昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種無血清培養(yǎng)基，特別是一種適于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)制備重組 蛋白的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 為滿足基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)日 益廣泛的應(yīng)用需求，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運而生。概括的講，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)系模擬細(xì)胞生長的體 內(nèi)環(huán)境，包括溫度、pH值、滲透壓和氧氣供應(yīng)，以使細(xì)胞能很好地生長和繁殖。其中最關(guān)鍵 的因素是培養(yǎng)基。
[0003] 傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)基主要是通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的血清或組織提取物而 形成，其中因動物血清提取的局限，使其應(yīng)用于培養(yǎng)基的價格格外昂貴，而且也給細(xì)胞培養(yǎng) 的標(biāo)準(zhǔn)化帶來困難，同時也存在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純化難的問題，具有潛在的細(xì)胞毒 性作用，給規(guī)模化培養(yǎng)細(xì)胞增加了難度。
[0004] 由于傳統(tǒng)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在的諸多問題，促使研究人員又發(fā)展出了無血清培養(yǎng) 基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基不含動物血清或其他生物提取液，具有組成成分相 對清楚，制備過程簡單等優(yōu)點，但仍可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長、繁殖，并可避免血 清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染等不利影響，有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化，可提高產(chǎn) 品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。當(dāng)然，現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)基也還存在一些缺陷，例如 保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便，成本較高，針對性很強，一種無血清培養(yǎng)基僅適合 某一類細(xì)胞的培養(yǎng)等。
[0005] 另一方面，在基因工程領(lǐng)域，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視， 常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。其中 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其操作安全，表達(dá)量高，目前倍受青睞， 并已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。
[0006]迄今為止，如L.Ikonomou.，etal(ApplMicrobiolBiotechnol, 2003, 62:1-20)，M ichaelS.，etal(Biotechnol.Prog.，1988, 14, 573-579)、R?H?齊爾瑞洛（CN1498267A)等 已經(jīng)開發(fā)出多種用于培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，但這些培養(yǎng)基普遍存在成本過高，昆 蟲細(xì)胞培養(yǎng)效率低，蛋白表達(dá)效率有待提升等問題，不利于大規(guī)模的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和重組 蛋白的制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種適于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)制備重組蛋白的昆 蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。
[0008] 為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：
[0009] -種昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，包含氨基酸、無機鹽、維生素和碳水化合物，其特征 在于它還包含0. 6?25mg/L磷脂酰膽堿，所述磷脂酰膽堿包括二亞油酰磷脂酰膽堿、二硬 脂酰磷脂酰膽堿。
[0010] 作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基包含11200?29170mg/L氨 基酸、5500. 71 ?9510. 33mg/L無機鹽、11. 354 ?820. 4mg/L維生素、3000 ?11000mg/L蛋 白水解物和6042?14222mg/L碳水化合物。
[0011] 作為尤為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基包含〇. 5?15mg/L二亞油酰 磷脂酰膽堿Oilineoyl-phosphatidylcholin)以及0? 1?10mg/L二硬脂酰磷脂酰膽堿 (Distearoyl-phosphatidylcholin)中的至少一者，優(yōu)選同時采用該兩者。
[0012] 作為更為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基還包含0. 001?0.lmg/L二 水氯化鋇、0. 005?0. 02mg/L氯化鋰、0. 05?7mg/L氯化鎳。
[0013] 作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基包含丙氨酸300? 800mg/L、L-鹽酸精氨酸800?2400mg/L、L-天冬酰胺900?1700mg/L、L-天冬氨酸鈉鹽 1000?1600mg/L、L-胱氨酸鹽酸鹽150?300mg/L、L-谷氨酸鹽酸鹽1400?2700mg/L、 L_谷氨酰胺1000?5000mg/L、甘氨酸300?800mg/L、L-組氨酸400?900mg/L、L-羥脯 氨酸500?1500mg/L、L-異亮氨酸500?1200mg/L、L-亮氨酸200?600mg/L、L-鹽酸賴 氨酸500?1500mg/L、L-蛋氨酸700?1600mg/L、L-苯丙氨酸800?1700mg/L、L-脯氨 酸 400 ?950mg/L、L_ 絲氛酸 300 ?1000mg/L、L-蘇氛酸 300 ?820mg/L、L_ 色氛酸 100 ? 300mg/L、L-酪氨酸二鈉鹽 300 ?850mg/L、L-纈氨酸 350 ?950mg/L。
[0014] 作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基包含四水鑰酸銨0.03? 0? 2mg/L、六水氯化鈷0? 03?0? 35mg/L、二水氯化銅0? 1?1. 5mg/L、七水硫酸亞鐵0? 5? 4. 6mg/L、無水硫酸鎂500?1500mg/L、四水氯化錳0? 01?0? 18mg/L、氯化鉀1000? 1500mg/L、氯化鈉3000?5000mg/L、一水磷酸二氫鈉1000?1500mg/L、氯化鋅0? 04? 3. 5mg/L〇
[0015] 作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基包含生物素0. 1?0. 5mg/L、 D-泛酸鈣 0? 004 ?0? 2mg/L、氯化膽堿 10 ?400mg/L、VB12 氰鈷胺 0? 2 ?1. 6mg/L、VB9 葉 酸0? 05?0? 5mg/L、i-肌醇0? 2?400mg/L、VB3煙酸0? 1?1. 9mg/L、對氨基苯甲酸0? 3? 2. 7mg/L、VB6鹽酸吡哆醇0? 3?4mg/L、VB2核黃素0? 05?5mg/L、VB1鹽酸硫胺0? 05? 4mg/L〇
[0016] 作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基包含無水葡萄糖2500? 5000mg/L、反丁烯二酸 2 ?8mg/L、2_ 酮戊二酸 10 ?40mg/L、L-蘋果酸 10 ?100mg/L、一 水麥芽糖（超純）500?3000mg/L、丁二酸4?14mg/L、Twen8010?1000mg/L、膽固醇硫酸 酯鈉鹽 5 ?50mg/L、VE鈉 1 ?10mg/L、D-鹿糖 3000 ?5000mg/L。
[0017] 作為較為優(yōu)選的實施方案之一，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基還包含蛋白水解物，例如可 優(yōu)選包含大麥水解物1000?5000mg/L、大米水解物2000?6000mg/L。
[0018] 在本發(fā)明的一更為具體的實施方案之中，所述昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基可包含如下表1所 示組分。
[0019] 表1本發(fā)明中一典型昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的配方
[0020]
【主權(quán)項】
1. 一種昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，包含氨基酸、無機鹽、維生素和碳水化合物，其特征在 于它還包含0. 6?25mg/L磷脂酰膽堿，所述磷脂酰膽堿包括二亞油酰磷脂酰膽堿和/或二 硬脂酰磷脂酰膽堿。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它包含11200? 29170mg/L 氨基酸、5500. 71 ?9510. 33mg/L 無機鹽、11. 354 ?820. 4mg/L 維生素、3000 ? 11000mg/L蛋白水解物和6042?14222mg/L碳水化合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它包含0. 5?15mg/L二 亞油酰磷脂酰膽堿和/或〇. 1?l〇mg/L二硬脂酰磷脂酰膽堿。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它還包含0. 001? 0? lmg/L二水氯化鋇、0? 005?0? 02mg/L氯化鋰、0? 05?7mg/L氯化鎳。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它包含 丙氨酸300?800 mg/L、L-鹽酸精氨酸800?2400 mg/L、L-天冬酰胺900?1700 mg/ L、L-天冬氨酸鈉鹽1000?1600 mg/L、L-胱氨酸鹽酸鹽150?300 mg/L、L-谷氨酸鹽酸 鹽 1400 ?2700 mg/L、L-谷氨酰胺 1000 ?5000 mg/L、甘氨酸 300 ?800 mg/L、L_ 組氨 酸400?900 mg/L、L_輕脯氨酸500?1500 mg/L、L_異亮氨酸500?1200 mg/L、L_亮氨 酸200?600 mg/L、L-鹽酸賴氨酸500?1500 mg/L、L-蛋氨酸700?1600 mg/L、L-苯丙 氨酸 800 ?1700 mg/L、L-脯氨酸 400 ?950 mg/L、L-絲氨酸 300 ?1000 mg/L、L-蘇氨 酸 300 ?820 mg/L、L-色氨酸 100 ?300 mg/L、L-酪氨酸二鈉鹽 300 ?850 mg/L、L-纈 氛酸 350 ?950 mg/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它包含四水 鑰酸銨〇? 03?0? 2 mg/L、六水氯化鈷0? 03?0? 35 mg/L、二水氯化銅0? 1?1. 5 mg/L、 七水硫酸亞鐵0. 5?4. 6 mg/L、無水硫酸鎂500?1500 mg/L、四水氯化錳0. 01?0. 18 mg/L、氯化鉀1000?1500 mg/L、氯化鈉3000?5000 mg/L、一水磷酸二氫鈉1000?1500 mg/L、氯化鋒 0? 04 ?3. 5 mg/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它包含生物 素0? 1?0? 5 mg/L、D-泛酸鈣0? 004?0? 2 mg/L、氯化膽堿10?400 mg/L、VB12氰鈷胺 0? 2 ?1. 6 mg/L、VB9 葉酸 0? 05 ?0? 5 mg/L、i-肌醇 0? 2 ?400 mg/L、VB3 煙酸 0? 1 ?1. 9 mg/L、對氨基苯甲酸0.3?2.7 mg/L、VB6鹽酸批P多醇0.3?4 mg/L、VB2核黃素0.05? 5 mg/L、VBl 鹽酸硫胺 0? 05 ?4 mg/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它包含無水 葡萄糖2500?5000mg/L、反丁烯二酸2?8mg/L、2-酮戊二酸10?40mg/L、L-蘋果酸 10 ?100mg/L、一水麥芽糖（超純）500 ?3000mg/L、丁二酸 4 ?14mg/L、Twen80 10 ? 1000mg/L、膽固醇硫酸酯鈉鹽5?50mg/L、VE鈉1?10mg/L、D-鹿糖3000?5000mg/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于它還包含蛋 白水解物，所述蛋白水解物包含大麥水解物1000?5000mg/L、大米水解物2000?6000mg/ L 〇
10. 權(quán)利要求1-9中任一項所述昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基于培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞或制備重組蛋 白中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用。該培養(yǎng)基包含氨基酸、無機鹽、維生素和碳水化合物等；進一步的，還包含0.5～15mg/L二亞油酰磷脂酰膽堿和/或0.1～10mg/L二硬脂酰磷脂酰膽堿；尤其是，還可包含0.001～0.1mg/L二水氯化鋇、0.005～0.02mg/L氯化鋰、0.05～7mg/L氯化鎳。本發(fā)明的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基組分簡單明確，易于制備，成本低廉，且可大幅提升昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)效率和重組蛋白表達(dá)效率，利于實現(xiàn)昆蟲細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)和重組蛋白的大規(guī)模制備。
【IPC分類】C12P21-00, C12N5-07
【公開號】CN104593316
【申請?zhí)枴緾N201510053687
【發(fā)明人】張大鶴
【申請人】蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年2月2日