專利名稱：甲砜基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑、合成方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲砜基嘧啶類穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑的設(shè)計(jì)、合成方法及其在蛋白質(zhì)比 較分析中的應(yīng)用，特別是結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸離子化一飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)
方法，實(shí)現(xiàn)快速、高效、靈敏的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)是繼基因組學(xué)后生命科學(xué)領(lǐng)域最具甜景的新興學(xué)科之一，其研究最初的目 標(biāo)是找到方法以大規(guī)模分離并鑒定蛋白質(zhì)，擺脫以往只能研究單個(gè)或少數(shù)蛋白質(zhì)狀態(tài)，目 前已形成相對(duì)成熟的技術(shù)和有效的研究手段。隨著工作的不斷深入，人們巳不再滿足于對(duì) 一個(gè)混合體系中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，要求更加準(zhǔn)確的定量分析，其中一項(xiàng)關(guān)鍵內(nèi)容， 就是通過(guò)比較JH常與異常細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，進(jìn)而找到此環(huán)境下密切相 關(guān)的差異蛋白所引發(fā)的疾病，從而為臨床診斷、病理研究、新藥開發(fā)等提供理論依據(jù)(參 見(jiàn)Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1996, 13， 19-50; Trends Biochem. Sci. 2006， 31， 473-484)。
過(guò)去，主要采用二維差異凝膠電泳(DIGE)技術(shù)，來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)差異表達(dá)研究(參見(jiàn) Proteomics 2001， 1,377-396)。但是作為分離手段的二維凝膠電泳，有著其固有的缺點(diǎn)，如 對(duì)于分離強(qiáng)酸性及強(qiáng)堿性蛋白，含量低的蛋白，及某些膜蛋白，結(jié)果都不能令人滿意，同 時(shí)這種方法的自動(dòng)化程度難以提高，再加上其在進(jìn)行蛋白比較分析方面的局限性(參見(jiàn)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 17, 93卯-9395; Trends Anal. Chem. 2003， 22, 273-281 )，都促使 了新方法的發(fā)展和應(yīng)用。
近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，特別是軟電離技術(shù)一電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助 激光解吸電離(MALDI)的出現(xiàn)和發(fā)展，使得質(zhì)譜成為蛋白組學(xué)研究中閂益重要的分析手 段。其中，適合于質(zhì)譜檢測(cè)的同位素標(biāo)記方法很令人關(guān)注。這種同位素標(biāo)記方法包括體內(nèi)和體外標(biāo)記兩種。體內(nèi)標(biāo)記是在培養(yǎng)液中引入同位素標(biāo)記部分(參見(jiàn)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96, 6591-6596; Mol. Cell. Proteomics 2002, 1, 376-386)，其應(yīng)用范圍有限，不能 直接對(duì)從組織中提取的細(xì)胞進(jìn)行分析；而體外標(biāo)記中，同位素標(biāo)記部分是在分析過(guò)程中引 入，因其應(yīng)用所受到的限制較少，所以近年來(lái)受到重視。其中，最早出現(xiàn)的穩(wěn)定同位素親 和標(biāo)記(ICAT)試劑是目前應(yīng)用最廣泛的同位素標(biāo)記試劑(參見(jiàn)Nat. Biotechnol. 1999,10, 994-999)，并且己經(jīng)商品化，蛋白的標(biāo)記、分離都可以依賴ICAT試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而在實(shí) 際應(yīng)用過(guò)程中也出現(xiàn)了許多問(wèn)題，如標(biāo)簽部分質(zhì)量過(guò)大，影響多肽的檢測(cè)以及增加數(shù)據(jù)庫(kù) 搜索的復(fù)雜性；非特異性吸附、不可逆吸附和容量低等缺陷。此后一系列改良的ICAT試 劑和其它類型的標(biāo)記試劑不斷的涌現(xiàn)(參見(jiàn)Nat. Biotechnol. 2002, 20， 512-515; Anal. Chem. 2002, 74， 4969-4979; Mol. Cell. Proteomics 2004， 3， 1154-1169)，使質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)定量研
究方面的能力大大提高。然而這些技術(shù)依然存在許多不完善之處，比如同位素標(biāo)記試劑 高昂的成本，標(biāo)記效率的有限性及后續(xù)的分離檢測(cè)過(guò)程引入的定量誤差等。
本發(fā)明要解決的問(wèn)題是1)提供一種甲砜基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑；2)提供上述同 位素標(biāo)記試劑中重質(zhì)試劑的合成方法;3)提供上述同位素標(biāo)記試劑在蛋白質(zhì)比較分析中的 應(yīng)用方法。
本發(fā)明方法涉及到的這種同位素標(biāo)記試劑，化學(xué)名為[山]-/[山]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基 嘧啶(簡(jiǎn)寫為[d()]-/[d6]-DMMSP)，其結(jié)構(gòu)如下
A
A為甲砜基部分，作為同位素標(biāo)記的活性部位，用來(lái)特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)或者多肽片段 結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸殘基；
B為嘧啶環(huán)部分，作為提高質(zhì)譜信號(hào)的功能部位，用來(lái)提高目標(biāo)多肽或蛋白質(zhì)的離子 化效率，進(jìn)一歩增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)值；

發(fā)明內(nèi)容
X=Hd。]陽(yáng)DMMSP X=D fd6j-DMMSPC為兩個(gè)甲氧基部分，作為同位素質(zhì)量標(biāo)簽部位，含有6個(gè)氫/氘，用于基于質(zhì)譜的蛋 白質(zhì)比較分析。
本發(fā)明所涉及的重質(zhì)同位素標(biāo)記試劑一[d6]-DMMSP，其合成方法如下式所示
H CX3OD/CD3ONa 04 Tf T T"D U -D U D
SChh
SCH，
S〇2CH: [d6]-DMMSP
4，6-二氯-2-甲硫基嘧啶溶于無(wú)水気代甲醇(methanol-d4)中，逐步滴加到気代甲醇鈉 溶液中。其中気代甲醇鈉溶液是通過(guò)金屬鈉溶于無(wú)水氘代甲醇中制備而成的。反應(yīng)液在室 溫下攪拌過(guò)夜，溫度優(yōu)選為25 。C，時(shí)間優(yōu)選為8小時(shí)，過(guò)濾濃縮，然后溶解在去離子水 中，用二氯甲烷萃取。合并有機(jī)相，干燥，優(yōu)選無(wú)水硫酸鈉，旋干，可得到中間體-[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲硫基嘧啶的粗產(chǎn)物。
將上一歩驟中的粗產(chǎn)物溶于無(wú)水二氯甲烷，加入3-氯過(guò)氧苯甲酸(mCPBA)，兩種底 物的摩爾比優(yōu)選為1:4?；旌衔镌谑覝叵聰嚢瑁瑴囟葍?yōu)選為30。C，時(shí)間優(yōu)選為5小時(shí)，之 后用飽和硫代硫酸鈉水溶液淬滅反應(yīng)。有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，合并水層，用 二氯甲烷萃取。然后合并有機(jī)相，干燥，優(yōu)選無(wú)水硫酸鎂，旋干，得到最終的粗產(chǎn)品。經(jīng) 過(guò)柱層析，得到重質(zhì)同位素標(biāo)記試劑一[d6]-4，6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶([d6]-DMMSP)。
本發(fā)明提供了一種將上述試劑應(yīng)用于半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽以及蛋白質(zhì)的定性 和相對(duì)定量分析中的方法，此方法包括下列歩驟
a) 目標(biāo)分析物經(jīng)變性、還原、酶解；
b) 目標(biāo)分析物與前述輕質(zhì)或重質(zhì)的同位素標(biāo)記試劑反應(yīng)；
c) 將標(biāo)記后的樣品溶液直接進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。 上述測(cè)定方法優(yōu)選的反應(yīng)條件如下
所述的a)歩驟是將目標(biāo)分析物(一對(duì))置于緩沖溶液中，加入變性劑和還原劑，進(jìn)
行蛋白質(zhì)的變性和還原后，將溶液稀釋之后加入胰蛋白酶酶解；所述的b)步驟是在目標(biāo) 分析物溶液中分別加入一對(duì)同位素標(biāo)記試劑，反應(yīng)兩小時(shí)，所述的c)步驟是將反應(yīng)后的 樣品溶液等量混合，進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。
上述的目標(biāo)分析物可以是半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)混合物或 不同生理狀態(tài)下的生物體蛋白提取物。
所述的緩沖溶液中優(yōu)選含有0.03M的碳酸氫按，pH8.2，優(yōu)選將目標(biāo)分析物置于此溶 液中進(jìn)行變性和還原。
所述的變性劑優(yōu)選是尿素，加入量為濃度8 M。所述的還原劑優(yōu)選是二硫蘇糖醇 (DTT)，加入比例優(yōu)選是二十倍的蛋白摩爾數(shù)。變性還原條件優(yōu)選是37。C， 6小時(shí)。
所述的樣品溶液優(yōu)選在1 mg/mL的濃度下完成變性和還原操作，然后在稀釋至0.5 mg/mL的濃度下，按重量比50:1加入胰蛋白酶，在37 °C酶解8小時(shí)。
所述的標(biāo)記反應(yīng)優(yōu)選在pH 6.5條件下進(jìn)行，酶解過(guò)程完成后，用乙酸進(jìn)行pH值的調(diào)整。
所述的還原、變性、酶解過(guò)程及標(biāo)記反應(yīng)優(yōu)選在恒溫恒濕箱內(nèi)完成。
MALDI-TOFMS分析所用的優(yōu)選條件是基質(zhì)為a-氰基-4-羥基肉桂酸(cx-CHCA)， 溶于含0.1。/。三氟乙酸的1:1乙腈/水溶液中，濃度為6mg/mL;數(shù)據(jù)采集均在正離子、反射 模式下進(jìn)行。
之后圖譜解析，進(jìn)行定性及相對(duì)定量分析。
本發(fā)明在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、蛋白質(zhì)定性與相對(duì)定量研究中有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn) 首先，本發(fā)明用于特異性標(biāo)記半胱氨酸的巰基側(cè)鏈，在質(zhì)譜分析的過(guò)程中更有針對(duì)性，在 一定程度上降低了圖譜解析的復(fù)雜程度。在蛋白質(zhì)鑒定時(shí)，只有含有半胱氨酸的多肽片斷 在標(biāo)記反應(yīng)完成后，能夠產(chǎn)生138Da的質(zhì)量位移("輕"同位素標(biāo)記)，通過(guò)標(biāo)記前后圖譜 的比較，很容易確認(rèn)哪些多肽片斷是含有半胱氨酸的，以及含有幾個(gè)半胱氨酸。而在蛋白 質(zhì)相對(duì)定量時(shí)，分析的目標(biāo)主要是尋找質(zhì)荷比相差6Da的成對(duì)出現(xiàn)的多肽信號(hào)，它們的相 對(duì)強(qiáng)度比反映了實(shí)際樣品中蛋白質(zhì)的濃度比。
其次，此發(fā)明的標(biāo)記部分相對(duì)較小(138Da)，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，性質(zhì)比較穩(wěn)定，在質(zhì)譜 分析時(shí)不會(huì)產(chǎn)生干擾圖譜解析的碎片離子，也不會(huì)使數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索復(fù)雜化。同時(shí)，由于標(biāo)
記試劑分子中含有嘧啶環(huán)，標(biāo)記后可以增加半胱氨酸殘基的堿性，提高目標(biāo)肽段的質(zhì)譜信 號(hào)，有利于提高蛋白質(zhì)鑒定或比較分析結(jié)果的可信性和準(zhǔn)確性。
最后，本發(fā)明中采用直接MALDI-TOF MS分析方法，操作簡(jiǎn)便，樣品不經(jīng)任何分離 純化歩驟，降低了由此帶來(lái)的影響相對(duì)定量結(jié)果的誤差。體系中含有胰蛋白酶、過(guò)量的變 性劑(尿素)、還原劑(DTT)以及標(biāo)記試劑，這些物質(zhì)的存在不會(huì)影響蛋白質(zhì)的鑒定以及 相對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。


圖1是應(yīng)用時(shí)的歩驟示意圖。
具體實(shí)施方法
以下具體實(shí)施方法將有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
1. 試劑合成部分
實(shí)施例l: [d6]-4，6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶([d6]-DMMSP)的合成
操作歩驟如下
4，6-二氯-2-甲硫基嘧啶(500mg，2.5mmo1)溶于10 mL無(wú)水気代甲醇中，逐歩滴加到 20 mL気代甲醇鈉溶液中(200 mg金屬鈉溶于20 mL無(wú)水氘代甲醇)。反應(yīng)液在25 °C下 攪拌過(guò)夜后，過(guò)濾濃縮，然后溶解在10mL去離子水中，用二氯甲垸萃取(3x5 mL)。合 并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，旋干，可得到[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲硫基嘧啶的粗產(chǎn)物。
將[d6]-粗產(chǎn)物(400 mg, 2.1 mmol)溶于40 mL無(wú)水二氯甲烷，加入3-氯過(guò)氧苯甲酸 (附CPBA， 1.4 g， 8 mmol)。混合物在30 °C下攪拌5小時(shí)后，用飽和硫代硫酸鈉水溶液淬 滅反應(yīng)。有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(3x20mL)，合并水層，用二氯甲烷萃取(340 mL)。然后合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鎂干燥，旋干，得到最終的粗產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)柱層析(乙 酸乙酯:正己垸=1:3),得到重質(zhì)同位素標(biāo)記試劑——[4]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶 ([d6]-DMMSP, 400 mg, 67%,白色固體)。
2. 試劑應(yīng)用部分應(yīng)用原理如下式:
實(shí)施例2:混合多肽的標(biāo)記反應(yīng) 操作歩驟如下
1. 多肽混合物His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp (HW扁6)， angiotensin I human acetate hydrate (DL-IO)， [Glu']-fibrinopeptide B human (ER-14)禾卩neurotensin (EL-13)各l |amol，溶
于500 (iL的0.03 M的碳酸氫銨緩沖溶液中(pH 8.0-8.2)，加入二硫蘇糖醇(DTT) 2 pmol, 用醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。
2. 向配好的多肽溶液中加入[do]-DMMSP (5 nmol)，修飾反應(yīng)在37 °C恒溫恒濕箱中 進(jìn)行2小時(shí)。
3. MALDI-TOFMS分析條件為基質(zhì)a-氰基-4-羥基肉桂酸(a-CHCA)，溶于含0.1% 三氟乙酸的1:1乙腈/水溶液中，濃度為6mg/mL;數(shù)據(jù)采集在正離子、反射模式下進(jìn)行。
MALDI-TOF MS分析結(jié)果如下
1. 只有含半胱氨酸殘基的多肽(HW-6)的[M+H]+峰消失，發(fā)生了標(biāo)記反應(yīng)，質(zhì)量增 加了 138 Da;而其余不含半胱氨酸殘基的多肽(DL-10、 ER-14和EL-13)的[M+H]+峰都 可以檢測(cè)到，沒(méi)有被標(biāo)記。這說(shuō)明標(biāo)記試劑對(duì)于多肽片段中半胱氨酸殘基的巰基側(cè)鏈具有 很高的特異性，且反應(yīng)完全、活性高。
2. 進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)以后，含半胱氨酸殘基的多肽(HW-6)信號(hào)大幅增強(qiáng)，而其余不含 半胱氨酸殘基的多肽信號(hào)受到明顯抑制，峰強(qiáng)度很低。說(shuō)明標(biāo)記試劑的巰基特異性反應(yīng)可
以提高目標(biāo)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)能力，有利于低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析。
實(shí)施例3:蛋白質(zhì)的比較分析 實(shí)驗(yàn)歩驟如附圖1所示。 操作步驟如下
1. 兩份溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品0.9 mg和1 mg分別溶于500 30 mmol/L碳酸氫銨緩沖溶液 中(pH 8.0-8.2，內(nèi)含8M尿素)，再分別加入DTT 2 iumol，置于37 。C恒溫恒濕箱中保 溫6小時(shí)。
2. 冷卻后，兩份溶菌酶溶液分別用30 mmol/L碳酸氫銨緩沖溶液(pH 8.0-8.2)稀釋 至lmL,按胰蛋白酶/溶菌酶為l:50(vv/w)的比例加入胰蛋白酶溶液，置于37。C恒溫恒 濕箱中酶解過(guò)夜。
3. 兩份溶菌酶酶解產(chǎn)物分別用30 mmol/L碳酸氫銨緩沖溶液(pH 8.0-8.2)稀釋至2 mL，用醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.5后，向第一份酶解產(chǎn)物溶液中加入[d。]-DMMSP(5|Limol)， 第二份酶解產(chǎn)物溶液中加入[d6]-DMMSP(5 pmol)，共同放置于37 °C恒溫恒濕箱中，2小 時(shí)后進(jìn)行等體積混合，稀釋后進(jìn)行質(zhì)譜分析。
4. MALDI-TOF MS分析條件為基質(zhì)a-氰基-4-羥基肉桂酸(a-CHCA)，溶于含0.1%
三氟乙酸的1:1乙腈/水溶液中，濃度為6mg/mL;數(shù)據(jù)采集在正離子、反射模式下進(jìn)行。
MALDI-TOF MS分析結(jié)果如下
1. 通過(guò)對(duì)酶解產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析，獲得了溶菌酶的典型酶解片段的信號(hào)， 共有16條肽段被檢測(cè)出，其中9條為含有半胱氨酸的多肽。肽段的歸屬是應(yīng)用ExPASy Molecular Biology Server上的PeptideMass工具進(jìn)行檢索得到的(http:〃cn.expasy.org/tools/)。
2. 進(jìn)行同位素標(biāo)記以后，上述9條含有半胱氨酸的多肽質(zhì)荷比(m/z)都增加了 138 Da ([do]-DMMSP標(biāo)記)或144 Da ([d6]-DMMSP標(biāo)記)；而其它不含半胱氨酸的多肽質(zhì)荷比 (m/z)不變。
3. 在MALDI-TOF MS圖譜中，檢測(cè)到一系列相鄰并成對(duì)出現(xiàn)的信號(hào)，質(zhì)量數(shù)相差6 Da，每一對(duì)峰即對(duì)應(yīng)著一個(gè)被標(biāo)記的半胱氨酸肽段(m/z為肽段分子量+標(biāo)記部分分子量138/144 Da)。每一對(duì)多肽信號(hào)的強(qiáng)度比值與樣品溶液中溶菌,的含量比值一致，定量的誤 差小于4%。
權(quán)利要求
1.一種甲砜基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑，化學(xué)名為[d6]-4，6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶，其結(jié)構(gòu)式如下
2. 如權(quán)利要求1所述的甲砜基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑的合成方法，其特征是通過(guò)下述歩驟合成4,6-二氯-2-甲硫基嘧啶溶于無(wú)水氘代甲醇中，逐步'滴加到氘代甲醇鈉溶液 中，其中氘代甲醇鈉溶液是通過(guò)金屬鈉溶于無(wú)水気代甲醇中制備而成的，反應(yīng)液 在室溫下攪拌8小時(shí)；過(guò)濾濃縮，然后溶解在去離子水中，用二氯甲烷萃??；合 并有機(jī)相，干燥，旋干，得到中間體一[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲硫基嘧啶的粗產(chǎn)物； 將上述的粗產(chǎn)物溶于無(wú)水二氯甲烷，加入3-氯過(guò)氧苯甲酸，混合物在室溫下攪拌 2小時(shí)，之后用飽和硫代硫酸鈉水溶液淬滅反應(yīng)；有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉水溶液 洗滌，合并水層，用二氯甲垸萃?。蝗缓蠛喜⒂袡C(jī)相，干燥，旋干，得到最終的 粗產(chǎn)品；再經(jīng)過(guò)柱層析，得到重質(zhì)同位素標(biāo)記試劑一[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基 嘧啶。
3. —種如權(quán)利要求1所述的甲砜基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑的用途，其特征 是用于半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽或蛋白質(zhì)的定性和相對(duì)定量分析。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征是采用下述歩驟a) 目標(biāo)分析物半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽或蛋白質(zhì)經(jīng)變性、還原、酶解；b) 目標(biāo)分析物與輕質(zhì)的同位素標(biāo)記試劑[do]-4，6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶或 重質(zhì)的同位素標(biāo)記試劑[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶反應(yīng)；c) 將標(biāo)記后的樣品溶液直接進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化一飛行時(shí)間質(zhì)譜 分析。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征是所述的a)步驟是將目標(biāo)分析物(一 對(duì))置于緩沖溶液中，加入變性劑和還原劑，進(jìn)行蛋白質(zhì)的變性和還原后，將溶 液稀釋之后加入胰蛋白酶酶解；所述的b)步驟是在目標(biāo)分析物溶液中分別加入 一對(duì)同位素標(biāo)記試劑即輕質(zhì)的同位素標(biāo)記試劑[d。]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶和 重質(zhì)的同位素標(biāo)記試劑[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶反應(yīng)兩小時(shí)，所述的c)歩 驟是將b)歩驟反應(yīng)后的二種樣品溶液等量混合，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化 一飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是所述的目標(biāo)分析物是半胱氨酸、含 半胱氨酸的多肽、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)混合物或不同生理狀態(tài)下生物組織的蛋白 提取物。
7. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是所述的緩沖溶液中含有0.03M的碳 酸氫銨，pH8.2，將目標(biāo)分析物置于此溶液中進(jìn)行變性和還原。
8. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是所述的變性劑是尿素，加入量為濃 度8M;所述的還原劑是二硫蘇糖醇，加入比例是二十倍的蛋白摩爾數(shù)；變性還 原條件是37。C， 6小時(shí)。
9. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是所述的樣品溶液在1 mg/mL的濃度 下完成變性和還原操作，然后在稀釋至0.5 mg/mL的濃度下，按重量比50:1加 入胰蛋白酶，在37 。C酶解8小時(shí)。
10. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是所述的標(biāo)記反應(yīng)在pH 6.5條件下進(jìn) 行，酶解過(guò)程完成后，用乙酸進(jìn)行pH值的調(diào)整。
11. 如權(quán)利要求5的用途，其特征是所述的還原、變性、酶解過(guò)程及標(biāo)記反 應(yīng)均在恒溫恒濕箱內(nèi)完成。
12. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是基質(zhì)輔助激光解吸離子化一飛行時(shí) 間質(zhì)譜分析所用的條件是基質(zhì)為a-氰基-4-羥基肉桂酸，溶于含0.1%三氟乙酸 的1:1乙腈/水溶液中，濃度為6mg/mL;數(shù)據(jù)采集均在正離子、反射模式下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甲砜基嘧啶類穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑的設(shè)計(jì)、合成方法及其在蛋白質(zhì)比較分析中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的同位素標(biāo)記試劑化學(xué)名為[d₆]-4，6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶。該試劑應(yīng)用于半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽以及蛋白質(zhì)的定性和相對(duì)定量分析，此方法包括下列步驟a)目標(biāo)分析物經(jīng)變性、還原、酶解；b)目標(biāo)分析物與前述輕質(zhì)或重質(zhì)的同位素標(biāo)記試劑反應(yīng)；c)將標(biāo)記后的樣品溶液直接進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101339187SQ20081004175
公開日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者菁 張, 郭寅龍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所