與家蠶核型多角體病毒感染相關(guān)的microRNA的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及家蠶microRNA，尤其涉及一種與家蠶核型多角體病毒感染相關(guān)的 mi croRNA的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 家香核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)屬昆蟲桿狀 病毒科(1^(3111〇￥；[1^(1&6)，核型多角體病毒屬(1'|11(316(^017116(11'0￥；[1'118)，病毒粒子為桿狀， 基因組大小約為128kb，編碼約100多個(gè)基因。該病毒傳染性極強(qiáng)，難以控制，暴發(fā)頻繁，給養(yǎng) 蠶業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在宿主昆蟲細(xì)胞內(nèi)，BmNPV DNA的復(fù)制及基因的表達(dá)是一種有 序發(fā)生的級聯(lián)事件，其感染過程依賴于其基因的階段性調(diào)節(jié)和依次表達(dá)，即前一階段的基 因產(chǎn)物直接或間接的反式作用于下一階段的基因轉(zhuǎn)錄。病毒感染早期，轉(zhuǎn)錄激活因子可以 誘導(dǎo)桿狀病毒基因的表達(dá)并選擇性的調(diào)控特定種類的宿主基因的表達(dá)從而建立感染。感染 晚期階段主要是病毒DNA的復(fù)制和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
[0003] MicroRNA是一類小的非編碼RNA，廣泛存在于動物、植物和病毒等生物中。RNA干擾 (RNA interference)作為一種先天的抵抗病毒感染的防御機(jī)制最早是在植物中發(fā)現(xiàn)的，隨 后發(fā)現(xiàn)，RNA干擾在昆蟲自身免疫體系中也扮演著重要角色。microRNA廣泛參與包括生長發(fā) 育、細(xì)胞凋亡、腫瘤、抗病毒等一系列重要的生命過程。研究表明，宿主編碼的microRNA在受 到病毒感染后，其表達(dá)水平會發(fā)生顯著變化。差異表達(dá)的microRNAs可能是由宿主免疫應(yīng)答 反應(yīng)引起或由病毒感染誘導(dǎo)的調(diào)控因子導(dǎo)致。另一方面，病毒編碼的miRNA也可調(diào)控自身與 病毒復(fù)制相關(guān)基因或宿主免疫相關(guān)基因，從而進(jìn)一步增加了宿主-病毒互作的復(fù)雜性。
[0004] 目前，與家蠶核型多角體病毒感染相關(guān)的microRNA研究較少，因此本領(lǐng)域需要鑒 定出相關(guān)microRNA或者對已知microRNA功能及用途進(jìn)行研究，為研究家蠶與核型多角體病 毒的互作機(jī)制提供基礎(chǔ)，同時(shí)為家蠶核型多角體病毒的檢測及防治提供新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明開拓了家蠶microRNA特別是bmo-miR-277-5p的新用途。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供了 bm〇-miR-277-5p在制備檢測家蠶核型多角體病毒感染的試劑盒中 的應(yīng)用。
[0008] bm〇-miR-277_5p為家香(Bombyx mori)的一種microRNA，與家香核型多角體病毒 感染緊密相關(guān)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，GenBank登錄號為LM381765.1。實(shí)驗(yàn)證 明，bm〇-miR-277-5p在感染BmNPV的家蠶中的表達(dá)水平顯著高于正常家蠶中的表達(dá)水平。因 此，可利用bm〇-miR-277_5p，制備試劑盒，通過檢測bm〇-miR-277_5p的表達(dá)水平，判斷家蠶 是否被BmNPV所感染。
[0009] 所述家蠶為家蠶的幼蟲。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種檢測家蠶核型多角體病毒感染的試劑盒，該試劑盒用于檢測 家蠶中bm〇-miR-277-5p的表達(dá)水平。通過檢測bm〇-miR-277-5p與對照的表達(dá)水平，進(jìn)行比 較，判斷家蠶是否被BmNPV所感染:如果待判定家蠶的bm〇-miR-277-5p的表達(dá)水平顯著高于 對照的表達(dá)水平，則提示家蠶已被BmNPV感染，否則則提示未被BmNPV感染。本發(fā)明中，所述 的顯著是指具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性，P<〇.05。
[0011] 本發(fā)明中所述的對照為未感染BmNPV的正常家蠶。
[0012]所述的試劑盒包含檢測家蠶bm〇-miR-277-5p的熒光定量PCR擴(kuò)增的引物以及反轉(zhuǎn) 錄引物。
[0013] 所述熒光PCR擴(kuò)增的引物包括如SEQ ID N0.4所示堿基序列的正向引物和如SEQ ID NO.5所示堿基序列的反向引物。
[0014] 在熒光PCR擴(kuò)增中，引物是核心與關(guān)鍵，本發(fā)明針對序列特別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物，除 了擴(kuò)增引物，熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中還包括酶、緩沖液、dNTP和染料，這些可采用市面成熟 的商用產(chǎn)品，也可自行配置。
[0015] 內(nèi)參可采用U6SnRNA，所述的內(nèi)參引物包括如SEQIDN0.6所示堿基序列的正向引 物和如SEQ ID N0.7所示堿基序列的反向引物。
[0016] 所述的熒光定量PCR試劑盒，還包括反轉(zhuǎn)錄試劑。所述的反轉(zhuǎn)錄試劑包括如SEQ ID NO. 3所示堿基序列的莖環(huán)引物。
[0017]通常，反轉(zhuǎn)錄試劑包括反轉(zhuǎn)錄酶、莖環(huán)引物、緩沖液、dNTP，其中，反轉(zhuǎn)錄酶、緩沖 液、dNTP為市面成熟的商用產(chǎn)品，也可自行配置。
[0018]本發(fā)明還提供了 bm〇-miR-277-5p在抑制基因表達(dá)中的應(yīng)用，所述的基因轉(zhuǎn)錄后的 mRNA具有如SEQ ID從).12所示序列的3'17^。
[0019 ] m i cr oRNA能夠與mRNA的3 '非翻譯區(qū)結(jié)合，降解mRNA，從而抑制基因表達(dá)。
[0020]所述的基因?yàn)榧倚QDNA胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，Dnmt2基因 (NM_001043469.1)是bm〇-miR-277-5p的潛在靶基因，3'UTR的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果 表明，bm〇-miR-277-5p可以通過與Dnmt2基因的3'UTR結(jié)合來抑制Dnmt2基因的表達(dá)。
[0021 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括：
[0022]本發(fā)明通過莖環(huán)熒光定量PCR技術(shù)檢測得到一種與家蠶核型多角體病毒感染相關(guān) 的microRNA，該microRNA為家蠶基因組編碼的miR-277-5p，可為研究家蠶與核型多角體病 毒的互作機(jī)制提供新的研究方向，同時(shí)為家蠶核型多角體病毒的防治提供新的思路。
[0023] 本發(fā)明還首次證實(shí)了Dnmt2基因?yàn)閎m〇-miR-277_5p的革巴基因，可用bm〇-miR-277- 5p抑制相關(guān)基因的表達(dá)水平。
[0024]本發(fā)明還提供了 bm〇-miR-277-5p在制備檢測家蠶核型多角體病毒感染的試劑盒 中的應(yīng)用，并提供了試劑盒，既方便使用，又可保證結(jié)果的一致性，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià) 值，為家蠶核型多角體病毒感染檢測提供新的檢測手段，且分子檢測具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確 的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0025]圖1為莖環(huán)熒光定量PCR技術(shù)檢測家蠶bm〇-miR-277-5p的相對表達(dá)量的結(jié)果圖；
[0026] 圖2為bm〇-miR-277-5p與Dnmt2基因3'UTR的靶點(diǎn)結(jié)合示意圖；
[0027] 圖 3 為pmirGL〇-Dnmt2_3 ' UTR 及pmirGL〇-Dnmt2_3 ' UTR-mut 載體構(gòu)建不意圖；
[0028] 圖4為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證bm〇-miR-277-5p靶作用于Dnmt2基因的結(jié)果 圖，其中，數(shù)值表示為Mean 土 STDVE，#為P < 0.01。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法或按照制造廠商所 建議的條件;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0030] 實(shí)施例1應(yīng)用莖環(huán)熒光定量PCR試劑盒檢測bm〇-miR-277-5p在BmNPV感染家蠶中和 正常家蠶中的表達(dá)水平。
[0031] 1莖環(huán)熒光定量PCR試劑盒的組成
[0032] 本發(fā)明莖環(huán)熒光定量PCR試劑盒由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴(kuò)增系統(tǒng)以及內(nèi)參引物組成，具體 如下：
[0033] (1)反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由gDNA Eraser、5XgDNA Eraser Buffer'PrimeScript RT Enzyme Mix I、5XPrimeScript Buffer(除莖環(huán)引物外，其他反轉(zhuǎn)錄試劑購自TaKaRa公 司）、莖環(huán)引物(序列如SEQIDN0.3所示）、RNase-freeddH20組成 ；
[0034] (2)擴(kuò)增系統(tǒng)由2XSYBR Premix Ex Taq(購自TaKaRa公司）、bm〇-miR-277_5p正向 引物（序列如SEQIDN0.4所示）、bmo-miR-277-5p反向引物（序列如SEQIDN0.5所示）、 ddH20組成；
[0035] (3)內(nèi)參為U6snRNA(snU6)，其正向引物的序列如SEQ ID N0.6所示，反向引物的序 列如SEQ ID N0.7所示。
[0036] 試劑盒中的引物序列如下：
[0037] 莖環(huán)引物（SEQ ID N0.3):
[0038] 5 '-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCAAACGC-3 '；
[0039] bm〇-miR-277-5p正向引物（SEQ ID N0.4):
[0040] 5，-ACACTCCAGCTGGGTCGTGCCAGGAGT-3，；
[0041] bm〇-miR-277-5p反向引物（SEQ ID N0.5):5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。
[0042] 內(nèi)參正向引物（SEQ ID N0.6):5'-CGTATACTAAAATTGGAACGATACAG-3'；
[0043] 內(nèi)參反向引物（SEQ ID N0.7):5'-ATTTTGCGTGTCATCCTTGC-3'。
[0044] 2莖環(huán)熒光定量PCR試劑盒的應(yīng)用
[0045] 步驟一，采用Trizol法提取待檢樣本(樣本為家蠶的幼蟲)的RNA。具體流程如下：
[0046] (1)將BmNPV感染家蠶和正常家蠶分別放入加有液氮的研缽中，用研杵迅速將樣品 砸碎并磨成粉末，分裝到無 RNA酶(RNase-free)的1.5mL Eppendorf管中，每0. lg組織加 lmL Trizol，樣品體積應(yīng)小于Trizol體積的10% ;
[0047] (2)振蕩混勻，室溫溫育約1 Omin，12000g，4°C離心1 Omin;
[0048] (3)將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的離心管中，每mL加入0.2mL氯仿，即加入上清1/5體積 的氯仿，劇烈搖動15s，室溫放置5min，12000g，4°C離心15min;混合物分成下層的紅色苯酸-氯仿相，中間的蛋白質(zhì)沉淀和上層無色水相。RNA即位于上清液；
[0049] (4)將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈離心管中，等體積加入預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻， 室溫靜置l〇min，12000g，4°C離心10min，留下RNA沉淀，棄上清；
[0050] (5)加入 75% 乙醇，lmL Trizol 加 lmL 75% 乙醇，渦旋混勻，7500g，4°C 離心