專利名稱：雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，特別是涉及一種用異種精子激活卵子誘導(dǎo)雜色鮑雌核發(fā)育的方法。該技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生后代遺傳物質(zhì)以母本的基因為主，并參入少量父本基因，因此本發(fā)明可應(yīng)用于鮑遺傳育種，可以快速純化種質(zhì)，加快育種速度。
背景技術(shù)：
利用遺傳生物技術(shù)，為貝類養(yǎng)殖業(yè)培育優(yōu)良品種，具有深遠的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。雌核發(fā)育是一種遺傳生物技術(shù)，指卵子依靠自己的細胞核發(fā)育成個體的生殖行為，它需要同種或異種精子進入卵內(nèi)，但這些精子只起激動作用并不參與發(fā)育，胚胎發(fā)育完全是在雌核的控制之下進行的，因此得到的后裔全部是母性性狀，基因型與母本相同或略有差異。人工雌核發(fā)育的應(yīng)用包括快速建立純系、實現(xiàn)全雌養(yǎng)殖、遺傳分析(確定性別控制機制、確定外界因素對遺傳性或表型的影響、檢測基因圖距或隱性基因)、提高產(chǎn)量；綜合育種、加快育種速度等。
以雜色鮑(Haliotis diversicolor)為母本、盤鮑(H.discus discus)為父本雜交，受精率可以達到50％以上，核型分析結(jié)果雜交幼體中包含異源二倍體、異源三倍體和非整倍體，擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析結(jié)果表明，成體為含有極少量父本基因的異精雌核發(fā)育體。鮑的雌核發(fā)育通常采用理化方法進行誘導(dǎo)。Fujino等(Fujino，et al，Inductionof gynogenetic diploid by inhibiting second meiosis in the pacific abalone，日本水產(chǎn)年會志，1990，561755-1763)報道了皺紋盤鮑雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法先用紫外線失活皺紋盤鮑精子染色體，再用冷休克的方法誘導(dǎo)雌核發(fā)育卵染色體組加倍。本申請的發(fā)明人柯才煥在專利號為CN 03132936.5的發(fā)明專利“雜色鮑雌核發(fā)育的誘導(dǎo)方法”中應(yīng)用紫外線照射失活皺紋盤鮑精子遺傳物質(zhì)，并用遺傳失活精子激活皺紋盤鮑卵子的雌核發(fā)育，同時應(yīng)用細胞松弛素B或6-二甲基氨基嘌呤誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體。該類方法的不足之處在于1)精子需要失活處理，不便于現(xiàn)場操作；2)精子失活操作要接觸紫外線或X射線或γ射線下照射，具有一定的危險性；3)精子失活操作的條件需要長期的試驗摸索，不便于掌握；4)應(yīng)用輻射的方法失活精子，不可能十分徹底清除父本遺傳物質(zhì)，因此雌核發(fā)育子代中必然混有正常二倍體或三倍體，給實驗結(jié)果的分析帶來困難，同時影響種質(zhì)純化的進程；5)紫外線、細胞松弛素B及6-二甲基氨基嘌呤等均具有潛在的致癌作用，可能影響操作者的健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對已有的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法中存在的不足，提供一種用異源精子誘導(dǎo)雜色鮑雌核發(fā)育的方法。
本發(fā)明所說的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法其步驟為1)、取排放40min內(nèi)，最好為30min內(nèi)的雜色鮑卵子，用排放3h內(nèi)，最好為2h內(nèi)的新鮮盤鮑精子授精，得到異源多倍體胚胎，授精精子濃度為6.0×106～2.4×107個·ml-1；2)、將發(fā)育胚胎在海水中孵化為幼體，海水的溫度為16～32℃，用篩網(wǎng)富集上層幼體，轉(zhuǎn)移至預(yù)投入青霉素-鏈霉素的培育池內(nèi)，培育池內(nèi)海水溫度為16～32℃，青霉素-鏈霉素的含量為5～50mg/L。
檢測時，可取2月齡的稚貝進行倍性檢測，并用擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)確定后代至少含有96.27％的雜色鮑基因。
與已有的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法相比，本發(fā)明具有以下突出效果1)、本發(fā)明誘導(dǎo)產(chǎn)生的后代主要含有母性親本的基因，僅含有極少量父本基因，因此本發(fā)明可應(yīng)用于雜色鮑遺傳育種，特別是快速純化種質(zhì)，加快育種速度；2)、無須對異源精子進行射線失活處理，簡單可行，便于現(xiàn)場操作，安全可靠；3)、對操作者的經(jīng)驗要求不高，便于掌握；4)、異源精子的遺傳物質(zhì)可以通過在發(fā)育過程中自發(fā)丟失，極少量父本基因的殘余與母本基因有較大差異，易被檢出。
5)、無需使用紫外線及細胞松弛素或6-二甲基氨基嘌呤等有害的輻射及化學(xué)藥品，避免對操作者的身體傷害。
具體實施例方式
實施例1取排放30min內(nèi)的雜色鮑卵子，用排放2h內(nèi)的新鮮盤鮑精子授精，授精精子濃度為1.0×107個·ml-1。將發(fā)育胚胎在海水中孵化為幼體，海水的溫度為25℃，用篩網(wǎng)富集上層幼體，轉(zhuǎn)移至預(yù)投入青霉素-鏈霉素的培育池內(nèi)，培育池內(nèi)海水溫度為25℃，青霉素-鏈霉素的含量為5mg/L。
被異種精子激活的發(fā)育卵，按普通雜色鮑種苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出雜色鮑雌核發(fā)育二倍體種苗。取2月齡的稚貝進行倍性檢測，證明為二倍體，并用擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)確定后代至少含有96.27％的雜色鮑基因，平均每個個體約含0.79±0.87％的父本基因。
實施例2與實施例1類似，其區(qū)別在于取排放40min內(nèi)的雜色鮑卵子，用排放1.5h內(nèi)的新鮮盤鮑精子授精，授精精子濃度為6.0×106個·ml-1。將發(fā)育胚胎在海水中孵化為幼體，海水的溫度為32℃，用篩網(wǎng)富集上層幼體，轉(zhuǎn)移至預(yù)投入青霉素-鏈霉素的培育池內(nèi)，培育池內(nèi)海水溫度為32℃，青霉素-鏈霉素的含量為25mg/L。
實施例3與實施例1類似，其區(qū)別在于取排放15min內(nèi)的雜色鮑卵子，用排放3h內(nèi)的新鮮盤鮑精子授精，授精精子濃度為2.4×107個·ml-1。將發(fā)育胚胎在海水中孵化為幼體，海水的溫度為16℃，用篩網(wǎng)富集上層幼體，轉(zhuǎn)移至預(yù)投入青霉素-鏈霉素的培育池內(nèi)，培育池內(nèi)海水溫度為16℃，青霉素-鏈霉素的含量為50mg/L。
權(quán)利要求
1.雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于其步驟為1)、取排放40min內(nèi)的雜色鮑卵子，用排放3h內(nèi)的新鮮盤鮑精子授精，得到異源多倍體胚胎；2)、將發(fā)育胚胎在海水中孵化為幼體，用篩網(wǎng)富集上層幼體，轉(zhuǎn)移至預(yù)投入青霉素-鏈霉素的培育池內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于在步驟1)中，取排放30min內(nèi)的雜色鮑卵子。
3.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于在步驟1)中，用排放2h內(nèi)的新鮮盤鮑精子授精。
4.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于在步驟1)中，授精精子濃度為6.0×106～2.4×107個·ml-1。
5.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于在步驟2)中、將發(fā)育胚胎在海水中孵化為幼體，海水的溫度為16～32℃。
6.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于在步驟2)中，用篩網(wǎng)培育池內(nèi)海水溫度為16～32℃。
7.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于在步驟2)中，青霉素-鏈霉素的含量為5～50mg/L。
全文摘要
雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，涉及一種雜色鮑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，特別是涉及一種用異種精子激活卵子誘導(dǎo)雜色鮑雌核發(fā)育的方法。提供一種用異源精子誘導(dǎo)雜色鮑雌核發(fā)育的方法。其步驟為取雜色鮑卵子，用新鮮盤鮑精子授精，得異源多倍體胚胎，將發(fā)育胚胎在海水中孵化為幼體，用篩網(wǎng)富集上層幼體，轉(zhuǎn)移至預(yù)投入青霉素—鏈霉素的培育池內(nèi)。其后代主要含有母性親本的基因，僅含有極少量父本基因，可應(yīng)用于雜色鮑遺傳育種，特別是快速純化種質(zhì)，加快育種速度；無須對異源精子進行射線失活處理，便于現(xiàn)場操作，異源精子的遺傳物質(zhì)可通過在發(fā)育過程中自發(fā)丟失，極少量父本基因的殘余與母本基因有較大差異，易被檢出。無需使用輻射及化學(xué)藥品，避免對身體傷害。
文檔編號A01K61/00GK1739465SQ20051009677
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者柯才煥, 蔡明夷 申請人:廈門大學(xué)