑時(shí)NSAID治療疼痛的功效增強(qiáng)了。作為另一個(gè)實(shí)例，當(dāng)該使用允許更好地疼痛減輕時(shí)(例如，當(dāng)使用的NASIAD的劑量不能有效治療或者防止疼痛時(shí))，通過聯(lián)合使用NGF拮抗劑與NSAID可以“增強(qiáng)”用NSAID對(duì)疼痛的治療或者預(yù)防。
本發(fā)明方法關(guān)于本文所描述的所有方法，對(duì)NGF拮抗劑和NSAIDs的參考還包括含有一種或多種這些試劑的組合物。本發(fā)明可用于治療個(gè)體的疼痛，所述個(gè)體包括所有哺乳動(dòng)物，包括人和非人類。
一方面，本發(fā)明提供了治療個(gè)體疼痛的方法，其包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)與有效量的NSAID。在一些實(shí)施方案中，將施用足夠NGF拮抗劑以允許將實(shí)現(xiàn)相同程度的疼痛減輕所需的NSAID的通常劑量減少至少約5％，至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約80％，或至少約90％，或90％以上。
另一方面，本發(fā)明提供了增強(qiáng)NSAID治療個(gè)體疼痛的方法，其包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑與有效量的NSAID。
在一些實(shí)施方案中，疼痛包括下面的任何一種或多種急性和/或慢性疼痛、任何具炎性成分的疼痛、手術(shù)后疼痛(包括牙痛)、偏頭痛、頭痛及三叉神經(jīng)痛及與燒傷、創(chuàng)傷或腎結(jié)石相關(guān)疼痛、與外傷相關(guān)疼痛(包括外傷性顱腦損傷)、神經(jīng)性疼痛、與鐮刀形細(xì)胞危象有關(guān)的疼痛、與痛經(jīng)或腸功能失調(diào)相關(guān)的疼痛，和與癌相關(guān)的疼痛(包括“突破疼痛”及與晚期癌癥相關(guān)的疼痛)。在其他實(shí)施方案中，疼痛為通常用NSAID(例如布洛芬)治療的任一疼痛。在其他實(shí)施方案中，疼痛為與燒傷相關(guān)的疼痛。在其他實(shí)施方案中，疼痛為與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛。在其他實(shí)施方案中，疼痛為與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛。
另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、減輕和/或防止疼痛發(fā)展或進(jìn)展的方法。從而，在一些實(shí)施方案中，在疼痛事件(如手術(shù))之前施用NGF拮抗劑，如抗NGF抗體和/或NSAID。例如，在可能導(dǎo)致或者處于導(dǎo)致疼痛危險(xiǎn)的活動(dòng)(如外部創(chuàng)傷或者手術(shù))之前30分鐘、1小時(shí)、5小時(shí)、15小時(shí)、24小時(shí)或者甚至更長，如1天、數(shù)天、或者甚至1周、2周、3周或者3周以上施用NGF拮抗劑。
用本領(lǐng)域中公知的方法評(píng)估疼痛的治療或預(yù)防?？梢曰诳陀^測量實(shí)施評(píng)估，如觀察行為，如對(duì)刺激的反應(yīng)、面部表情等。還可以基于主觀測量評(píng)估，如用多種疼痛尺度描述患者的疼痛。見，例如Katz等，Surg ClinNOrth Am.(1999)79(2)231-52；Caraceni等，J Pain Symptom Manage(2002)23(3)239-55。
本領(lǐng)域已良好建立了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛的診斷或評(píng)估?？梢曰诒绢I(lǐng)域中公知的測量實(shí)施評(píng)估，如用多種疼痛尺度表征患者的疼痛。見，例如Katz等，Surg Clin NOrth Am.(1999)79(2)231-52；Caraceni等，J PainSymptom Manage(2002)23(3)239-55。也有用于測量疾病狀態(tài)的常用尺度，如美國大學(xué)類風(fēng)濕病學(xué)(ACR)(Felson等，Arthritis and Rheumatism(1993)36(6)729-740)、健康評(píng)估問卷(HAQ)(Fries等，(1982)J.Rheumatol.9789-793)、Paulus尺度(Paulus等，Arthritis andRheumatism(1990)33477-484)，和關(guān)節(jié)炎影響測量尺度(AIMS)(Meenam等，Arthritis and Rheumatology(1982)251048-1053)。
本領(lǐng)域已良好建立骨關(guān)節(jié)炎的診斷或評(píng)估?？梢曰诒绢I(lǐng)域中公知的測量實(shí)施評(píng)估，如使用多種疼痛尺度表征患者的疼痛。見，例如Katz等，Surg Clin NOrth Am.(1999)79(2)231-52；Caraceni等，J Pain SymptomManage(2002)23(3)239-55。例如，可以用WOMAC移動(dòng)(Ambulation)疼痛尺度(包括，疼痛、僵硬和身體功能)和100mm視覺模擬尺度(VAS)評(píng)估疼痛和評(píng)價(jià)對(duì)治療的反應(yīng)。
應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和NSAID作為單一或者分開的組合物聯(lián)合施用時(shí)，所給的神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID的比例與所希望的效果表現(xiàn)一致。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)生長因子拮抗劑與NSAID的重量比例可以為1∶1。在一些實(shí)施方案中，該比例可以介于約0.001比約1到約1000比約1，約0.01比約1到約100比約1，或者約0.1比約1到約10比約1。也設(shè)想其他比例。
應(yīng)當(dāng)理解用于治療或者預(yù)防疼痛所需的神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID的量將不僅隨著所選的具體化合物或者組合物而變，還隨著施用途徑、所治療的疾病的性質(zhì)，和患者的年齡和狀況而變，并且最終由主治醫(yī)生決定。
NGF拮抗劑本發(fā)明的方法使用NGF拮抗劑，其指阻斷、抑制或者減小(包括顯著地)NGF生物活性的任何分子，NGF生物活性包括NGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的下游途徑，如結(jié)合和/或引起對(duì)NGF的細(xì)胞應(yīng)答的受體。術(shù)語“拮抗劑”不暗含任何生物作用的特定機(jī)理，并且認(rèn)為其顯然包括和包含與NGF的所有可能的藥理學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)相互作用和可以通過多種不同的、化學(xué)上相異的組合物實(shí)現(xiàn)的所述相互作用的結(jié)果。代表性NGF拮抗劑包括(但不限于)抗NGF抗體、多肽(包括含有來源于抗NGF抗體的NGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，例如含有足以結(jié)合NGF的CDR區(qū)域的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽)、針對(duì)NGF的反義分子(包括針對(duì)編碼NGF的核酸的反義分子)、針對(duì)TrkA和/或p75受體的反義分子(包括針對(duì)編碼trkA或者p75的核酸分子的反義分子)、NGF抑制化合物、NGF結(jié)構(gòu)類似物、結(jié)合NGF的TrkA受體的顯性失活突變、TrkA免疫黏附素、抗TrkA抗體、抗p75抗體、和激酶抑制劑。對(duì)于本發(fā)明，應(yīng)明確理解術(shù)語“拮抗劑”包含所有前述定義的術(shù)語、標(biāo)題、功能狀態(tài)及特征，從而NGF自身、NGF生物活性(包括但不限于它介導(dǎo)疼痛的任何方面的能力)或生物活性的結(jié)果在任何有意義程度上被實(shí)質(zhì)性無效、降低或中和。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合(物理上相互作用)NGF(例如抗體)、結(jié)合NGF受體(如trkA受體和/或p75受體)和/或降低(阻礙和/或阻斷)下游NGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合(物理上相互作用)NGF。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF受體(如trkA受體或者p75)。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑降低(阻礙和/或阻斷)下游NGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑)。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑抑制(降低)NGF合成和/或釋放。在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑為TrkA免疫黏附素。在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑不同于抗NGF抗體。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF(如hNGF)并且不顯著結(jié)合相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，如NT-3、NT4/5和/或BDNF。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合人NGF，并且不顯著結(jié)合來自另一脊椎動(dòng)物物種(在一些實(shí)施方案中為哺乳動(dòng)物)的NGF。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合人NGF以及一種或多種來自其它脊椎動(dòng)物物種(在一些實(shí)施方案中為哺乳動(dòng)物)的NGF。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF以及至少一種其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合哺乳動(dòng)物物種(如馬或狗)的NGF，但是不顯著結(jié)合來自另一哺乳動(dòng)物物種的NGF。
抗NGF抗體在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑含有抗NGF抗體。抗NGF抗體應(yīng)該顯示出任何一種或多種下面的特征(a)結(jié)合NGF并抑制NGF生物活性和/或NGF信號(hào)功能介導(dǎo)的下游途徑；(b)治療或者預(yù)防疼痛的任何方面，尤其聯(lián)合NSAID治療或者防止疼痛的任何方面；(c)阻斷或者減弱NGF受體活化(包括trkA受體二聚化和/或自身磷酸化)；(d)增強(qiáng)NGF的清除；(e)增強(qiáng)NSAID對(duì)疼痛的治療。
抗NGF抗體是本領(lǐng)域中公知的，見，例如PCT公布號(hào)W002096458、WO01/78698、WO01/64247、美國專利No.5,844,092、5,877,016和6,153,189；Hongo等，Hybridoma，19215-227(2000)；Cell.Molec.Biol.13559-568(1993)；GenBank登錄號(hào)U39608、U39609、L17078或L17077。
在一些實(shí)施方案中，抗NGF抗體特異結(jié)合NGF。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體經(jīng)人源化(如本文描述的抗體E3)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體為抗體E3(如本文描述)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有抗體E3的一個(gè)或多個(gè)CDR(如1、2、3、4、5個(gè)CDR，或者在一些實(shí)施方案中，含有E3的所有6個(gè)CDR)。在其他實(shí)施方案中，抗體為人抗體。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有表1中所示的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和表2中所示的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQID NO2)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有表1中所示的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有表2中所示的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在其他實(shí)施方案中，所述抗體含有修飾恒定區(qū)，如免疫惰性，即不引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解或者不刺激依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)毒性(ADCC)的恒定區(qū)。在其他實(shí)施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624、PCT申請(qǐng)No.PCT/GB99/01441和/或UK專利申請(qǐng)No.9809951.8中描述的修飾恒定區(qū)。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體為U.S.Ser.No.10/745,775中描述的任何抗體。
在一些實(shí)施方案中，抗NGF抗體為稱作抗體“E3”的人源化小鼠抗NGF單克隆抗體，其含有包含A330P331到S330S331突變的人重鏈IgG2a恒定區(qū)(氨基酸編號(hào)參考野生型IgG2a序列，見Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624)、人輕鏈κ恒定區(qū)和表1和表2中所示的重鏈和輕鏈可變區(qū)。
表1重鏈可變區(qū)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO1)表2輕鏈可變區(qū)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT(SE Q ID NO2)下面的編碼E3重鏈或者E3輕鏈可變區(qū)的多核苷酸于2003年1月8日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
載體Eb.911.3E是編碼表2中所示的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸；載體Eb.pur.911.3E是編碼表2中所示輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，載體Db.911.3E是編碼表1中所示重鏈可變區(qū)的多核苷酸。這些多核苷酸也編碼恒定結(jié)構(gòu)域。
至少有兩種確定CDR的技術(shù)(1)基于種間序列變異性的方法(即Kabat等《Sequences of proteins of Immunological Interest)》(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))和(2)基于抗原-抗體復(fù)合體的晶體學(xué)研究的方法(Chothia等(1989)Nature 342877；Al-lazikani等(1997)J.Molec.Bioi.273927-948))。如本文所用，CDR可以指通過任一方法或者兩種方法組合定義的CDR。
在另一實(shí)施方案中，抗NGF抗體含有抗體E3的一個(gè)或多個(gè)CDR(如1、2、3、4、5個(gè)CDR，或者在一些實(shí)施方案中，含有E3的所有6個(gè)CDR)。CDR區(qū)的確定是本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。CDR可以是Kabat、Chothia，或者Kabat和Chothia的組合。
用于本發(fā)明的抗體可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異綴合抗體、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、和含有所需特異抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構(gòu)型，包括抗體的糖基化變體、抗體的氨基酸序列變體，和共價(jià)修飾的抗體?？贵w可以是鼠、大鼠、人的或者任何其他來源(包括嵌合或人源化抗體)。對(duì)于本發(fā)明，抗體以抑制NGF和/或NGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游途徑的方式與NGF反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體為識(shí)別人NGF上一個(gè)或多個(gè)表位的人抗體。在另一實(shí)施方案中，抗體為識(shí)別人NGF上一個(gè)或多個(gè)表位的小鼠或者大鼠抗體。在另一實(shí)施方案中，抗體識(shí)別選自靈長類、嚙齒類、犬、貓、馬和牛的NGF上的一個(gè)或多個(gè)表位。在另一實(shí)施方案中，所述抗體含有經(jīng)修飾的恒定區(qū)，如免疫惰性，即不引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解或者不刺激依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)的恒定區(qū)?？梢杂妹绹鴮＠鸑o.5,500,362中公開的方法評(píng)估ADCC活性。在其他實(shí)施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624；PCT申請(qǐng)No.PCT/GB99/01441；和/或UK專利申請(qǐng)No.9809951.8中描述的修飾恒定區(qū)。
抗NGF抗體與NGF(如hNGF)的結(jié)合親和力可以為約0.01到約1Nm、約0.05到約0.25nM、約0.10到約0.80nM、約0.15到約0.75nM、約0.18到約0.72nM。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約1pM、約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM或高于約40pM。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約2pM到約22pM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為低于約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM或約10pM。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約10nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為低于約10nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力約0.1nM或者約0.07nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為低于約0.1nM或者低于約0.07nM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、或約50pM之一到約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、或約40pM之一。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、或約50pM之一，或低于約50pM。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合親和力為約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM之一、或高于約40pM。
測定抗體對(duì)NGF的結(jié)合親和力的一種方法是測量該抗體的單功能Fab片段的親和力。為了得到單功能Fab片段，可以用木瓜蛋白酶切割或者重組表達(dá)抗體(例如IgG)。通過表面等離振子共振(BIAcore3000TM表面等離振子共振(SPR)系統(tǒng)BIAcore，INC，Piscaway NJ)，可以確定抗體的抗NGF Fab片段的親和力。根據(jù)供應(yīng)商的說明可以用N-乙基-N’-(3-甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化CM5芯片?？梢詫⑷薔GF稀釋到10mM乙酸鈉(pH4.0)中并以0.005mg/mL的濃度注射到活化的芯片。在各個(gè)芯片通道之間使用不同的流動(dòng)時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)兩種抗原密度范圍用于詳細(xì)動(dòng)力學(xué)研究的100-200反應(yīng)單位(RU)，用于篩選測定法的500-600RU?？梢杂靡掖及贩忾]芯片。再生研究已經(jīng)表明Pierce洗脫緩沖液(產(chǎn)品號(hào)21004，Pierce Biotechnology，Rockford IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物能有效除去結(jié)合的Fab而在200次注射中保持芯片上hNGF的活性。HBS-EP緩沖液(0.01M HEPES，pH7.4，0.15 NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性劑P20)用作BIAcore測定法的運(yùn)行緩沖液。以100μL/分鐘注射1分鐘純化的Fab樣品的連續(xù)稀釋液(1.0-10x估計(jì)的KD)并允許長達(dá)2小時(shí)的解離時(shí)間。通過ELISA和/或SDS-PAGE電泳，使用已知濃度(如通過氨基酸分析確定)的Fab作為標(biāo)準(zhǔn)測定Fab蛋白質(zhì)的濃度。通過使用BIAevaluation程序?qū)?shù)據(jù)擬合1∶1朗繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods Enzyology 699-110)同時(shí)得到動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率(Kon)和解離速率(koff)?？梢砸訩off/kon計(jì)算平衡解離常數(shù)(KD)值。該方案適用于確定抗體對(duì)任何物種的NGF的結(jié)合親和力，所述NGF包括人NGF、另一種脊椎動(dòng)物(在一些實(shí)施方案中為哺乳動(dòng)物)的NGF(如小鼠NGF、大鼠NGF、靈長類NGF)，以及用于使用其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的方案，如相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白NT3、NT4/5和/或BDNF。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合人NGF，并且不顯著結(jié)合來自另一脊椎動(dòng)物物種(在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物)的NGF。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合人NGF以及一種或多種來自其它脊椎動(dòng)物物種(在一些實(shí)施方案中為哺乳動(dòng)物)的NGF。在一些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合NGF并且不與其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(如相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白NT3、NT4/5和/或BDNF)顯著交叉反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合NGF以及至少一種其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合哺乳動(dòng)物物種(如馬或狗)的NGF，但是不顯著結(jié)合另一哺乳動(dòng)物物種的NGF。
表位可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合與選自如Hongo等，Hybridoma，19215-227(2000)中描述的Mab911、MAb912、和MAb 938抗體基本相同的hNGF表位。在另一實(shí)施方案中，所述抗體與MAb 911結(jié)合基本上相同的hNGF表位。還在一實(shí)施方案中，所述抗體與MAb 909結(jié)合基本上相同的hNGF表位(Hongo等，前文)。例如，所述表位可以含有hNGF可變區(qū)1(第23-35位氨基酸)中的K32、K34及E35殘基、hNGF可變區(qū)4(第81-88位氨基酸)中的F79及T81殘基、可變區(qū)4中的H84及K88殘基、hNGF可變區(qū)5(第94-98位氨基酸)與hNGF C端(第111-118位氨基酸)之間的R103殘基、hNGF前可變區(qū)1(第10-23位氨基酸)中的E11殘基、hNGF可變區(qū)2(第40-49位氨基酸)與hNGF可變區(qū)3(第59-66位氨基酸)之間的Y52、hNGF C端中的L112及S113殘基、hNGF可變區(qū)3中的R59及R69殘基、或hNGF前可變區(qū)1中的V18、V20及G23殘基中的一個(gè)或多個(gè)。此外，表位可包含一個(gè)或多個(gè)hNGF的可變區(qū)1、可變區(qū)3、可變區(qū)4、可變區(qū)5、N-端區(qū)域和/或C端區(qū)域。在又一實(shí)施方案中，抗體顯著降低hNGF R103殘基的溶劑可接近性。應(yīng)當(dāng)理解雖然以上描述的表位與人NGF相關(guān)，普通技術(shù)人員可比對(duì)人NGF與其它物種NGF的結(jié)構(gòu)并鑒定這些表位的可能相似物。
一方面，可抑制NGF的抗體(例如人抗體、人源化抗體、小鼠抗體、嵌合抗體)可用表達(dá)全長或部分NGF序列的免疫原制備。另一方面，可使用包含過表達(dá)NGF細(xì)胞的免疫原?？墒褂玫拿庖咴牧硪粚?shí)例為包含全長NGF的NGF蛋白質(zhì)或部分的NGF蛋白質(zhì)。
可用本領(lǐng)域已知的任何方法制備抗NGF抗體。如本文進(jìn)一步描述的，免疫宿主動(dòng)物的途徑及方案與一般用于抗體刺激及產(chǎn)生的已建立的常規(guī)技術(shù)一致。用于產(chǎn)生人及小鼠抗體的一般技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在本文有所描述。
預(yù)計(jì)可操縱包括人的任何哺乳動(dòng)物受試者或其抗體產(chǎn)生細(xì)胞用于產(chǎn)生哺乳動(dòng)物(包括人)雜交瘤細(xì)胞系的基礎(chǔ)。一般地，用一定量的免疫原(包括如本文描述的免疫原)經(jīng)腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)口、皮下、足底內(nèi)和/或皮內(nèi)接種宿主動(dòng)物。
雜交瘤可用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256495-497的一般體細(xì)胞雜交技術(shù)或如通過Buck，D.W.等，In Vitro，18377-381(1982)改進(jìn)的體細(xì)胞雜交技術(shù)從淋巴細(xì)胞及無限增殖化骨髓瘤細(xì)胞制備。在雜交中可應(yīng)用可獲得的骨髓瘤細(xì)胞系，包括(但不限于)X63-Ag8.653及來自美國加利福尼亞圣地亞哥Salk研究所的細(xì)胞分布中心的骨髓瘤細(xì)胞系。大體上，該技術(shù)涉及用融合劑(如聚乙二醇)或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的電手段融合骨髓瘤細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。融合后，將細(xì)胞自融合培養(yǎng)基分離并在選擇生長培養(yǎng)基(如次黃苷-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基)中生長以去除未雜交的親本細(xì)胞。本文描述的添加或未添加血清的任何培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一備選方法，EBV無限增殖化B細(xì)胞可用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的抗NGF單克隆抗體。將雜交瘤擴(kuò)增并亞克隆，并根據(jù)需要通過常規(guī)免疫測定法步驟(例如放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法或熒光免疫測定法)測定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗體源的雜交瘤包含產(chǎn)生NGF特異單克隆抗體或其部分的所有親代雜交瘤衍生物、子代細(xì)胞。
可用公知步驟在體外或體內(nèi)生長產(chǎn)生此類抗體的雜交瘤。根據(jù)需要，可通過常規(guī)免疫球蛋白純化操作(如硫酸銨、凝膠電泳、透析、層析、超濾)，自培養(yǎng)基或體液中分離單克隆抗體。如果存在不需要的活性，可通過例如讓制備物流經(jīng)由附著在固相上的免疫原制備的吸附劑，并將目的抗體自免疫原洗脫或釋放而除去不希望的活性。用人NGF或包含靶氨基酸序列的片段免疫宿主動(dòng)物可產(chǎn)生抗體(例如單克隆抗體)群體，所述靶氨基酸序列綴合有對(duì)將免疫的物種具有免疫原性的蛋白質(zhì)，如匙孔槭血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，所述綴合使用雙功能劑或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或RIN＝C＝NR，其中R及R1為不同烷基。
根據(jù)需要，可對(duì)目的抗NGF抗體(單克隆或多克隆)測序，然后將編碼抗NGF抗體多肽的多核苷酸序列克隆到用于表達(dá)或增殖的載體中。編碼目的抗體的序列可保持在宿主細(xì)胞內(nèi)的載體，然后可擴(kuò)增宿主細(xì)胞并冷凍以便以后使用。在備選方案中，多核苷酸序列可用于遺傳操作以“人源化”抗體或改善抗體的親和力或其它特征。例如，將恒定區(qū)進(jìn)行改造以更類似人恒定區(qū)，以避免如果抗體用于臨床試驗(yàn)及治療時(shí)在人中的免疫應(yīng)答?？赡苄枰z傳操作抗體序列以獲得對(duì)NGF的更大親和力及更大的抑制NGF功效。顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)抗NGF抗體進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)多核苷酸改變且仍保持它對(duì)NGF的結(jié)合能力。
人源化單克隆抗體一般有四個(gè)步驟。它們是(1)確定起始抗體輕鏈及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸及預(yù)測的氨基酸序列；(2)設(shè)計(jì)人源化抗體，即確定在人源化過程中使用哪個(gè)抗體構(gòu)架區(qū)；(3)實(shí)際的人源化方法學(xué)/技術(shù)；以及(4)人源化抗體的轉(zhuǎn)染及表達(dá)。見，例如美國專利No.4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089及6,180,370。
已經(jīng)描述了許多包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)的“人源化”抗體分子，包括具有嚙齒動(dòng)物或經(jīng)修飾嚙齒動(dòng)物V區(qū)域和它們與人恒定結(jié)構(gòu)域融合的相關(guān)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的嵌合抗體。見，例如Winter等，Nature 349293-299(1991)；Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224(1989)；Shaw等，J Immunol.1384534-4538(1987)以及Brown等，Cancer Res.473577-3583(1987)。其它參考文獻(xiàn)描述了在與適當(dāng)人抗體恒定區(qū)融合前，嫁接到人支持構(gòu)架區(qū)(FR)的嚙齒動(dòng)物CDR。見，例如Riechmann等，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)以及Jones等，Nature 321522-525(1986)。另一參考文獻(xiàn)描述了通過重組修飾嚙齒動(dòng)物構(gòu)架區(qū)提供的嚙齒動(dòng)物CDR。見，例如歐洲專利號(hào)公布號(hào)519,596。這些“人源化”分子被設(shè)計(jì)來最小化針對(duì)嚙齒動(dòng)物抗人抗體分子的有害免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答限制這些部分在人受者中治療性應(yīng)用的持續(xù)時(shí)間及功效。例如，可改造抗體恒定區(qū)，使它為免疫惰性(例如不引發(fā)補(bǔ)體裂解)。見，例如PCT/GB99/01441；英國專利申請(qǐng)No.9809951.8。也可應(yīng)用的其它人源化抗體的方法由Daugherty等，Nucl.AcidsRes.192471-2476(1991)以及美國專利No.6,180,377、6,054,297、5,997,867、5,866,692、6,210,671及6,350,861以及PCT公布號(hào)WO01/27160公開。其他方法描述于美國序列No.10/745,775。
在又一備選方案中，可通過用經(jīng)改造以表達(dá)特異人免疫球蛋白的可商業(yè)途徑獲得的小鼠得到完全人抗體。設(shè)計(jì)產(chǎn)生更合意(例如完全人抗體)或更強(qiáng)效免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用于產(chǎn)生人源化或人抗體。此類技術(shù)的實(shí)例為來自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM以及來自Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse及TC Mouse。
顯然盡管上面的討論涉及人源化抗體，但是所討論的一般原理可應(yīng)用于定做用于例如狗、貓、靈長類動(dòng)物、馬和牛的抗體。還顯然可以組合本文描述的人源化抗體的一個(gè)或多個(gè)方面，例如CDR移植、構(gòu)架突變和CDR突變。
在備選方案中，抗體可用本領(lǐng)域已知的任何方法重組制備及表達(dá)。在另一備選方案中，抗體可通過噬菌體展示技術(shù)重組制備。見，例如美國專利No.5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150，以及Winter等，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1994)。備選地，可用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348552-553(1990))自未經(jīng)免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因所有組成成分體外產(chǎn)生人抗體或抗體片段。根據(jù)此技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因框內(nèi)克隆到絲狀噬菌體(如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段在噬菌體顆粒表面展示。由于絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇也導(dǎo)致編碼顯示這些特性的抗體基因的選擇。因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行；綜述見，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3564-571(1993)。若干來源的V基因片段可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature 352624-628(1991)從來自經(jīng)免疫小鼠脾的V基因小隨機(jī)組合文庫中分離了一批不同的抗唑酮抗體?？蓸?gòu)建來自未免疫人供體的V基因所有組成成分以及根據(jù)Mark等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)描述的技術(shù)基本上分離針對(duì)不同抗原(包括自身抗原)的抗體。在天然免疫應(yīng)答中，抗體基因以高速率積累突變(體細(xì)胞高變)。一些導(dǎo)入的變化將賦予更高的親和力，并且在隨后抗原攻擊中優(yōu)選復(fù)制及分化顯示高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞。此天然過程可通過用稱作“鏈改組”的技術(shù)模擬(Marks等，Bio/Technol.10779-783(1992))。在此方法中，通過噬菌體展示獲得的“原初”人抗體的親和力可通過用獲自未免疫供體的V結(jié)構(gòu)域基因的天然存在變體(所有組成成分)所有組成成分依次取代重鏈及輕鏈V區(qū)域基因得到改善。此技術(shù)能夠產(chǎn)生親和力在pM-nM范圍的抗體及抗體片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.212265-2266(1993)描述了制備非常大噬菌體抗體所有組成成分(也稱為“所有文庫之母”)的策略。基因改組也可用于自嚙齒動(dòng)物抗體衍生人抗體，其中人抗體與起始嚙齒動(dòng)物抗體具有相似親和力及特異性。根據(jù)也稱為“表位印記”的方法，用人V結(jié)構(gòu)域基因的所有組成成分取代通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒動(dòng)物抗體的重鏈或輕鏈V結(jié)構(gòu)域基因，產(chǎn)生嚙齒動(dòng)物-人嵌合體?？乖倪x擇導(dǎo)致分離能恢復(fù)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人可變區(qū)，即表位支配(印記)配偶體的選擇。當(dāng)為了替代剩余嚙齒動(dòng)物V結(jié)構(gòu)域重復(fù)此方法時(shí)，得到人抗體(見1993年4月1日公布的PCT專利申請(qǐng)WO 9306213)。不同于通過CDR移植的嚙齒動(dòng)物抗體的常規(guī)人源化，此技術(shù)提供了沒有嚙齒動(dòng)物來源的構(gòu)架或CDR殘基的完全人抗體。顯然盡管上面的討論涉及人源化抗體，但是所討論的一般原理可應(yīng)用于定做用于例如狗、貓、靈長類動(dòng)物、馬和牛的抗體。
可通過首先自宿主動(dòng)物分離抗體及抗體產(chǎn)生細(xì)胞，獲得基因序列并用基因序列在宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中重組表達(dá)抗體而重組制備抗體。其它可用的方法為在植物(例如煙草)或轉(zhuǎn)基因乳(transgenic milk)中表達(dá)抗體序列。已公開了用于在植物或乳中重組表達(dá)抗體的方法。見，例如Peeters等，Vaccine 192756(2001)；Lonberg，N.和D.Huszar Int.Rev.Immunol 1365(1995)；以及Pollock等，J Immunol Methods 231147(1999)。制備抗體衍生物(例如人源化抗體、單鏈抗體等)的方法是本領(lǐng)域已知的。
免疫測定法及流式細(xì)胞分選技術(shù)如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)也可用于分離對(duì)NGF特異的抗體。
抗體可與許多不同的載體結(jié)合。載體可為活性和/或惰性的。公知載體的實(shí)例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、玻璃、天然及修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖及磁體。根據(jù)本發(fā)明的目的，載體的性質(zhì)可為可溶解或不溶解。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道結(jié)合抗體的其它合適載體或能夠用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定結(jié)合抗體的其它合適載體。
用常規(guī)方法(例如，通過使用能特異結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈及輕鏈基因的寡核苷酸探針)易于分離并測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細(xì)胞作為此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞，以在所述重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。也可以修飾DNA，例如，通過用人重鏈及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源鼠序列(Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))或通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的所有或部分編碼序列連接。以那種方式，制備了具有本文抗NGF單克隆抗體結(jié)合專一性的“嵌合”或“雜合”抗體。如本文所描述的，編碼抗NGF抗體拮抗劑(如人源化抗人NGF拮抗劑抗體)的DNA可用于通過所需細(xì)胞遞送和表達(dá)抗NGF抗體拮抗劑。本文進(jìn)一步描述了DNA遞送技術(shù)。
可使用本領(lǐng)域公知的方法表征抗NGF抗體。例如，一種方法是鑒定它結(jié)合的表位，即“表位作圖”。本領(lǐng)域有許多方法用于對(duì)蛋白質(zhì)上表位位置作圖及表征，包括例如在Harlow和Lane，《Using Antibodies，aLaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，紐約，1999一書的第11章中描述的解決抗體-抗原復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)、競爭測定法、基因片段表達(dá)測定法以及基于合成肽的測定法。在額外實(shí)例中，表位作圖可用于確定抗NGF抗體結(jié)合的序列。表位作圖可自多種商業(yè)途徑獲得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15，8219 PHLelystad，荷蘭)。表位可為線性表位，即包含一串氨基酸序列，或通過不一定含于一串序列的氨基酸的三維相互作用形成的構(gòu)象表位。可分離或合成(例如重組合成)不同長度肽(例如至少4-6個(gè)氨基酸長)并用于使用抗NGF抗體的結(jié)合測定法。在另一實(shí)例中，抗NGF抗體結(jié)合的表位可在系統(tǒng)篩選中通過用來自NGF序列的重疊肽并測定抗NGF抗體的結(jié)合進(jìn)行確定。根據(jù)基因片段表達(dá)測定法，編碼NGF的可讀框隨機(jī)或通過特異遺傳構(gòu)建片段化并測定表達(dá)的NGF片段與欲進(jìn)行檢測的抗體的反應(yīng)性。例如，基因片段可通過PCR產(chǎn)生，并在存在放射性氨基酸時(shí)，在體外并譯成蛋白質(zhì)。然后通過免疫沉淀法或凝膠電泳法測定抗體與放射性標(biāo)記NGF片段的結(jié)合。也可通過用在噬菌體顆粒表面展示的隨機(jī)肽序列大文庫(噬菌體文庫)鑒定某些表位。備選地，在簡單結(jié)合測定法中測試重疊肽片段的限定文庫與受試抗體的結(jié)合。在其它實(shí)例中，可進(jìn)行抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域誘變、結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)及丙氨掃描誘變以鑒定表位結(jié)合所需、足夠和/或必需的殘基。例如，可用突變NGF進(jìn)行結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)，其中NGF用來自密切相關(guān)，但抗原性不同的蛋白質(zhì)(如神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族的另一成員)的序列取代(交換)NGF多肽的各種片段。通過評(píng)估抗體與突變體NGF的結(jié)合，可評(píng)估特定NGF片段對(duì)抗體結(jié)合的重要性。
可用于表征抗NGF抗體的另一方法是用已知結(jié)合相同抗原(即NGF上多種片段)的其它抗體的競爭測定法，以確定抗NGF抗體是否結(jié)合與其它抗體相同的表位。競爭測定法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。如在Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)中描述的，可在本發(fā)明競爭測定法中應(yīng)用的抗體實(shí)例包括MAb911、912、938。
其他NGF拮抗劑可以使用抗NGF抗體之外的NGF拮抗劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案種，NGF拮抗劑含有至少一種反義分子，其能夠阻斷或降低功能NGF、或者功能trkA和/或p75受體的表達(dá)。NGF、trkA和p75的核苷酸序列是公知的并且容易從可以公開得到的數(shù)據(jù)庫得到。見，例如Borsani等，Nuc.Acids Res.1990，18，4020；登錄號(hào)NM 002506；Ullrich等，Nature 303821-825(1983)。按常規(guī)制備特異結(jié)合NGF、trkA或p75 mRNA而不與其他多核苷酸交叉反應(yīng)的反義寡核苷酸分子。靶定的代表性位點(diǎn)包括(但不限于)起始密碼子、5’調(diào)節(jié)區(qū)、編碼區(qū)和3’非翻譯區(qū)。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長為約10到100個(gè)核苷酸、約15到50個(gè)核苷酸、為約18到25個(gè)核苷酸，或者更多。寡核苷酸可以含有主鏈修飾，本領(lǐng)域中熟知的硫代磷酸酯鍵、和2’-O糖修飾。見，例如Agrawal和Zhao(1998)，Antisense &Nucleic Acid Drug Development 8,135-139。代表性反義分子包括美國公布號(hào)20010046959中描述的NGF反義分子；還參見http//www.rna-tec.com/repair.htm。
備選地，使用基因敲減法、嗎啉代寡核苷酸、RNAi、或者核酶，本領(lǐng)域中公知的方法可以減小NGF表達(dá)和/或釋放。見，例如Rossi，J.J.等編，《Intracellular Ribozyme ApplicationsPrinciples and Protocols》，Horizon Scientific Press(Duarte，CA，1999)；US 6,506,559、WO02/244321、WO 01/192513、WO 01/29058。
在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑包含至少一種NGF抑制化合物。本文所用的，“NGF抑制化合物”指不同于抗NGF抗體的化合物，其直接或者間接降低、抑制、中和或者消除NGF生物活性。NGF抑制化合物應(yīng)該表現(xiàn)出任何一種或多種下面的特征(a)結(jié)合NGF和抑制NGF生物活性和/或NGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游途徑；(b)治療或者預(yù)防疼痛的任何方面，尤其與NSAID聯(lián)合使用治療或者預(yù)防疼痛的任何方面；(c)阻斷或者降低NGF受體活化(包括trkA受體二聚化和/或自身磷酸化)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(降低)NGF抑制、產(chǎn)生或釋放；(f)增強(qiáng)NSAID的疼痛治療。代表性NGF抑制化合物包括美國公布號(hào)20010046959中描述的小分子NGF抑制劑；如PCT公布號(hào)WO 00/69829中描述的抑制NGF與p75結(jié)合的化合物；如PCT公布號(hào)WO 98/17278中描述的抑制NGF與TrkA/p75結(jié)合的化合物。NGF抑制化合物的額外實(shí)例包括PCT公布號(hào)WO 02/17914、WO 02/20479、美國專利No.5,342,942、6,127,401、和6,359,130中描述的NGF抑制化合物。其他代表性NGF抑制化合物為NGF的競爭性抑制劑。見美國專利No.6,291,247。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備其他小分子NGF抑制化合物。
在一些實(shí)施方案中，NGF抑制化合物結(jié)合NGF。代表性靶(結(jié)合)位點(diǎn)包括(但不限于)結(jié)合TrkA受體和/或p75受體的NGF的部分和與受體結(jié)合區(qū)域相鄰并部分負(fù)責(zé)受體結(jié)合部分的正確的三維形狀的那些NGF的部分。在另一實(shí)施方案中，NGF抑制化合物結(jié)合NGF受體(如TrkA和/或p75)并抑制NGF生物活性。代表性靶位點(diǎn)包括結(jié)合NGF的TrkA和/或p75的那些部分。
在包括小分子的實(shí)施方案中，小分子可以具有約100到20,000道爾頓、500到15,000道爾頓，或者1000到10,000道爾頓之一的分子量?？梢酝ㄟ^商業(yè)途徑獲得小分子文庫?？梢杂帽绢I(lǐng)域中公知的任一方法施用小分子，所述方法包括吸入、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)腸、腸胃外、鼻內(nèi)、或者經(jīng)皮。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)NGF拮抗劑為小分子時(shí)，其將以0.1到300mg/kg患者體重的比率分成1到3次或多次劑量施用。對(duì)于正常體重的成年患者，可以施用每劑1mg到5g。
在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑含有至少一種NGF結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明中“NGF結(jié)構(gòu)類似物”指與NGF的部分具有相似三維結(jié)構(gòu)并且在體外或體內(nèi)生理?xiàng)l件下結(jié)合NGF受體的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，NGF結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合TrkA和/或p75受體。代表性NGF結(jié)構(gòu)類似物包括(但不限于)PCT公布號(hào)WO 97/15593中描述的二環(huán)肽、美國專利No.6,291,247中描述的二環(huán)肽；美國專利No.6,017,878中描述的環(huán)狀化合物；和PCT公布號(hào)WO89/09225中描述的NGF衍生肽?？梢酝ㄟ^NGF受體結(jié)合的分子建模設(shè)計(jì)適宜的NGF結(jié)構(gòu)類似物，例如通過PCT公布號(hào)WO98/06048中描述的方法。NGF結(jié)構(gòu)類似物可以是相同或不同結(jié)構(gòu)的任一需要的組合以得到提高的親和力和生物學(xué)效應(yīng)的單體或二聚體/寡聚體。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有TrkA受體和/或p75受體的至少一種顯性失活突變體的NGF拮抗劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備例如TrkA受體的顯性失活突變體從而該受體將結(jié)合NGF并從而作為捕獲NGF的“接收器”。然而，顯性失活突變體結(jié)合NGF時(shí)將不具有受體的正常生物活性。代表性顯性失活突變體包括(但不限于)下面參考文獻(xiàn)中描述的突變體Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，10884；Eide等，J.Neurosci.1996，16，3123；Liu等，J.Neurosci 1997，17，8749；Klein等，Cell 1990，61，647；Valenzuela等，Neuron 1993，10，963；Tsoulfas等，Neuron 1993，10，975；和Lamballe等，EMBO J.1993，12，3083，這些參考文獻(xiàn)被本文全文引入作為參考。顯性失活突變體可以以蛋白質(zhì)形式或者使顯性失活突變體(例如突變的TrkA受體)在體內(nèi)表達(dá)的表達(dá)載體形式施用?？梢杂帽绢I(lǐng)域中公知的任何方法施用所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體，如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)腸、腸胃外、鼻內(nèi)、經(jīng)皮或者通過吸入施用。例如，表達(dá)載體的施用包括局部或者全身施用，包括注射、經(jīng)口施用、基因槍或者插管施用和局部施用。在另一實(shí)施方案中，將蛋白質(zhì)或者表達(dá)載體直接施用于交感神經(jīng)或者sensory trunk或者神經(jīng)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉表達(dá)載體的施用以得到外源蛋白質(zhì)在體內(nèi)的表達(dá)。見，例如美國專利No.6,436,908、6,413,942、6,376,471。
還可以靶向遞送含有反義多核苷酸、表達(dá)載體或者亞基因組多核苷酸的治療組合物。受體介導(dǎo)的DNA遞送技術(shù)在例如Findeis等，TrendsBiotechnol.(1993)11202；Chiou等，Gene TherapeuticsMethods AndApplications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff編)(1994)；Wu等，J.Biol.Chem.(1988)263621；Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269542；Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)873655；Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266338中有所描述。以基因治療方案局部施用含有約100ng到約200mg(或更多)DNA的多核苷酸的治療組合物。在一些實(shí)施方案中，在基因治療方案期間還可以使用小于約500ng，約500ng到約50mg，約1μg到約2mg，約5μg到約500μg，約20μg到約100μg或者更高的DNA濃度范圍?？梢允褂没蜻f送載體遞送本發(fā)明的治療性多核苷酸和多肽?；蜻f送載體可以是病毒或者非病毒來源(一般見，Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)151；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1185；和Kaplitt，Nature Genetics(1994)6148)?？梢允褂脙?nèi)源哺乳動(dòng)物或者異源啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子誘導(dǎo)這些編碼序列的表達(dá)。編碼序列的表達(dá)可以是組成性或受調(diào)節(jié)的。
用于遞送所需多核苷酸并在目的細(xì)胞中表達(dá)的基于病毒的載體是本領(lǐng)域中熟知的。代表性基于病毒的載體包括(但不限于)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(見，例如PCT公布號(hào)WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美國專利No.5,219,740、4,777,127、英國專利號(hào)2,200,651和歐洲專利No.0345242)、基于甲病毒的載體(例如辛德比斯病毒載體、Semliki森林病毒(ATCCVR-67、ATCCVR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR1249、ATCC VR-532)，以及腺伴隨病毒(AAV)載體(見，例如PCT公布號(hào)WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)。也可施用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147中描述的與滅活腺病毒連接的DNA。
也可使用非病毒遞送載體及方法，包括(但不限于)僅與滅活腺病毒連接或不連接的聚陽離子濃縮DNA(見，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147)；配體連接的DNA(見，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)26416985)；真核細(xì)胞遞送載體細(xì)胞(見，例如美國專利No.5,814,482、PCT公布號(hào)WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763及WO 97/42338)以及核電荷中和或與細(xì)胞膜融合。也可用裸露DNA。代表性裸露DNA導(dǎo)入方法在PCT公布號(hào)WO 90/11092及美國專利No.5,580,859中有所描述。可作為基因遞送載體的脂質(zhì)體在美國專利No.5,422,120；PCT公布號(hào)WO95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445以及EP專利No.0524968中有所描述。其它方法在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)142411及在Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)911581中有所描述。
顯然，表達(dá)載體還可用以指導(dǎo)本文描述的任一種基于蛋白質(zhì)的NGF拮抗劑(例如抗NGF抗體、TrkA免疫黏附素等等)的表達(dá)。例如，編碼抗NGF抗體拮抗劑的多核苷酸也可以用于遞送和在目的細(xì)胞中表達(dá)抗NGF抗體拮抗劑。顯然，表達(dá)載體可用于指導(dǎo)抗NGF抗體拮抗劑的表達(dá)。該表達(dá)載體可以腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)腸、腸胃外、鼻內(nèi)、經(jīng)皮或者通過吸入施用。例如，表達(dá)載體的施用包括局部或全身施用，包括注射、經(jīng)口施用、基因槍或者插導(dǎo)施用和局部施用。如本文進(jìn)一步討論的，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉表達(dá)載體的施用以獲得外源蛋白質(zhì)在體內(nèi)的表達(dá)。見，例如美國專利No.6,436,908、6,413,942、6,376,471。能夠阻斷(部分到完全阻斷)NGF和/或NGF生物活性的其他TrkA受體片段是本領(lǐng)域中公知的。
在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑含有至少一種TrkA免疫黏附素。如本文所用的，TrkA免疫黏附素指含有TrkA受體的胞外結(jié)構(gòu)域(或者其部分)和免疫球蛋白序列的可溶性嵌合分子，該分子保持TrkA受體的結(jié)合特異性(在一些實(shí)施方案中，基本上保持結(jié)合特異性)并且能夠結(jié)合NGF。如本文所述，TrkA免疫黏附素能夠阻斷(降低和/或抑制)NGF生物活性。
TrkA免疫黏附素是本領(lǐng)域中公知的，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其阻斷(降低或抑制)NGF與TrkA受體的結(jié)合。見，例如美國專利No.6,153,189。在一個(gè)實(shí)施方案中，TrkA免疫黏附素含有能夠結(jié)合NGF的TrkA受體氨基酸序列(或者基本上保持TrkA受體的結(jié)合特異性的氨基酸序列)和免疫球蛋白序列(或者基本上保持TrkA受體的結(jié)合特異性的氨基酸)的融合。在一些實(shí)施方案中，TrkA受體為人TrkA受體序列，并且與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。在其他實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列是免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域序列。在其他實(shí)施方案中，兩種TrkA受體-免疫球蛋白重鏈融合(例如，通過二硫鍵的共價(jià)連接)的結(jié)合導(dǎo)致同型二聚體免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白輕鏈還可以與二硫鍵結(jié)合的二聚體中TrkA受體-免疫球蛋白嵌合體之一或兩者結(jié)合以產(chǎn)生同型三聚體或者同型四聚體結(jié)構(gòu)。適宜的TrkA免疫黏附素的實(shí)例包括美國專利No.6,153,189中描述的那些。
在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑含有至少一種抗TrkA抗體，其能夠阻斷、抑制、改變、和/或降低NGF與TrkA受體和/或下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物理相互作用，從而減小和/或阻斷NGF生物活性?？筎rkA抗體是本領(lǐng)域中公知的。代表性抗TrkA抗體包括PCT公布號(hào)WO 97/21732、WO00/73344、WO 02/15924，和美國專利No.20010046959中描述的那些抗TrkA抗體。在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑包含至少一種抗p75抗體，其能夠阻斷、抑制、和/或降低NGF與p75受體和/或下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物理相互作用，從而降低和/或阻斷NGF生物活性。
在另一實(shí)施方案中，NGF拮抗劑包含至少一種激酶抑制劑，其能夠抑制與TrkA和/或p75受體活性相關(guān)的下游激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。代表性激酶抑制劑為K252a或k252b，它們是本領(lǐng)域中公知的并且在Knusel等，J.Neurochem.59715-722(1992)；Knusel等，J.Neurochemistry 57955-962(1991)；Koizumi等，J.Neuroscience 8715-721(1988)；Hirata等，ChemicalAbstracts 111728，XP00204135中有所描述，見摘要和《12th CollectiveChemical Substance Index》，p.34237，c.3(5-7，55-60，66-69)，p.34238，c.1(41-44)，c.2(25-27，32-33)，p.3423，c.3(48-50，52-53)；美國專利No.6,306,849。
預(yù)期如果臨床醫(yī)生進(jìn)行尋找，將鑒定許多其他類別的NGF拮抗劑。
NGF拮抗劑的鑒定使用本領(lǐng)域中公知的方法可以鑒定或表征抗NGF抗體和其他NGF拮抗劑，從而檢測和/或測量NGF生物活性的降低、改善或者中和。例如，美國專利No.5,766,863和5,891,650中描述的激酶受體活化(KIRA)測定法可用于鑒定抗NGF劑。該ELISA型測定法適于通過測量受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(下文中“rPTK”)(例如TrkA受體)的激酶結(jié)構(gòu)域的自磷酸化來定性或者定量測量激酶活性，以及鑒定和表征所選的rPTK(例如TrkA)的潛在拮抗劑。該測定法第一階段包括激酶受體(如TrkA受體)的激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化，其中所述受體存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞膜中。受體可以是內(nèi)源受體或者編碼受體的核酸，或者可以將受體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞。通常，第一個(gè)固相(例如第一個(gè)測定板的孔)被這些細(xì)胞(通常哺乳動(dòng)物細(xì)胞系)的基本上同源的群體包被，從而細(xì)胞粘附到固相。通常，細(xì)胞是粘附性的從而自然粘附到第一個(gè)固相。如果使用“受體構(gòu)建體”，其通常含有激酶受體和標(biāo)記多肽的融合。在測定法的ELISA部分，標(biāo)記多肽被捕獲劑(通常為捕獲抗體)識(shí)別。然后將分析物(如候選抗NGF抗體或者其他NGF拮抗劑)與NGF一起加入具有粘附細(xì)胞的孔中，從而酪氨酸激酶受體(例如TrkA受體)暴露(或者接觸)于NGF和分析物。該測定法可以鑒定通過TrkA配體NGF抑制其活性的抗體(或者其他NGF拮抗劑)。暴露于NGF和分析物后，用裂解緩沖液(其含有增溶去污劑)溶解粘附的細(xì)胞并輕輕攪拌，從而釋放細(xì)胞裂解物，其可以直接用于測定法的ELISA部分，不需要濃縮或者澄清細(xì)胞裂解物。
然后如此制備的細(xì)胞裂解物易于用于測定法的ELISA階段。作為ELISA階段的第一步，第二固相(一般為ELISA微滴定板的孔)用與酪氨酸激酶受體特異結(jié)合的捕獲劑包被或?qū)τ谑荏w構(gòu)建體的情況，用與標(biāo)記多肽特異結(jié)合的捕獲劑(常常為捕獲抗體)包被。進(jìn)行第二固相的包被使捕獲劑粘附在第二固相上。捕獲劑一般為單克隆抗體，但如在本文實(shí)施例中描述的，也可用多克隆抗體。然后將獲得的細(xì)胞裂解物暴露于(或接觸)粘附捕獲劑，使受體或受體構(gòu)建體粘附(或捕獲在)第二固相上。然后進(jìn)行漂洗步驟，以除去未結(jié)合的細(xì)胞裂解物，留下捕獲的受體或受體構(gòu)建體。然后將粘附或捕獲的受體或受體構(gòu)建體暴露于(或接觸)抗磷酸酪氨酸抗體，其鑒定酪氨酸激酶受體中磷酸化酪氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗磷酸酪氨酸抗體與催化非放射性顯色試劑顏色變化的酶(直接或間接)綴合。因此，可通過隨后試劑的顏色變化測量受體的磷酸化。酶可與抗磷酸酪氨酸抗體直接綴合，或綴合分子(例如生物素)可與抗磷酸酪氨酸抗體綴合并且酶可隨后通過綴合分子與抗磷酸酪氨酸抗體綴合。最后，通過例如顯色試劑的顏色變化進(jìn)行測量，抗磷酸酪氨酸抗體與捕獲受體或受體構(gòu)建體的結(jié)合。
也可通過孵育候選劑與NGF并監(jiān)測以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)特征鑒定抗NGF拮抗劑(a)結(jié)合NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信號(hào)功能介導(dǎo)的下游途徑；(b)阻斷或降低NGF受體活化；(c)增加NGF的清除；(d)抑制NGF受體活化(包括TrkA二聚化和/或自磷酸化)；(e)治療、減輕或預(yù)防疼痛或骨關(guān)節(jié)炎疼痛的任何方面，特別是與NSAID聯(lián)合使用；(f)抑制(降低)NGF合成、產(chǎn)生或釋放；(g)增強(qiáng)NSAID對(duì)疼痛的治療。在一些實(shí)施方案中，通過孵育候選劑與NGF并監(jiān)測結(jié)合和/或伴隨的NGF生物活性的降低或中和鑒定抗NGF拮抗劑。可用純化的NGF多肽或天然表達(dá)或轉(zhuǎn)染表達(dá)NGF多肽的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)施結(jié)合測定法。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合測定法為競爭性結(jié)合測定法，其中評(píng)估候選抗體與已知NGF拮抗劑競爭結(jié)合NGF的能力。此測定法可以多種形式實(shí)施，包括ELISA形式。在其它實(shí)施方案中，通過孵育候選劑與NGF并監(jiān)測結(jié)合和伴隨的trkA受體二聚化和/或自磷酸化的抑制鑒定抗NGF拮抗劑。
在最初鑒定后，候選抗NGF抗體拮抗劑的活性可通過已知檢測定向生物活性的生物測定法進(jìn)一步確定及完善。備選地，可用生物測定法直接篩選候選物。例如，NGF在應(yīng)答細(xì)胞中促進(jìn)許多形態(tài)可識(shí)別的變化。這些包括(但不限于)促進(jìn)PC12細(xì)胞的分化及增強(qiáng)自這些細(xì)胞中神經(jīng)突的生長(Urfer等，Biochem，364775-4781(1997)；Tsoulfas等，Neuron10975-990(1993))、促進(jìn)神經(jīng)突自應(yīng)答感覺及交感神經(jīng)節(jié)的外植體向外生長(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.Nerve growth factor.Physiol.Rev.48534-569，1968)，并促進(jìn)依賴NGF的神經(jīng)元(如胚胎背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)或交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活(例如Chun & Patterson，Dev.Biol.75705-711(1977)；Buchman & Davies，Development 118989-1001(1993))。因此，用于抑制NGF生物活性的測定法需要用NGF加分析物培養(yǎng)NGF應(yīng)答細(xì)胞，所述分析物如候選抗NGF抗體和候選NGF拮抗劑。在適當(dāng)時(shí)間后，測定細(xì)胞反應(yīng)(細(xì)胞分化、神經(jīng)突向外生長或細(xì)胞存活)。
候選NGF拮抗劑阻斷或中和NGF生物活性的能力也可通過監(jiān)測候選制劑在Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)中描述的胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)存活生物測定法中抑制NGF介導(dǎo)的存活的能力來評(píng)估。鑒定NGF活性調(diào)節(jié)劑的方法在PCT/US2004/01609中有所描述。
組合物如本文的多種實(shí)施方案描述的，本發(fā)明的組合物含有有效量的NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和NSAID。在一些實(shí)施方案中，組合物還含有可藥用賦形劑。在一些實(shí)施方案中，該組合物用于本文描述的任一方法(如治療手術(shù)后疼痛的方法)中。這些組合物的實(shí)例，以及它們的配制方法也在前面章節(jié)和下本文有所描述。NGF拮抗劑和NSAID可以以單一組合物存在或者作為分開的組合物存在。因此，在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑和NSAID存在于同一組合物中。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑和NSAID存在于分開的組合物中。
另一方面，本發(fā)明提供了NGF拮抗劑和NSAID的增效組合物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療疼痛(如手術(shù)后疼痛)的含有NGF拮抗劑的藥物組合物，其中所述應(yīng)用包括同時(shí)和/或依次施用NSAID。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療疼痛的含有NSAID的藥物組合物，其中所述應(yīng)用包括同時(shí)和/或依次施用NGF拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有用于分開、同時(shí)和/或依次治療疼痛的NGF拮抗劑和NSAID。在一些實(shí)施方案中，NGF拮抗劑為抗NGF抗體(如本文描述的抗體E3)。在其他實(shí)施方案中，NSAID為布洛芬。在其他實(shí)施方案中，NGF拮抗劑為抗NGF抗體并且NSAID為布洛芬。
應(yīng)當(dāng)理解所述組合物可以含有一種以上的NGF拮抗劑。例如，組合物可以含有一類NGF拮抗劑的一種以上的成員(例如識(shí)別NGF不同表位的抗NGF抗體的混合物)，以及不同類別的NGF拮抗劑的成員(例如抗NGF抗體和NGF抑制化合物)。其他代表性組合物含有識(shí)別相同表位的一種以上的抗NGF抗體、結(jié)合NGF的不同表位的不同物種的抗NGF抗體，或者不同的NGF抑制化合物。在其他實(shí)施方案中，所述組合物含有一種或多種NGF拮抗劑，其選自結(jié)合(物理相互作用)NGF的拮抗劑(例如抗體)、結(jié)合NGF受體(如TrkA受體或者p75受體)的拮抗劑和降低(阻礙和/或阻斷)下游NGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑。
用于本發(fā)明的組合物還可以凍干制劑或者水性溶液的形式含有可藥用載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑(Remington《The Science and Practice ofPharmacy》第20版(2000)，Lippincott Williams和Wilkins編，K.E.Hoover)?？山邮艿妮d體、賦形劑或者穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對(duì)接受者是無毒的，并且可以含有緩沖劑(如磷酸、檸檬酸，和其他有機(jī)酸)、抗氧化劑(包括抗壞血酸和甲硫氨酸)、防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化己烷雙胺、苯扎氯銨、苯索氯胺、苯酚、丁醇或芐醇、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚)環(huán)己醇、3-戊醇、及間甲酚)、低分子量(約10個(gè)殘基以下)多肽、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)、明膠或免疫球蛋白、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸)、單糖、二糖及其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合劑(如EDTA)、糖(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)、形成鹽的平衡離子(如鈉)、金屬復(fù)合體(例如鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合體)和/或非離子表面活性劑(如TWEENTM、PLURONICSTM)或聚乙二醇(PEG)。本文進(jìn)一步了描述可藥用賦形劑。
本文描述的組合物可含有公知對(duì)疼痛治療有用的額外的化合物。NGF拮抗劑和NSAID和它們的組合物也可以與用以增強(qiáng)和/或補(bǔ)充試劑的有效性的其他試劑聯(lián)合使用。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物(描述于本文)，其用于本文描述的任一方法，可用作藥物和/或用于制作藥物。
試劑盒本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)容器，所述容器含有NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)、NSAID，在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括按照本文描述的任一方法使用的說明書。在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有抗NGF抗體(如本文描述的抗體E3)。在其他實(shí)施方案中，試劑盒含有抗NGF抗體，其包含抗體E3的一個(gè)或多個(gè)CDR(如E3的1、2、3、4、5或者在一些實(shí)施方案中，為所有6個(gè)CDR)。試劑盒還可以包括關(guān)于基于個(gè)體患是否有疼痛或者是否該個(gè)體處于疼痛的危險(xiǎn)中選擇適于治療的個(gè)體的說明。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了按照本文描述的任一方法使用的試劑盒，所述試劑盒含有NGF拮抗劑。在其他實(shí)施方案中，試劑盒含有抗NGF抗體。在其他實(shí)施方案中，試劑盒含有人源化抗NGF抗體(如本文描述的抗體E3)。在其他實(shí)施方案中，說明書包括聯(lián)合施用NGF拮抗劑和NSAID以治療、預(yù)防和/或減輕任何疼痛(如手術(shù)后疼痛、與燒傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、或者骨關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疼痛)的說明。
在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)、NSAID和關(guān)于同時(shí)和/或依次施用NGF拮抗劑和NSAID以有效治療疼痛的使用說明書。在另一實(shí)施方案中，該試劑盒含有NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和關(guān)于聯(lián)合施用NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和NSAID以有效治療疼痛的說明書。在其他實(shí)施方案中，試劑盒含有NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)、NSAID(如布洛芬)和關(guān)于聯(lián)合施用NGF拮抗劑和NSAID以有效治療疼痛的使用說明書。因此，本文描述的任一方法可以反映在使用說明書中。
在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有抗NGF抗體。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體為含有表1中所示重鏈可變區(qū)和表2中所示輕鏈可變區(qū)的抗體。在其他實(shí)施方案中，抗NGF抗體為本文描述的抗體E3。
NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和NSAID可以存在于公開的或同一容器中。應(yīng)當(dāng)理解試劑盒可以含有一種明確的組合物或者兩種或多種組合物，其中一種組合物含有NGF拮抗劑，一種組合物含有NSAID。
本發(fā)明的試劑盒適于包裝。適宜的包裝包括(但不限于)小瓶、瓶、廣口瓶(jar)、彈性包裝(例如密封的聚酯薄膜或者塑料袋)等。試劑盒可以任選提供額外的組分，如緩沖劑和說明性信息。
關(guān)于NGF拮抗劑的使用說明通常包括關(guān)于計(jì)劃治療的劑量、給藥方案和施用途徑的信息。容器可以為單位劑量、批量包裝(例如多劑量包裝)或者亞單位劑量。本發(fā)明的試劑盒中提供的使用說明書通常為標(biāo)簽或者包裝插頁(例如包括在試劑盒中的紙張)上的書寫說明，但是也可以接受的機(jī)器可讀的說明(例如在磁或者光儲(chǔ)存盤上攜帶的說明書)。
標(biāo)記或者包裝插頁指出該組合物用于治療、減輕和/或預(yù)防疼痛(包括手術(shù)后疼痛)?？梢蕴峁┦褂谜f明書以實(shí)施本文描述的任一種方法。
本發(fā)明的試劑盒適于包裝。適宜的包裝包括，但不限于，小瓶、瓶、廣口瓶、彈性包裝(例如密封的聚酯薄膜或者塑料袋)等。還設(shè)想包裝組合使用特定裝置，如吸入器、鼻施用裝置(例如霧化器)或者灌注裝置(如微泵)的包裝。試劑盒可以具有無菌入口(例如，容器可以為具有皮下注射針頭可以刺穿的塞子的靜脈溶液包或者小瓶)。容器也可以具有無菌入口(例如，容器可以是具有皮下注射針頭可以刺穿的塞子的靜脈溶液包或者小瓶)。組合物中至少一種活性劑為NGF拮抗劑，如抗NGF抗體。容器可以還含有另一種藥物活性劑。
試劑盒可以任選地提供額外的組分，如緩沖劑或者解釋性信息。通常，試劑盒含有容器和容器上或者與容器相伴的標(biāo)簽或者包裝插頁。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有上述試劑盒的內(nèi)含物的產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)和/或NSAID與指示用于治療疼痛(相互聯(lián)合)的信息。
NGF拮抗劑和NSAID的施用和對(duì)治療的評(píng)估可以通過任何適宜的途徑將NGF拮抗劑和NSAID施用于個(gè)體。例如，它們可以一起或者單獨(dú)地經(jīng)口、靜脈內(nèi)、舌下、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、脊柱內(nèi)、經(jīng)直腸、胸內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、舌下、透皮或者通過吸入施用。它們可以經(jīng)口施用，例如以片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、口香糖、棒糖、栓劑或者本領(lǐng)域公知的方法制備的劑型施用。本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見的是本文描述的實(shí)施例無意限制而是闡明可以利用的技術(shù)。
因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)公知的方法對(duì)個(gè)體施用NGF拮抗劑，(如抗NGF抗體)，如靜脈內(nèi)施用，例如，作為快速注射或者通過一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸液，可以通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)口、吸入或者局部途徑。通過商業(yè)途徑可以得到的液體制劑的霧化器(包括噴霧霧化器和超聲霧化器)可用于施用。液體制劑可以直接霧化，凍干粉劑可以重構(gòu)后霧化。備選地，NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)可以經(jīng)碳氟化合物制劑和帶刻度的劑量吸入器霧化，或者作為凍干和碾磨的粉劑吸入。
位點(diǎn)專一或者靶向局部遞送技術(shù)也可以用于施用。位點(diǎn)專一或者靶向局部遞送技術(shù)的實(shí)例包括NGF拮抗劑和/或NSAID的多種可植入的貯庫制劑源(depot source)，或者局部遞送導(dǎo)管，如輸液導(dǎo)管、內(nèi)在導(dǎo)管，或者針頭導(dǎo)管、合成移植物、adventitial wrap、分流裝置和stent裝置或者其他可植入的裝置、位點(diǎn)專一載體、直接注射、使用患者控制的止痛(PCA)技術(shù)或者裝置和/或直接應(yīng)用。見，例如PCT公布號(hào)WO 00/53211和美國專利No.5,981,568。
可施用試劑(NGF拮抗劑，如抗NGF抗體或者其片段)的多種制劑。在一些實(shí)施方案中，試劑如抗NGF抗體或者其片段可以直接施用。在一些實(shí)施方案中，包括抗NGF抗體的所述試劑可以為多種制劑，包括含有可藥用賦形劑的制劑?？伤幱觅x形劑是本領(lǐng)域中公知的，并且是便于藥物活性物質(zhì)施用的相對(duì)惰性的物質(zhì)。例如，賦形劑可賦予形狀或者稠度，或者作為稀釋劑。適宜的賦形劑(包括但不限于)穩(wěn)定劑、濕潤劑和乳化劑、用于改變摩爾滲透壓濃度的鹽、膠囊化劑、緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑。賦形劑以及用于腸胃外和非腸胃外藥物遞送的賦形劑在Remington等《TheScience and Practice of Pharmacy》第20版，Mack Publishing(2000)中提出。
在一些實(shí)施方案中，配制這些試劑(NGF拮抗劑)以通過注射(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等等)施用。因此，這些試劑可以與可藥用載體如(鹽水、Ringer溶液、右旋糖溶液等等)組合。具體給藥方案，即劑量、時(shí)間選擇和重復(fù)將取決于具體的個(gè)體和個(gè)體的病史。給藥方案(包括所用NGF拮抗劑)可以隨時(shí)間改變。
可以用任何適宜的方法，包括通過注射(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等等)施用抗NGF抗體。如本文描述，還可以通過吸入施用抗NGF抗體。通常，對(duì)于抗NGF抗體的施用，最初候選劑量可以為約0.2mg/kg或約2mg/kg。在一些實(shí)施方案中，取決于上面提到的因素，常用的日劑量可以為約3μg/kg到30μg/kg到300μg/kg到3mg/kg到30mg/kg到100mg/kg或以上的任一種。對(duì)于數(shù)天或更長時(shí)間的反復(fù)施用，根據(jù)條件，持續(xù)治療直到產(chǎn)生疾病癥狀所希望的抑制或者直到實(shí)現(xiàn)了減輕疼痛的足夠的治療水平。代表性給藥方案包括施用約2mg/kg的最初劑量，然后約1mg/kg的抗NGF抗體每周維持劑量，或者每隔一周約1mg/kg的維持劑量。然而，也可以使用其他劑量方案，這取決于醫(yī)生希望實(shí)現(xiàn)的藥物動(dòng)力學(xué)衰減的模式。例如，設(shè)想每周給藥1-4次。其他給藥方案包括每天最多1次，每周1到4次，或者更低的頻率。在一些實(shí)施方案中，每周約一次、每月約1到4次施用化合物?？筃GF抗體的劑量在本文有所描述。通過常規(guī)技術(shù)和測定法可以容易地監(jiān)視該治療的進(jìn)展。
在一些實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的NGF拮抗劑不是抗體時(shí)，可以將其分成1到3劑以0.1到300mg/kg患者體重比率施用，或者如本文公開的施用。在一些正常體重的患者中，可以施用約0.3到5.00mg/kg的劑量。具體劑量方案，即劑量、時(shí)間選擇和反復(fù)將取決于具體的個(gè)體和個(gè)體的病史，以及個(gè)別試劑的性質(zhì)(如該試劑的半壽期，和本領(lǐng)域中公知的其他考慮)。
NSAID可以以高達(dá)這類鎮(zhèn)痛劑的常規(guī)劑量水平施用。在一些實(shí)施方案中，NSAID以降低的水平施用。適宜的劑量水平將取決于所選NSAID的鎮(zhèn)痛效果，但是通常適宜的水平將為每天約0.001到25mg/kg，每天約0.005到10mg/kg，或每天約0.05到1mg/kg，或更低。該化合物可以以高達(dá)每天6次(或者更多)、每天1到4次的方案施用，或者可以施用頻率更低。在一些實(shí)施方案中，NSAID連續(xù)施用，或者非常頻繁地施用(如利用PCA)。
當(dāng)作為單一或者分開的組合物聯(lián)合施用時(shí)，神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID以與所希望的效果表現(xiàn)一致的比例施用。在一些實(shí)施方案中，按重量計(jì)，神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID的比例約為1∶1。在一些實(shí)施方案中，該比例可以為約0.001比約1到約1000到約1，到約0.01比約1到約100到約1，或約0.1比約1到約10到約1。也設(shè)想其他比例。
應(yīng)當(dāng)理解用于治療和預(yù)防疼痛所需的神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID的量將不僅隨著所選的具體化合物或組合物而變，而且隨著施用途徑、所治療的疾病的性質(zhì)，和患者的年齡和狀況、治療的過程或階段而變，并且將最終由主治醫(yī)生決定。例如，NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)的適宜劑量將取決于所用的NGF拮抗劑(或者其組合物)、待治療的疼痛的類型和嚴(yán)重性、施用試劑用于預(yù)防還是治療目的、以前的治療、患者的臨床史和對(duì)該試劑的應(yīng)答，和主治醫(yī)生的決定。通常，臨床醫(yī)生將施用NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)，直到達(dá)到實(shí)現(xiàn)所希望的結(jié)果的劑量。
經(jīng)驗(yàn)考慮(如半壽期)將通常有助于劑量決定。例如與人免疫系統(tǒng)相容的抗體，如人源化抗體或者完全人抗體可以用于延長抗體的半壽期和防止宿主的免疫系統(tǒng)攻擊該抗體?？梢源_定施用頻率并隨治療過程進(jìn)行調(diào)整，并且施用頻率通常(但不是必需)基于疼痛的治療和/或抑制和/或減輕和/或延遲。備選地，NGF拮抗劑和/或NSAID的持續(xù)連續(xù)釋放制劑可以是適宜的。實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放的多種制劑和裝置是本領(lǐng)域公知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在已經(jīng)被一次或多次施用抑制NGF活性的試劑以治療疼痛的個(gè)體中按照經(jīng)驗(yàn)確定NGF拮抗劑劑量。對(duì)個(gè)體給予增量的抑制NGF的試劑(例如抗NGF抗體)并聯(lián)合NSAID。為了評(píng)估治療的功效，可以跟蹤疼痛指示劑。
根據(jù)本發(fā)明的方法，取決于例如受者的生理?xiàng)l件、施用目的為治療還是預(yù)防和技術(shù)人員公知的其他因素，可以連續(xù)或間歇的施用NGF拮抗劑和NSAID?？筃GF拮抗劑的施用可在預(yù)選擇的時(shí)期基本上連續(xù)或可為一系列間斷的劑量，所述預(yù)選擇的時(shí)期例如疼痛發(fā)展之前、期間或以后；之前及以后；期間及以后；之前及期間；或疼痛發(fā)展之前、期間及以后。例如，可以在傷口、切割、創(chuàng)傷、手術(shù)，和可能產(chǎn)生疼痛的任何其他事件之前、之間和/或之后施用。
在一些實(shí)施方案中，可存在一種以上NGF拮抗劑(如抗體)。拮抗劑可以被此相同或不同?？纱嬖谥辽僖环N、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或五種以上不同的NGF拮抗劑。大體上，這些NGF拮抗劑具有不會(huì)相互有害影響的互補(bǔ)活性。NGF拮抗劑可以與用以增強(qiáng)和/或補(bǔ)充試劑效力的其他試劑聯(lián)合使用。
在一些實(shí)施方案中，可以存在一種以上的NSAID。NSAID可以被此相同或者不同?？梢源嬖谥辽僖环N、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或五種以上不同的NSAID。大體上，這些NSAID具有不會(huì)相互有害影響的互補(bǔ)活性。NSAID可以與用以增強(qiáng)和/或補(bǔ)充試劑的效力的其他試劑聯(lián)合使用。
通過將具有所需純度的抗體與任選可藥用載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)，MackPublishing(2000))混合，以凍干制劑或者水性溶液形式制備根據(jù)本發(fā)明使用的NGF拮抗劑(如抗體)和NSAID的治療制劑以保存?？山邮艿妮d體、賦形劑或者穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對(duì)接受者是無毒的，并且可以含有緩沖劑(如磷酸、檸檬酸，和其他有機(jī)酸)、鹽(如氯化鈉)、抗氧化劑(包括抗壞血酸和甲硫氨酸)、防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化己烷雙胺、苯扎氯銨、苯索氯胺、苯酚、丁醇或芐醇、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇、及間甲酚)、低分子量(約10個(gè)殘基以下)多肽、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)、明膠或免疫球蛋白、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸)、單糖、二糖及其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合劑(如EDTA)、糖(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)、形成鹽的平衡離子(如鈉)、金屬復(fù)合體(例如鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合體)和/或非離子表面活性劑(如TWEENTM、PLURONICSTM)或聚乙二醇(PEG)。
通過本領(lǐng)域已知的方法，如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 774030(1980)以及美國專利No.4,485,045及4,544,545中描述的方法制備包含抗NGF拮抗劑(如抗體)的脂質(zhì)體。具有增強(qiáng)循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體公開于美國專利No.5,013,556?？赏ㄟ^反相蒸發(fā)包含磷脂酰膽堿、膽固醇及PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物產(chǎn)生特別有用的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體通過確定孔徑的濾膜擠出以產(chǎn)生目的直徑的脂質(zhì)體。
活性成分也可捕獲在制備的微囊中，例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合作用，例如分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒及納米膠囊)或在微乳劑中的羥甲基纖維素或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中。此類技術(shù)公開于Remington，The Science andPractice of Pharmacy第20版，Mack Publishing(2000)中。
可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的適當(dāng)實(shí)例包括包含抗體的固體疏水性聚合物的半滲透基質(zhì)，所述基質(zhì)為有形狀物體(例如膜或微曩)形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙酰乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸醇酸共聚物與醋酸亮比瑞林(leuprolide acetate)組成的可注射微球體)、蔗糖醋酸異丁酸鹽及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內(nèi)施用的制劑必需為無菌的。這通過例如無菌濾膜過濾易于完成。治療性NGF拮抗劑(如抗NGF抗體)組合物一般置于具有無菌接入口的容器，例如靜脈內(nèi)溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的塞予的瓶中。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以為單位劑型，如片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、顆粒劑、溶液劑或懸浮劑或栓劑，用于經(jīng)口、腸胃外或直腸施用，或通過吸入或吹入施用。
對(duì)于制備固體組合物(如片劑)，混合主要活性成分與藥物載體，例如常規(guī)片劑成分(如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠)以及其它藥物稀釋劑(例如水)，以形成包含本發(fā)明化合物的同質(zhì)混合物或其無毒性可藥用鹽的處方前固體組合物。當(dāng)談及這些處方前組合物為同質(zhì)時(shí)，表示活性成分在組合物中均勻分散以便組合物可易于再分為等量有效單位劑型，如片劑、丸劑及膠囊劑。然后此處方前固體組合物再分為包含約0.01mg到約0.1mg至約500mg本發(fā)明活性成分的上述類型的單位劑型?？蓪?duì)新組合物的片劑或丸劑進(jìn)行包衣或否則進(jìn)行復(fù)合以提供具有延長作用優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑或丸劑可包含內(nèi)部劑量及外部劑量組分，外劑量組分為內(nèi)劑量組分的包膜。兩種組分可通過腸層分開，該腸層在胃中抵抗分解并允許內(nèi)層組分完整進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。多種材料可用于此類腸層或包衣，這些材料包括許多聚合酸以及聚合酸與蟲膠、鯨蠟醇及醋酸纖維素之類的材料的混合物。
其中本發(fā)明的組合物可以摻入以經(jīng)口或者通過注射施用的液體形式包括水溶液、適當(dāng)調(diào)味的糖漿劑、水性或油性懸浮劑，和用食用油(如棉籽油、芝麻油、椰子油、花生油)調(diào)味的乳劑，以及酏劑和類似的藥物載體。用于水懸浮液的適宜的分散或懸浮劑包括合成和天然樹膠(如西黃蓍膠、阿拉伯樹膠)、藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或者明膠?；钚猿煞忠部梢該饺敫哒承缘目蒯尞a(chǎn)品，如蔗糖乙酸異丁酸鹽或者其他。這些制劑可以用于經(jīng)口施用，或者注射。注射可以導(dǎo)致藥物的局部貯存，其在1天到3個(gè)月內(nèi)局部釋放。
通過注射施用的組合物包括含有NGF拮抗劑和NSAID作為活性成分，并伴隨表面活性劑(或者濕潤劑或表面活性劑)或者為乳劑形式(如油包水或者水包油乳劑)的那些組合物。
合適的表面活性劑包括(特別是)非離子劑，如聚氧乙烯山梨糖醇(例如TweenTM20、40、60、80或85)及其它山梨糖醇(例如SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性制劑的組合物有利地包含0.05到5％，或者0.1到2.5％的表面活性劑。應(yīng)當(dāng)理解，如果必要，可加入其它成分，例如甘露醇或其它可藥用載體。
用通過商業(yè)途徑可獲得的脂肪乳劑，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM可制備合適的乳劑?；钚猿煞挚扇芙庥陬A(yù)混合乳劑組合物或備選地溶解于油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和基于混和磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水形成的乳劑中。應(yīng)當(dāng)理解可加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以調(diào)整乳劑的張力。合適的乳劑一般包含高達(dá)20％(例如介于5到20％)的油。脂肪乳劑可包含0.1到1.0μm(尤其是0.1到0.5μm)的脂肪滴，其pH在5.5至8.0的范圍。
在一些實(shí)施方案中，乳劑組合物可為通過混合神經(jīng)生長因子拮抗劑與IntralipidTM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)制備的組合物。
用于吸入或吹入的組合物包括在可藥用水性或有機(jī)溶劑或其混合物中的溶液和懸液以及粉末劑。液體或固體組合物可包含如以上指出的合適的可藥用賦形劑。組合物可通過經(jīng)口或鼻呼吸途徑施用，用于產(chǎn)生局部或全身效果。在優(yōu)選無菌可藥用溶劑中的組合物可通過使用氣體進(jìn)行霧化。霧化溶液可從霧化裝置直接呼吸或?qū)㈧F化裝置與面罩、塞條或間歇正壓呼吸機(jī)連接。溶液、懸液或粉劑組合物可以適當(dāng)方式從遞送制劑的裝置施用(包括經(jīng)口或經(jīng)鼻)。
治療功效可通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行評(píng)估。
提供下面的實(shí)施例用以闡明而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1抗NGF單克隆抗體聯(lián)合NSAID治療手術(shù)后疼痛我們用模擬手術(shù)后疼痛的疼痛模型評(píng)估抗NGF抗體聯(lián)合NSAID(布洛芬)的功效。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，使用前將體重為200到200g的16只雄性成年Sprague Dawley大鼠(Harlan；Indianapolis，IN)在正常光照條件下室內(nèi)用食物和水無限制地喂養(yǎng)至少1周。手術(shù)前在試驗(yàn)室中適應(yīng)2小時(shí)后，將大鼠分成兩組一組手術(shù)前15小時(shí)接受抗體，另一組在該時(shí)間接受載體(5％右旋糖/0.45％鹽水USP)。以1mg/kg體重施用抗NGF抗體拮抗劑911(見，Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))。所有動(dòng)物手術(shù)后24小時(shí)以10、200和300mg/kg的多種濃度(皮下)施用布洛芬。
手術(shù)基于Brennan等，Pain 64493-501(1996)描述的方法。用2％異氟烷和空氣的混合物麻醉動(dòng)物，該混合物通過頭錐體(nose cone)在手術(shù)期間保持。用聚烯吡酮-碘墊制備右后爪的跖面，通過皮膚和筋膜產(chǎn)生1-cm中央縱向切口，其從距腳后跟邊緣0.5cm開始直到腳趾。將足固定在彎曲位置中以尺子進(jìn)行測量。將跖肌用彎曲鑷子升高并縱向切割。通過肌肉的起點(diǎn)到插入之間的完全深度切割肌肉。通過紗布?jí)|按壓控制手術(shù)期間的出血。用褥式縫合封閉傷口(5-0 ethicon黑色單絲)。將這些縫合打結(jié)5-6次，第一個(gè)結(jié)松散打結(jié)。用桿菌肽溶液擦拭傷口部位。在行為試驗(yàn)開始前22小時(shí)允許動(dòng)物恢復(fù)并在干凈籠中休息。
對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物分成兩組(對(duì)照和抗體處理的)。在手術(shù)前15小時(shí)施用抗NGF抗體。手術(shù)后22小時(shí)評(píng)估兩組中的靜息疼痛(下面圖中的“基線”)。手術(shù)后24小時(shí)，用布洛芬以10、30、100或300mg/kg(皮下)處理所有動(dòng)物。布洛芬處理后1小時(shí)開始評(píng)估靜息疼痛。
手術(shù)后不同時(shí)間用積累疼痛得分評(píng)估靜息疼痛。將大鼠置于干凈塑料籠中的塑料網(wǎng)(格子8mm2)并允許適應(yīng)15分鐘-20分鐘。以0到2的數(shù)值范圍評(píng)估行為。如果動(dòng)物的重量承受在經(jīng)切割的爪子(通過注意到該爪子變白或者壓在網(wǎng)上評(píng)估)，那么得分為0。如果爪子僅皮膚接觸網(wǎng)，皮膚沒有變白或者凹陷，那么得分為1。如果爪子完全離開網(wǎng)，則得分為2。每隔5分鐘觀察每只動(dòng)物1分鐘，共持續(xù)30分鐘。1/2小時(shí)內(nèi)觀察到的6個(gè)得分的總和用于評(píng)估被切割足的疼痛。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在表1和圖1中顯示。
表1手術(shù)后1天用1mg/kg抗NGF抗體拮抗劑和0、10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg或300mg/kg布洛芬處理后，動(dòng)物的累積疼痛得分。數(shù)據(jù)以平均值(SEM)顯示。通過單向方差分析分析數(shù)據(jù)，然后利用Prizm軟件使用用于多重比較的Bonferroni校準(zhǔn)分析個(gè)體對(duì)。
如表1中所示，Mab911(1mg/kg)處理的的靜息疼痛得分顯著低于不用布洛芬的對(duì)照(p＜0.001)。類似地，1mg/kg Mab911和10mg/kg布洛芬處理的靜息疼痛得分顯著低于僅用10mg/kg布洛芬處理的得分(p＜0.001)；1mg/kg Mab911和30mg/kg布洛芬處理的靜息疼痛得分顯著低于僅用30mg/kg布洛芬處理的得分(p＜0.05)。圖1給出了用或不用1mg/kg抗NGF抗體處理，和用或不用多種劑量的布洛芬處理的動(dòng)物的靜息疼痛得分。手術(shù)前用抗NGF抗體和布洛芬處理在降低靜息疼痛中比僅用布洛芬或者僅用抗體處理更有效。將理解Mab911(1mg/kg)處理聯(lián)合10mg/kg布洛芬至少和僅用300mg/kg布洛芬一樣有效。
為了試驗(yàn)用抗NGF單克隆抗體911聯(lián)合雙氯酚酸鈉治療手術(shù)后疼痛的效果，如上述實(shí)施實(shí)驗(yàn)，只是對(duì)動(dòng)物施用載體或者5mg/kg雙氯酚酸鈉代替布洛芬。結(jié)果在圖2中顯示。與僅用5mg/kg雙氯酚酸鈉處理相比，用1mg/kg和5mg/kg雙氯酚酸鈉處理觀察到平均疼痛得分減小。
盡管為了明確地理解，通過說明和實(shí)施例較為詳細(xì)地描述了前述發(fā)明，但是不應(yīng)將所述描述和實(shí)施例理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
權(quán)利要求
1.治療個(gè)體疼痛的方法，其包括對(duì)該個(gè)體施用有效量的抗神經(jīng)生長因子(NGF)抗體和NSAID。
2.權(quán)利要求1的方法，其中NSAID選自布洛芬、萘普生、消痛靈、雙氯酚酸鈉、酮基布洛芬、托美汀、slindac、甲芬那酸、甲氯芬那酸、二氟尼柳、氟苯沙酸、piroxim、噻氧噻嗪、伊索昔康、塞來昔布、羅非克西、DUP-697、氟舒胺、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸、MK-966、nabumetone、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614。
3.權(quán)利要求1的方法，其中NSAID為布洛芬。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中抗NGF抗體結(jié)合人NGF。
5.權(quán)利要求4的方法，其中抗NGF抗體以約10nM或者低于約10nM的結(jié)合親和力結(jié)合人NGF。
6.權(quán)利要求1的方法，其中抗NGF抗體為人抗體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中抗NGF抗體為人源化抗體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中人源化抗體為含有SEQ ID NO1所示的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO2所示的輕鏈可變區(qū)的抗體。
9.權(quán)利要求1的方法，其中疼痛為手術(shù)后疼痛。
10.權(quán)利要求4的方法，其中疼痛為手術(shù)后疼痛。
11.權(quán)利要求8的方法，其中疼痛為手術(shù)后疼痛。
12.治療疼痛的藥物組合物，其含有有效量的抗NGF抗體和NSAID以及可藥用載體。
13.治療疼痛的試劑盒，其含有抗NGF抗體、NSAID和關(guān)于聯(lián)合施用抗NGF抗體和NSAID以治療疼痛的說明書。
全文摘要
本發(fā)明以治療或預(yù)防疼痛的方法為特征，所述方法包括施用一定量的神經(jīng)生長因子拮抗劑(如抗NGF抗體)和一定量的NSAID，以便它們共同提供有效的疼痛減輕。本發(fā)明還以含有神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID的組合物和含有神經(jīng)生長因子拮抗劑和NSAID的試劑盒為特征。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1871028SQ200480007465
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月19日
發(fā)明者D·L·謝爾頓, G·J·韋爾加拉, C·M·洛 申請(qǐng)人:里納特神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)公司