專利名稱：：半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本技術(shù)屬于魚類遺傳育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種誘導(dǎo)半滑舌鰨卵進(jìn)行雌核發(fā)育，獲得雌核發(fā)育二倍體魚苗的方法，可應(yīng)用于半滑舌鰨全雌苗種的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：半滑舌鰨(Cynoglossussemiliaevis)是我國(guó)特有的一種名貴經(jīng)濟(jì)海水魚類，屬于近海溫水性底層魚類，我國(guó)沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由于其味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者歡迎，其市場(chǎng)價(jià)值極高，養(yǎng)殖前景非常廣闊。半滑舌鰨是目前海水魚類養(yǎng)殖的主要品種之一，其養(yǎng)殖產(chǎn)量目前近萬(wàn)噸，價(jià)格昂貴，市場(chǎng)價(jià)達(dá)到150元/500克左右，半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)目前每年的產(chǎn)值約為15億元人民幣。鑒于半滑舌鰨的養(yǎng)殖潛力和潛在的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益，近年來(lái)，我國(guó)科技工作者對(duì)半滑舌鰨生殖調(diào)控和自然產(chǎn)卵技術(shù)進(jìn)行了大量研究工作，主要采用人工控制光照和水溫的方法刺激半滑舌鰨親魚成熟和自然產(chǎn)卵，該項(xiàng)技術(shù)于2002年獲得成功，在人工養(yǎng)殖條件下，通過(guò)控制親魚養(yǎng)殖池的水溫和光照時(shí)間，誘導(dǎo)半滑舌鰨親魚成熟并自然產(chǎn)卵，獲得了半滑舌鰨受精卵，并生產(chǎn)出了半滑舌鰨苗種(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，姜言偉等，1993；柳學(xué)周等，2006)。這種半滑舌鰨育苗方式，基本上是以人工控溫、控光刺激親魚成熟和在養(yǎng)殖池中進(jìn)行自然產(chǎn)卵和自然受精，這種生產(chǎn)模式的可操作性較差，親魚產(chǎn)卵率較低，受精率較低，不利于有計(jì)劃的安排生產(chǎn)，影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成；特別是這種育苗方式不能獲得半滑舌鰨的未受精卵，嚴(yán)重影響了半滑舌鰨雌核發(fā)育和性別控制技術(shù)的建立和全雌苗種的生產(chǎn)，影響了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，開展半滑舌鰨人工催產(chǎn)技術(shù)的研究，建立通過(guò)注射激素使親魚同步發(fā)育和排卵的技術(shù)，獲得未受精卵，是進(jìn)行半滑舌鰨規(guī)?；绾腿斯ご坪税l(fā)育研究中急需解決的一大難題。而有關(guān)通過(guò)激素注射進(jìn)行半滑舌鰨人工催產(chǎn)、獲得未受精卵的研究，目前未見報(bào)道。研究表明，半滑舌鰨雌性個(gè)體和雄性個(gè)體，在生長(zhǎng)速率上存在巨大差別，其雌性個(gè)體比雄性個(gè)體大3-4倍(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，孟田湘等，1988)，半滑舌鰨魚苗經(jīng)過(guò)1年養(yǎng)殖后，雌性個(gè)體可長(zhǎng)到500-750克，而雄性個(gè)體則只有50-150克。由于雄性個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)慢，影響了商品魚的質(zhì)量，降低了半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加了養(yǎng)殖成本，因而嚴(yán)重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，對(duì)半滑舌鰨開展雌核發(fā)育技術(shù)的研究、研制全雌育種技術(shù)，培育半滑舌鰨全雌苗種，在漁業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用全雌苗種，對(duì)于提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量非常重要。如果研制出半滑舌鰨全雌苗種，進(jìn)行大面積推廣后，將極大提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加產(chǎn)量80-100%，每年將增加10多億元的經(jīng)濟(jì)效益。雌核發(fā)育是生產(chǎn)魚類全雌苗種的重要途徑。這條技術(shù)途徑在其它淡水魚類和少數(shù)海水魚類上有過(guò)一些研究，并生產(chǎn)出了一些單性苗種，如對(duì)銀鯽天然雌核發(fā)育機(jī)理進(jìn)行了大量的研究(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，桂建芳等，1996)，我國(guó)最早在鯉魚上建立了人工雌核發(fā)育技術(shù)(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，吳清江，1981)；隨后，在鰱魚也建立了雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，潘光碧等，1995)；同時(shí)，一些學(xué)者也開展了海水魚類牙鲆雌核發(fā)育技術(shù)的研究(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所劉靜等，1999)。不過(guò)，上述魚類的性別決定機(jī)制均為XY型，即雄性為XY型、雌性為XX型性別決定，雌魚只產(chǎn)生一種卵子，即X卵子，而雄魚則產(chǎn)生XY型2種精子。最近，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者開展了半滑舌鰨性別相關(guān)分子標(biāo)記篩選的研究，以及半滑舌鰨性腺發(fā)育和性別轉(zhuǎn)換技術(shù)的研究等項(xiàng)工作，成功地篩選到半滑舌鰨雌性特異AFLP分子標(biāo)記，建立了半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR技術(shù)(黃海水產(chǎn)研究所陳松林等，2007；鄧思平等，2007)，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨雌性個(gè)體存在異型性染色體(周麗青等，2005)。AFLP分子標(biāo)記和染色體分析研究表明，半滑舌鰨為ZW型性別決定機(jī)制，即雌魚產(chǎn)生Z型和W型兩種卵子，而雄魚只產(chǎn)生一種Z型精子。這種ZW型雌魚產(chǎn)生的卵子，經(jīng)雌核發(fā)育后將產(chǎn)生ZZ型雄魚和Wff型超雌魚兩種類型。Wff型超雌魚與ZZ型雄魚交配后將產(chǎn)生全雌苗種。而有關(guān)半滑舌鰨人工雌核發(fā)育技術(shù)以及通過(guò)人工雌核發(fā)育誘導(dǎo)二倍體魚苗產(chǎn)生的技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立人工誘導(dǎo)半滑舌鰨卵子進(jìn)行雌核發(fā)育的技術(shù)方法，培育雌核發(fā)育二倍體魚苗。本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容是按如下方法實(shí)現(xiàn)的雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)方法包括一、半滑舌鰨卵子人工雌核發(fā)育方法；二、雌核發(fā)育魚苗的鑒定方法。一、半滑舌鰨卵子人工雌核發(fā)育方法它的技術(shù)內(nèi)容包括1、精子的遺傳滅活；2、未受精卵與失活精子的“授精”；3、雌核發(fā)育魚卵染色體加倍起始時(shí)間的確定；4、雌核發(fā)育魚卵染色體加倍冷休克溫度及處理時(shí)間的確定。1.精子的遺傳滅活采用異源的花鱸精子和同源的半滑舌鰨精子刺激半滑舌鰨卵子進(jìn)行雌核發(fā)育。半滑舌鰨精液先用顯微鏡檢查精子活力(運(yùn)動(dòng)精子的百分率)，當(dāng)活力達(dá)到60%以上者可用于紫外線滅活處理。精子的遺傳滅活條件為將100μL半滑舌鰨精液用精子稀釋液MPRS(配方為KCl0.39g/L,CaCl22H200.17g/L,NaHCO30.25g/L,NaCl3.59g/L,NaH2PO40.22g/L,MgCl20.23g/L,Glucose1.Og/L)稀釋10倍，平鋪于培養(yǎng)皿中，用90_110mJ/cm2紫外線照射，然后與5-10mL半滑舌鰨卵“授精”。異源精子為冷凍保存的花鱸精子。從液氮中取出花鱸冷凍精子，在37°C水浴復(fù)溫解凍后鏡檢精子活力，活力達(dá)到70%以上者用于紫外線滅活處理。將100μL解凍的花鱸精液用ImLMPRS溶液稀釋后，平鋪于培養(yǎng)皿中，分別用紫外線照射，劑量范圍為20，40，60，80，100，120，140，160mJ/cm2。照射后的精液分別和5-10mL半滑舌鰨卵受精，在22-23°C恒溫培育。結(jié)果表明，90-110mJ/cm2的紫外線照射精子刺激卵雌核發(fā)育的效果較好，胚胎發(fā)育率高。2.未受精卵與滅活精子的“授精”將經(jīng)紫外線照射后的精液200-1000μL加到半滑舌鰨未受精卵(10-100毫升)中，將精卵輕輕搖動(dòng)混勻，隨后加入2-10毫升海水，繼續(xù)混勻后，再加入20-200毫升海水完成“授精”過(guò)程，在22-23°C下培育2-10分鐘，準(zhǔn)備用于染色體加倍處理。3.雌核發(fā)育魚卵染色體加倍起始時(shí)間的確定染色體加倍采用冷休克處理方法，在“授精”后不同時(shí)間(2，3，4，5，6，7，8min)，將卵倒入小抄網(wǎng)(直徑10-15厘米)，然后將盛有雌核發(fā)育卵的小抄網(wǎng)浸入3-6°C的海水浴中進(jìn)行冷休克處理，冷休克處理時(shí)間為20-30min，冷休克處理完畢后將卵移入22_23°C海水中培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)受精率，單倍體率，雌核發(fā)育二倍體率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌核發(fā)育卵在“授精”后4-6min進(jìn)行冷休克處理都能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體，且以“授精”后5min的誘導(dǎo)率最尚ο4.雌核發(fā)育魚卵染色體加倍冷休克溫度和持續(xù)時(shí)間的篩選在確定了冷休克起始時(shí)間后，需要確定冷休克溫度和休克持續(xù)時(shí)間。將與紫外失活精子“授精”的卵，分成6個(gè)溫度梯度2°C，4°C，5°C，6°C，8°C，10°C，在每個(gè)溫度梯度分別處理15min，20min,25min,30min,35min和40min。共計(jì)36組試驗(yàn)。最后統(tǒng)計(jì)受精率，單倍體率，雌核發(fā)育二倍體率。結(jié)果表明在休克溫度3°C_6°C，休克時(shí)間15-30min條件下都可以誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體，其中在4.5-5.5°C處理20-25min的雌核發(fā)育誘導(dǎo)率最高。二、雌核發(fā)育魚苗的鑒定方法它的技術(shù)內(nèi)容包括1.染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗；2.通過(guò)微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗；3.通過(guò)半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗。1.染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗采用常規(guī)染色體制片方法，對(duì)半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗進(jìn)行染色體分析，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為42條，與半滑舌鰨普通魚苗染色體數(shù)目完全相同；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)有些雌核發(fā)育魚苗含有2條巨型Wff染色體，這些魚苗為雌核發(fā)育的WW型魚苗。由此證明這些魚苗為雌核發(fā)育二倍體個(gè)體，與母本完全相同。2.用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗；采取高鹽法提取雌核發(fā)育魚和正常魚苗基因組DNA，從我們篩選到的半滑舌鰨多態(tài)性微衛(wèi)星引物中，選取微衛(wèi)星引物Cyse31，其引物序列為CySe3miGACGGTCAAAAGTGGTGTGA；Cyse31ClTTTCCACTGTTCACCTGCTG.然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94°C熱變性5min，然后進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，56_62°C退火30s，72°C延伸30s，最后在72°C延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，采用銀染法染色。結(jié)果表明該引物對(duì)在半滑舌鰨普通魚苗中擴(kuò)增出2個(gè)等位基因(即雜合子)的比例為55.6%，而在鱸魚精子誘導(dǎo)的雌核發(fā)育魚苗(25尾)中，有20尾魚苗只擴(kuò)增出1個(gè)等位基因，純合率為80%，而只有5個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出2個(gè)等位基因，雜合率僅為20%，并且在所有檢測(cè)的雌核發(fā)育魚苗中僅出現(xiàn)2個(gè)等位基因。由以上結(jié)果可以證明雌核發(fā)育魚苗確實(shí)是由雌核發(fā)育而來(lái)。3.用半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗采用我們以前建立的半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記和遺傳性別鑒定的PCR技術(shù)進(jìn)行半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗遺傳性別的鑒定。其技術(shù)原理為含有W染色體的雌性個(gè)體中可以擴(kuò)增出雌性特異DNA片段，不含W染色體的ZZ雄性個(gè)體則沒有這種特異DNA片段。采用雌性特異PCR引物Cse382m(序列為ATTCACTGACCCCTGAGAGC)和Cse382Cl(序列為GTAAACAGCACACACTCAACAA)，利用高鹽法提取半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗個(gè)體DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為95°C預(yù)變性5分鐘，然后95°C30秒、66°C30秒、72°C1分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，采用瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物。從10尾異精雌核發(fā)育半滑舌鰨魚苗中檢測(cè)到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段，表明我們獲得的半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗中含有40%左右的超雌魚苗。本發(fā)明與已有技術(shù)對(duì)比其特點(diǎn)是本發(fā)明建立了半滑舌鰨人工雌核發(fā)育技術(shù)，獲得了異源精子和同源精子誘導(dǎo)的雌核發(fā)育二倍體魚苗，采用AFLP標(biāo)記證明雌核發(fā)育魚苗中含有Wff超雌個(gè)體，這些個(gè)體可以用來(lái)生產(chǎn)半滑舌鰨全雌苗種；本發(fā)明建立的半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)技術(shù)，技術(shù)先進(jìn)，操作方便，方法高效、實(shí)用、可靠，其誘導(dǎo)半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體的百分率為0.4-6.3%；為半滑舌鰨苗種生產(chǎn)和全雌苗種研制提供了技術(shù)手段，在半滑舌鰨規(guī)?；纭⑿詣e控制和全雌魚苗培育上具有重大應(yīng)用價(jià)值和廣闊的推廣應(yīng)用前景。圖1染色體加倍適宜起始時(shí)間的確定；圖2適宜冷休克溫度的確定；圖3:適宜冷休克處理時(shí)間的確定；圖4雌核發(fā)育半滑舌鰨的染色體分析；A雌核發(fā)育產(chǎn)生的ZZ型個(gè)體；B雌核發(fā)育產(chǎn)生的Wff型個(gè)體，圖中可見2個(gè)巨大的染色體，即Wff染色體。圖5半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗的微衛(wèi)星鑒定；1-18為半滑舌鰨普通二倍體魚苗個(gè)體，M為pBR322DNA/MspI分子量標(biāo)準(zhǔn)，19-43為半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗個(gè)體。圖6半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗的遺傳性別鑒定上部為雌性特異DNA標(biāo)記的檢測(cè)，下部為Actin基因作為對(duì)照。具體實(shí)施例方式下面以半滑舌鰨為例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容包括一、半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)；二、半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的鑒定方法。一、半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)它的技術(shù)內(nèi)容包括1、精子的遺傳滅活；2、未受精卵與滅活精子的“授精”;3、雌核發(fā)育魚卵染色體加倍起始時(shí)間的確定；4、雌核發(fā)育魚卵染色體加倍冷休克溫度及處理時(shí)間的確定。1.精子的遺傳滅活經(jīng)過(guò)篩選比較，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，同源的半滑舌鰨精子和異源的花鱸精子都可以用來(lái)刺激半滑舌鰨卵子進(jìn)行雌核發(fā)育。半滑舌鰨精液先用顯微鏡檢查精子活力(運(yùn)動(dòng)精子的百分率)，當(dāng)運(yùn)動(dòng)精子的百分率達(dá)到60%以上者可用于紫外線滅活處理。精子的遺傳滅活條件為將IOOyL半滑舌鰨精液用精子冷凍稀釋液MPRS(配方為KCl0.39g/L,CaCl2·2Η200·17g/L,NaHCO30.25g/L,NaCl3.59g/L,NaH2PO40.22g/L,MgCl2O.23g/L,Glucose1.Og/L)稀釋10倍，平鋪于培養(yǎng)皿中，用90-110mJ/cm2紫外線照射，然后與5_10mL半滑舌鰨卵“授精”。異源精子為我們冷凍保存的花鱸精子。從液氮中取出花鱸冷凍精子，在37°C水浴復(fù)溫解凍后鏡檢精子活力，活力達(dá)到70%以上者用于紫外線失活處理。將100μL解凍的花鱸精液用ImLMPRS溶液稀釋后，平鋪于培養(yǎng)皿中，分別用紫外線照射，劑量范圍為20，40，60，80，100，120，140，160mJ/cm2。照射后的精液分別和5-IOmL半滑舌鰨卵受精，在22-23°C恒溫培育，在細(xì)胞分裂后，統(tǒng)計(jì)受精率。待發(fā)育至囊胚期，原腸期，肌節(jié)期，尾芽期時(shí)分別統(tǒng)計(jì)所剩數(shù)量，單倍體率及其發(fā)育情況。綜合考慮受精率，單倍體率及發(fā)育情況，表明用90-110mJ/cm2的紫外線照射后的精子刺激卵雌核發(fā)育的效果較好，胚胎發(fā)育率高。2.未受精卵與失活精子的“授精”將以上經(jīng)紫外線照射后的精液加到半滑舌鰨未受精卵(10-100毫升)中，將精卵輕輕搖動(dòng)混勻，隨后加入2-10毫升海水，繼續(xù)混允后再加入20-200毫升海水完成“授精”過(guò)程，在23°C下培育2-10分鐘，準(zhǔn)備用于染色體加倍處理。3、雌核發(fā)育魚卵染色體加倍起始時(shí)間的確定染色體加倍采用冷休克處理方法。在“授精”后不同時(shí)間(2，3，4，5，6，7，8min)，將卵倒入小抄網(wǎng)(直徑10-15厘米)，然后將盛有雌核發(fā)育卵的小抄網(wǎng)浸入3-6°C的海水浴中進(jìn)行冷休克處理，冷休克處理時(shí)間為20-30min，冷休克處理完畢后將小抄網(wǎng)中的卵轉(zhuǎn)入23°C海水中培養(yǎng)。同時(shí)用同批精子進(jìn)行單倍體對(duì)照。統(tǒng)計(jì)受精率，單倍體率，雌核發(fā)育二倍體率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌核發(fā)育卵在“授精”后4-6min進(jìn)行冷休克處理都能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體，且以“授精”后5min的誘導(dǎo)率最高。其雌核發(fā)育二倍體相對(duì)誘導(dǎo)率達(dá)2.4士0.7%(圖1)。4.染色體加倍冷休克溫度和持續(xù)時(shí)間的篩選用90-110mJ/cm2劑量的紫外線(UV)處理花鱸精子，并與半滑舌鰨卵在23°C下授精，受精后5min按照如下條件進(jìn)行篩選。冷休克溫度設(shè)置為2°C，4°C，5°C，6°C，8°C和10°C6個(gè)梯度，冷休克處理時(shí)間設(shè)置為15min，20min,25min,30min,35min和40min。共計(jì)36組試驗(yàn)。最后統(tǒng)計(jì)受精率，單倍體率，雌核發(fā)育二倍體率。結(jié)果表明在休克溫度3°C-6°C，休克時(shí)間15-30min條件下都可以誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體，其中以4.5-5.5°C,20-25min條件下二倍體誘導(dǎo)率最高(圖2和圖3)。二、半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的鑒定方法它的技術(shù)內(nèi)容包括1.通過(guò)染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗；2.通過(guò)微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗；3.通過(guò)半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗。1.染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗(1)半滑舌鰨胚胎和魚苗染色體制備根據(jù)染色體制備的常規(guī)方法進(jìn)行改進(jìn)后進(jìn)行半滑舌鰨雌核發(fā)育胚胎和魚苗染色體的制備。主要步驟包括將胚胎或魚苗置于0.02%的秋水仙素中，在室溫下處理2個(gè)小時(shí)。然后把胚胎或魚苗放入0.075mol/L的KCL中低滲30分鐘。用新配制的卡諾氏液(甲醇冰醋酸=31)連續(xù)固定3次，每次20分鐘。再取單個(gè)胚胎或魚苗放入50%的冰醋酸中，用尖鑷子撕碎胚胎，使細(xì)胞游離；采用熱滴片法滴片，10%吉姆薩染液染色20分鐘，然后在1000倍顯微鏡下鏡檢。(2)染色體鑒定結(jié)果由于花鱸染色體數(shù)目為2η=48條，其核型為48t；而半滑舌鰨染色體數(shù)目為2η=42，其核型為42t。因此花鱸的染色體數(shù)目與半滑舌鰨相差很大，通過(guò)染色體分析即可證明雌核發(fā)育魚苗是否為雌核發(fā)育而來(lái)。如果雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)目及核型與母本(半滑舌鰨)相同，則證明這些魚苗是雌核發(fā)育而來(lái)。本發(fā)明采用常規(guī)方法對(duì)半滑舌鰨雌核發(fā)育胚胎和魚苗進(jìn)行了染色體分析，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為42條，與半滑舌鰨染色體數(shù)目完全相同；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)有些雌核發(fā)育個(gè)體含有2條巨型Wff染色體，這些個(gè)體為雌核發(fā)育的WW類型(圖4)。由此證明這些魚苗為雌核發(fā)育二倍體個(gè)體。2.用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的多態(tài)性以及共顯性遺傳的特性，能夠檢測(cè)出種群及個(gè)體間的異質(zhì)性，可以用于檢測(cè)雌核發(fā)育二倍體的遺傳結(jié)構(gòu)及其與雌性親本的遺傳同質(zhì)性。因此，我們利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗。(1)基因組DNA的提取采取高鹽法提取半滑舌鰨雌核發(fā)育個(gè)體和正常二倍體個(gè)體基因組DNA首先將固定于無(wú)水乙醇中的魚苗或鰭條置于1.5ml離心管中，剪碎后加入400μ1TNES裂解液(IOmMTris-HCl，ρΗ7.5,400μMNaCl,IOOmMEDTA,0.6%SDS)禾口10μ1蛋白酶K(10mg/ml)，然后于55°C消化。消化完全后，加入140μ1飽和氯化鈉溶液，混勻，12000rpm/min4°C離心30min。取上清液，加入兩倍體積_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀，然后將絮狀沉淀用無(wú)菌的吸頭挑出后用70%乙醇洗滌兩次，待乙醇完全揮發(fā)后，用50μ1TEdOmMTris-HCl,ρΗ8.0，IOmMEDTA)溶解DNA。(2)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為10μ1，包括IXPCRbuffer[20mMTris-HCl,ΡΗ8.4,20mMKCl,10福(朋4)2504]，10-50叫基因組0嫩，0.2口]引物，12(^]\1dNTPs,1.5mMMgCl2和0.5UTaq酶(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增條件為94°C熱變性5min，然后進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s，56-62°C退火30s，72°C延伸30s，最后在72°C延伸7min。用于檢測(cè)雌核發(fā)育半滑舌鰨的微衛(wèi)星標(biāo)記為Cyse31，其引物序列為正向引物序列GACGGTCAAAAGTGGTGTGA；反向引物序列TTTCCACTGTTCACCTGCTG(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳在PCR產(chǎn)物中加入5μ1的甲酰胺上樣液(其中包含0.OlMEDTA，lmg/ml溴芬藍(lán)，lmg/ml二甲苯青)于95°C變性5分鐘，然后立刻放在冰水中。變性后的PCR產(chǎn)物于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，以pBR322DNA/MspI(TIANGEN)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，銀染法染色。(4)結(jié)果分析首先通過(guò)微衛(wèi)星富集文庫(kù)法構(gòu)建了半滑舌鰨微衛(wèi)星富集文庫(kù)，從中篩選出多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。然后用這些多態(tài)引物在正常魚苗和雌核發(fā)育魚苗中進(jìn)行擴(kuò)增，從中進(jìn)一步篩選出在正常群體里雜合率較高、在雌核發(fā)育群體里純合率較高的標(biāo)記。經(jīng)過(guò)篩選，從半滑舌鰨微衛(wèi)星富集文庫(kù)中篩選到的微衛(wèi)星標(biāo)記Cyse31可以用來(lái)鑒定半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體，該標(biāo)記在18尾半滑舌鰨普通魚苗中擴(kuò)增出2個(gè)等位基因(即雜合子)的比例為55.6%;而在25尾雌核發(fā)育魚苗中，有20尾個(gè)體只擴(kuò)增出1個(gè)等位基因(純合子比例為80%)，僅有5尾個(gè)體擴(kuò)增出2個(gè)等位基因，雜合子比例僅為20%(見圖5)，并且在所有檢測(cè)的雌核發(fā)育個(gè)體中僅出現(xiàn)2個(gè)等位基因(圖5)。由以上結(jié)果可以證明雌核發(fā)育魚苗確實(shí)是由雌核發(fā)育而來(lái)。3.用半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗采用我們以前建立的半滑舌鰨雌性特異標(biāo)記和遺傳性別鑒定技術(shù)，可以鑒定出半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗的遺傳性別。根據(jù)半滑舌鰨雌性異配的特點(diǎn)，即半滑舌鰨雌性親魚產(chǎn)生2種卵子，Z型卵和W型卵，因此在雌核發(fā)育魚苗中就產(chǎn)生2種類型，一種是ZZ型雄魚，另一種則是Wff型超雌魚。我們以前建立的半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR技術(shù)可以從具有W染色體的個(gè)體中擴(kuò)增出特異DNA片段，而ZZ雄性個(gè)體則沒有這種特異DNA片段。采用雌性特異PCR引物Cse382Nl(序列為ATTCACTGACCCCTGAGAGC)和Cse382Cl(序列為GTAAACAGCACACACTCAACAA)，利用高鹽法提取半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗個(gè)體DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25.0μ1，包括2.5μ110XPCR緩沖液，1.0μ12.5mMdNTP，2.ΟμIOpM引物混合液，基因組DNA0.8-1.5μ1，雙蒸水16.3-17μ1，Taq酶(5Us/μ1)0.2μL·PCR條件為95°C預(yù)變性5分鐘，然后95°C30秒、66°C30秒、72°C1分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，我們從10尾異精雌核發(fā)育半滑舌鰨魚苗中成功地檢測(cè)到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段，而在用半滑舌鰨精子授精的10尾普通魚苗中，也檢測(cè)到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段(圖6)，表明我們獲得的半滑舌鰨魚苗中含有40%左右的Wff超雌魚苗。雌核發(fā)育二倍體魚苗誘導(dǎo)實(shí)施結(jié)果采用上述建立的半滑舌鰨雌核發(fā)育方法，我們10多次成功地獲得了半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗。現(xiàn)將半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗研制的代表性結(jié)果列于表1。表1、半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗誘導(dǎo)的主要結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求一種半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)和鑒定方法，其特征在于他的方法包括(1)半滑舌鰨卵子人工雌核發(fā)育方法；(2)雌核發(fā)育魚苗的鑒定方法；(1)、半滑舌鰨卵子人工雌核發(fā)育方法它的技術(shù)內(nèi)容包括A、精子的遺傳滅活；B、未受精卵與失活精子的“授精”；C、雌核發(fā)育魚卵染色體加倍起始時(shí)間的確定；D、雌核發(fā)育魚卵染色體加倍冷休克溫度及處理時(shí)間的確定；A.精子的遺傳滅活采用異源的花鱸精子和同源的半滑舌鰨精子刺激半滑舌鰨卵子進(jìn)行雌核發(fā)育；半滑舌鰨精液先用顯微鏡檢查精子活力，當(dāng)活力達(dá)到60％以上者可用于紫外線滅活處理；精子的遺傳滅活條件為將100μL半滑舌鰨精液用精子稀釋液MPRS稀釋10倍，平鋪于培養(yǎng)皿中，用90-110mJ/cm2紫外線照射，然后與5-10mL半滑舌鰨卵“授精”；異源精子為冷凍保存的花鱸精子，從液氮中取出花鱸冷凍精子，在37℃水浴復(fù)溫解凍后鏡檢精子活力，活力達(dá)到60％以上者用于紫外線滅活處理；將100μL解凍的花鱸精液用1mLMPRS溶液稀釋后，平鋪于培養(yǎng)皿中，用90-110mJ/cm2紫外線照射，然后與5-10mL半滑舌鰨卵受精，在22-23℃恒溫培育；B.未受精卵與失活精子的“授精”經(jīng)紫外線照射后的精液200-1000μL加到10-100毫升半滑舌鰨未受精卵中，將精卵輕輕搖動(dòng)混勻，隨后加入2-10毫升海水，繼續(xù)混勻后，再加入20-200毫升海水完成“授精”過(guò)程，在22-23℃下培育2-6分鐘，準(zhǔn)備用于染色體加倍處理；C.雌核發(fā)育魚卵染色體加倍起始時(shí)間的確定染色體加倍采用冷休克處理方法，在“授精”后2，3，4，5，6，7，8min，將卵倒入直徑為10-15厘米的小抄網(wǎng)，將盛有雌核發(fā)育卵的小抄網(wǎng)浸入3-6℃的海水浴中進(jìn)行冷休克處理，冷休克處理時(shí)間為20-30min，冷休克處理完畢后將卵移入23℃海水中培養(yǎng)；統(tǒng)計(jì)受精率，單倍體率，雌核發(fā)育二倍體率；結(jié)果表明在授精后4-6min中都能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體，且以授精后5min的誘導(dǎo)率最高；D.染色體加倍冷休克溫度和持續(xù)時(shí)間的篩選在確定了冷休克起始時(shí)間后，需要確定冷休克溫度和休克持續(xù)時(shí)間；將與紫外失活精子“授精”的卵，分成6個(gè)溫度梯度2℃，4℃，5℃，6℃，8℃和10℃，在每個(gè)溫度梯度分別處理15min，20min，25min，30min，35min，40min；最后統(tǒng)計(jì)受精率，單倍體率，雌核發(fā)育二倍體率；結(jié)果表明在休克溫度3℃-6℃，休克時(shí)間15min-30min條件下都可以誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體，其中在4.5-5.5℃處理20-25min的雌核發(fā)育誘導(dǎo)率最高；(2)、雌核發(fā)育魚苗的鑒定方法它的技術(shù)內(nèi)容包括A.染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗；B.通過(guò)微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗；C.通過(guò)半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗；A.染色體分析鑒定雌核發(fā)育魚苗采用常規(guī)染色體制片方法，對(duì)半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗進(jìn)行染色體分析，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗的染色體數(shù)為42條，與普通半滑舌鰨魚染色體數(shù)目完全相同；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)有些雌核發(fā)育魚苗含有2條巨型WW染色體，這些魚苗是雌核發(fā)育的WW型魚苗；由此充分證明這些魚苗為雌核發(fā)育二倍體個(gè)體；B.用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗采取高鹽法提取雌核發(fā)育魚和正常魚苗基因組DNA，從我們篩選到的半滑舌鰨多態(tài)性微衛(wèi)星引物中，選取微衛(wèi)星引物Cyse31，其引物序列為Cyse31N1GACGGTCAAAAGTGGTGTGA；Cyse31C1TTTCCACTGTTCACCTGCTG.然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94℃熱變性5min，然后進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，采用銀染法染色；結(jié)果表明該引物對(duì)在半滑舌鰨普通魚苗中擴(kuò)增出具有2個(gè)等位基因的雜合子的比例為55.6％，而在25尾雌核發(fā)育魚苗中，有20尾只擴(kuò)增出1個(gè)等位基因，僅有5個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出2個(gè)等位基因，雜合率僅為20％，并且在所有檢測(cè)的雌核發(fā)育魚苗中僅出現(xiàn)2個(gè)等位基因，由此證明這些魚苗是雌核發(fā)育而來(lái)；C.用半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記鑒定雌核發(fā)育魚苗采用半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記和遺傳性別鑒定的PCR技術(shù)進(jìn)行半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗遺傳性別的鑒定；其技術(shù)原理為含有W染色體的雌性個(gè)體中可以擴(kuò)增出雌性特異DNA片段，不含W染色體的ZZ雄性個(gè)體則沒有這種特異DNA片段；采用序列為ATTCACTGACCCCTGAGAGC的特異引物Cse382N1和序列為GTAAACAGCACACACTCAACAA的特異引物Cse382C1，利用高鹽法提取半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗個(gè)體DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為25.0μl，包括2.5μl10×PCR緩沖液，1.0μl2.5mMdNTP，2.0μl10pM引物混合液，基因組DNA0.8-1.5μl，雙蒸水16.3-17μl，5U/μl的Taq酶0.2μl；PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5分鐘，然后95℃30秒、66℃30秒、72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘，采用1％瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物；從10尾異精雌核發(fā)育半滑舌鰨魚苗中檢測(cè)到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段，表明我們獲得的半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗中含有40％左右的超雌魚苗。全文摘要一種半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)方法，包括半滑舌鰨卵子人工雌核發(fā)育方法，雌核發(fā)育魚苗的鑒定方法。本發(fā)明首次建立了采用半滑舌鰨精子和花鱸精子誘導(dǎo)半滑舌鰨卵子雌核發(fā)育獲得雌核發(fā)育二倍體魚苗的方法，篩選到適合半滑舌鰨卵雌核發(fā)育的冷休克起始時(shí)間、冷休克溫度和時(shí)間，建立了半滑舌鰨雌核發(fā)育魚苗的鑒定方法。本方法獲得雌核發(fā)育魚苗誘導(dǎo)率為0.4-6.3％；本發(fā)明具有先進(jìn)、高效、實(shí)用、可靠的特點(diǎn)，在半滑舌鰨性別控制和全雌育種上具有重大應(yīng)用價(jià)值和廣闊的推廣應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A01K61/00GK101796929SQ20091026268公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2007年11月1日優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日發(fā)明者季相山,廖小林,徐建勇,楊景峰,武鵬飛,田永勝,翟介明,蘇鵬志,邵長(zhǎng)偉,陳松林申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所