專利名稱：無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含至少O. 5mg/L的多胺；本發(fā)明還涉及在所述包含至少O. 5mg/L的多胺的無寡肽細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及在包含至少O. 5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中表達(dá)至少一種蛋白質(zhì)的方法，并且涉及在包含至少
O.5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中制造至少一種病毒的方法。
背景技術(shù)：
為了培養(yǎng)細(xì)胞、特別是真核細(xì)胞、更具體地說哺乳動(dòng)物細(xì)胞，存在一種固有觀念，就是必須使用配有所需營養(yǎng)物質(zhì)的專門培養(yǎng)基，這些營養(yǎng)物質(zhì)用于細(xì)胞的有效生長并用于生產(chǎn)生物制品，尤其是生物藥物，例如諸如重組體蛋白、抗體、病毒、病毒抗原以及病毒狀顆粒。為了有效地生產(chǎn)所述生物制品，重要的是達(dá)到最佳細(xì)胞密度以及本身提高的蛋白質(zhì)表達(dá)，以便獲得最大的產(chǎn)率。細(xì)胞培養(yǎng)基配方已經(jīng)補(bǔ)充有許多添加劑，包括不明確的組分，像胎牛血清(FCS)、數(shù)種動(dòng)物衍生蛋白和/或牛源蛋白質(zhì)水解物、以及來源于植物或者酵母的蛋白質(zhì)水解物。通常，血清或者血清衍生物質(zhì)比如諸如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或者胰島素，可能包含不希望有的、可以污染細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑和由此得到的生物制品。另外，需要對人血清衍生添加劑進(jìn)行所有已知病毒的測試，包括可以經(jīng)血清傳播的肝炎病毒和艾滋病病毒HIV。而且，牛血清和其衍生產(chǎn)物承擔(dān)著牛海綿樣腦病BSE污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，所有的血清衍生產(chǎn)物可能會被未知的物質(zhì)污染。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用來源于人或動(dòng)物的血清或者蛋白質(zhì)添加劑時(shí)，特別是如果該細(xì)胞被用于制造給藥于人的藥物或疫苗時(shí)，存在許多的問題(例如，不同批次的組合物品質(zhì)發(fā)生變化，并且存在支原體、病毒或牛海綿樣腦病BSE的污染風(fēng)險(xiǎn))。所以，人們進(jìn)行了許多嘗試，以提供有效的宿主體系和培養(yǎng)條件，其不需要血清或者其他的動(dòng)物性蛋白質(zhì)化合物。基于來源于植物或酵母的蛋白提取物，已開發(fā)了這樣的無血清培養(yǎng)基。例如，人們熟知的用于發(fā)酵工藝并且可以增強(qiáng)許多在合成培養(yǎng)基上不易生長的微生物、酵母和真菌的生長的大豆水解物。專利WO 96/26266描述到，大豆粉的木瓜蛋白酶消化液是碳水化合物的提供源和氮源，并且許多組分可以用于組織培養(yǎng)。Franek等(生物技術(shù)進(jìn)展(2000) 16，688-692)描述了限定的大豆和小麥水解物肽組分的生長和生產(chǎn)率促進(jìn)效果。WO 96/15231公開了一種無血清培養(yǎng)基，由合成的最低必需培養(yǎng)基和酵母提取物組成，用于脊椎動(dòng)物細(xì)胞的增殖和病毒的生產(chǎn)工藝。在WO 98/15614中公開了一種培養(yǎng)基配方，其由包含大米肽和酵母提取物及其酶消化液的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基和/或植物脂類組成，用于動(dòng)物細(xì)胞的生長。WO 01/23527公開了一種培養(yǎng)基，其包含精制的大豆水解物，用于重組細(xì)胞的培養(yǎng)。WO 00/03000公開了一種培養(yǎng)基，其包含大豆水解物和酵母提取物，但還需要重組體形式的動(dòng)物性蛋白質(zhì)比如生長因子的存在。歐洲]專利EP-A-O 481 791描述了一種生物化學(xué)限定的用于培養(yǎng)工程菌CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基，其不含由動(dòng)物源分離的蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物，其還包括重組胰島素或者胰島素類似物、1% O. 025% w/v的木瓜蛋白酶消化的大豆蛋白胨和腐胺。專利公開WO 98/08934描述了一種無血清真核細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含水解大豆肽(I 1000mg/L)，
O.01 lmg/L的腐胺，和多種動(dòng)物衍生組分包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素及其他蛋白質(zhì)。在上下文中，應(yīng)當(dāng)注意，已知標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基像DMEM/Ham' s F12中包含O. 08mg/L濃度的腐胺。 然而，植物和/或酵母水解物是寡肽和其他未知組分及雜質(zhì)的不明確的混合物。另外，市場上可買到的許多水解物的品質(zhì)變化極大。其結(jié)果是，在重組體蛋白或者病毒產(chǎn)品的生產(chǎn)中有很大的變化(高達(dá)3倍的變化)，這與使用的許多水解物(“批間偏差”)有關(guān)。這種不利因素影響到細(xì)胞的增殖以及各細(xì)胞的蛋白表達(dá)。總之，現(xiàn)有技術(shù)中已知的培養(yǎng)基補(bǔ)充了來源于動(dòng)物、植物或酵母的蛋白質(zhì)或多肽提取物；補(bǔ)充了重組形式的蛋白質(zhì)，例如諸如胰島素、類胰島素生長因子或者其他生長因子。所以，為克服上述問題，人們很需要一種不含動(dòng)物、植物和真菌蛋白和/或寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基。另外，目前還有一種需要，是提高表達(dá)的重組體蛋白產(chǎn)量或者任何其他的表達(dá)產(chǎn)品的產(chǎn)量，并且提供一種最佳的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于生產(chǎn)生物制品比如人用藥物或者疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一目在于提供在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法、以及有效表達(dá)重組體蛋白的方法，和/或有效生產(chǎn)病毒的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于除去動(dòng)物、植物和/或酵母衍生水解物，從而提供不包含任何添加的補(bǔ)充蛋白質(zhì)或寡肽的培養(yǎng)基。發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加至少O. 5mg/L的多胺可以帶來有益效果，不僅會促進(jìn)細(xì)胞生長而且會提高單位細(xì)胞的蛋白質(zhì)和/或病毒表達(dá)量。甚至在無寡肽的培養(yǎng)基中也可以取得所述料想不到的有益效果。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的無寡肽培養(yǎng)基使得細(xì)胞生長保持一致，并且可以提高預(yù)期產(chǎn)物特別地是靶蛋白質(zhì)比如重組體蛋白和/或病毒的產(chǎn)量，而與任何蛋白質(zhì)水解物的品質(zhì)或批次變化無關(guān)。細(xì)胞培養(yǎng)基中特定濃度多胺的具體補(bǔ)充具有提高細(xì)胞生長率、細(xì)胞比生產(chǎn)率和細(xì)胞最終密度的作用。因此，與本技術(shù)領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基相比，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基更有利于重組體蛋白表達(dá)、病毒生產(chǎn)和細(xì)胞生長速度。另外，根據(jù)本發(fā)明的無寡肽培養(yǎng)基免除了在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加蛋白質(zhì)水解物。


圖I為一圖，顯示了 GD8/6細(xì)胞在BAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)期間內(nèi)2. Omg/L腐胺二鹽酸鹽的添加對體積FVIII-CoA生產(chǎn)率的影響，其中，體積FVIII-CoA生產(chǎn)率表示為[單位U/升L/天D]，培養(yǎng)時(shí)間表示為[天]。箭頭處為11天，腐胺二鹽酸鹽的添加量為(2. Omg/L)。
圖2為一表，顯示了 GD8/6細(xì)胞在BAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，視需要與鐵(II)和銅(II)的附加補(bǔ)充組合使用的腐胺的添加共同對體積生產(chǎn)率(QP，表示為[單位Π/升L/天2]和細(xì)胞比生產(chǎn)率(qp，表示為[mU/106個(gè)細(xì)胞/天])、以及比生長速率μ (cf1，表示為單位生長率/天)的影響比較。
圖3為一表，其顯示了 GD8/6細(xì)胞在BAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，腐胺和/或鳥氨酸對比生長速率(μ絕對值、μ相對值)和細(xì)胞比生產(chǎn)率(qp絕對值，表示為[mU/ΙΟ6個(gè)細(xì)胞/天；qp相對值，表示為％)的影響的比較。
圖4為一表，顯示了 GD8/6細(xì)胞在BAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，腐胺和精胺對比生長速率(μ絕對值，μ相對值)和細(xì)胞比生產(chǎn)率(qp絕對值，qp相對值)的影響的比較。
圖5是一表，顯示了 GD8/6細(xì)胞在BAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，腐胺和乙醇胺對比生長率(μ絕對值，μ相對值)和細(xì)胞比生產(chǎn)率(qp絕對值，qp相對值)的影響比較。
圖6所示為一圖，描述了 3. 6mg/L腐胺二鹽酸鹽的添加對平均MVA病毒滴度的影響，其中滴度表示為[TCID50/mLxl08]；-:未添加腐胺；Putr :添加了 3. 6mg/L的腐胺二鹽酸鹽。
圖7所示為一圖，描述了各種濃度的腐胺二鹽酸鹽的添加對平均MVA病毒滴度的影響，其中用[mg/L]表示濃度；用[TCID50/mLxl08]表示滴度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種包含至少O. 5mg/L的多胺的無寡肽細(xì)胞培養(yǎng)基。除非另作說明，本申請文件中的濃度值指的是游離堿形式的組分濃度。術(shù)語“多胺”指的是源于生物的多胺的任何基團(tuán)，其是芳香族或者陽離子氨基酸衍生的有機(jī)聚陽離子。多胺由碳、氮和氫組成，并且包含兩個(gè)以上氨基基團(tuán)。多胺具有一個(gè)以上正電荷和疏水性構(gòu)架。該術(shù)語包含，例如，選自尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、鳥氨酸及其組合物的分子。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，無寡肽的培養(yǎng)基包含鳥氨酸、或腐胺、或精胺、或其組合物。在根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一個(gè)實(shí)施方式中，多胺來源于非蛋白質(zhì)水解物的提供源。在一種實(shí)施方式中，多胺通過合成方式制造。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，多胺濃度至少為約O. 5mg/L ;在另一個(gè)實(shí)施方式中，多胺濃度至少為約lmg/L ;在另一種實(shí)施方式中，多胺濃度至少為約2mg/L ;在再一個(gè)實(shí)施方式中，多胺濃度至少為5mg/L ;在另一個(gè)實(shí)施方式中，多胺濃度至少為8mg/L ;并且在又一種實(shí)施方式中，多胺濃度至少為10mg/L。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，培養(yǎng)基中的多胺濃度范圍為約O. 5 30mg/L，在另一個(gè)實(shí)施方式中為約O. 5 20mg/L,在又一種實(shí)施方式中為約I. O 20mg/L,在再一種實(shí)施方式中為約2. O 20mg/L,在另一種實(shí)施方式中為約2 10mg/L,在再一實(shí)施方式中為約2 8mg/L,并且在另一種實(shí)施方式中為約2 5mg/L。如上所述濃度是純多胺的各自濃度。如果使用多胺衍生物或包含化合物的多胺，那么多胺基團(tuán)的濃度在上述特定范圍內(nèi)。例如，2mg/L腐胺二鹽酸鹽相當(dāng)于約I. 095mg/L的腐胺濃度(無2HC1)。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基”，指的是無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，其不包含寡肽比如來源于蛋白質(zhì)水解物的寡肽。在一種實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含具有二十個(gè)以上氨基酸的寡肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含具有十五個(gè)以上氨基酸的寡肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含具有十個(gè)以上氨基酸的寡肽。在一種實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含具有七個(gè)以上氨基酸的寡肽；在另一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含具有五個(gè)以上氨基酸的寡肽；在再一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含具有三個(gè)以上氨基酸的寡肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，培養(yǎng)基不包含具有兩個(gè)以上氨基酸的寡肽。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基可以可選地包含谷胱甘肽和/或至少一種穩(wěn)定形式的谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺。在此使用的術(shù)語“谷胱甘肽”描述了一種由氨基酸谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，包括氧化型谷胱甘肽，即，二硫化谷胱甘肽，其為在氧化過程中通過在半胱氨酸巰基側(cè)鏈之間的二硫鍵形成的谷胱甘肽二聚物。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基不包含具有三個(gè)以上氨基酸的寡肽，但可可選地包含谷胱甘肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基不包含具有兩個(gè)以上氨基酸的寡肽，但可可選地包含谷胱甘肽和/或至少一種穩(wěn)定形式的谷氨酰胺。在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中，要避免的典型的蛋白和/或寡肽是那些在血清和血清衍生物中發(fā)現(xiàn)的蛋白和/或寡肽，比如，諸如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素或其他的生長因子、以及其重組體形式、或者是源于植物或酵母水解物的寡肽或其超濾形式。根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的培養(yǎng)基可以基于任何通常為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，比如DMEM'Ham' s F12,Medium 199、McCoy或RPMI。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以包含許多成分，包括氨基酸、維生素、有機(jī)鹽和無機(jī)鹽、以及碳?xì)浠衔镌?，各個(gè)成分的含量應(yīng)能維持細(xì)胞的培養(yǎng)，所述含量通常已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。該培養(yǎng)基可以包含輔助性物質(zhì)，比如，緩沖物質(zhì)例如碳酸氫鈉、抗氧化劑、抵消機(jī)械應(yīng)力的穩(wěn)定劑、或蛋白酶抑制劑。視需要，可以添加非離子型表面活性劑例如聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物和/或混合物(例如 Pluronic F68 , SERVA 公司)。在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基的實(shí)施方式中，多胺控制著DNA合成和RNA合成、和/或細(xì)胞增殖、和/或細(xì)胞分化、和/或細(xì)胞膜穩(wěn)定性、和/或抗氧化性DNA保護(hù)。在一種實(shí)施方式中，向無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加至少O. 5mg/L的多胺提高了在培養(yǎng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和/或病毒表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過在無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加至少O. 5mg/L的多胺，可以將培養(yǎng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)或者病毒滴度提高至少50%。在再一個(gè)實(shí)施方式中，所述提高是至少60%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，通過在無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加至少O. 5mg/L的多胺，將細(xì)胞比生產(chǎn)率提高至少兩倍；在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞比生產(chǎn)率提高至少三倍。在再一個(gè)實(shí)施方式中，添加至少O. 5mg/L的多胺會導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)和/或病毒滴度提高到至少400%;在另一個(gè)實(shí)施方式中，提高到至少500%;在另一個(gè)實(shí)施方式中，提高到至少600% ;在另一種實(shí)施方式中，提高到至少700%。在一種實(shí)施方式中，通過在無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加至少O. 5mg/L的多胺，培養(yǎng)細(xì)胞的比生長速率可以被提高。在另一種實(shí)施方式中，所述比生長速率可以被提高10%。在再一個(gè)實(shí)施方式中，所述比生長速率可以被提高20%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述比生長速率可以被提聞50%。在另一種實(shí)施方式中，所述比生長速率可以被提聞70%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述比生長速率可以被提高80 %。在再一個(gè)實(shí)施方式中，所述比生長速率可以被提高90 %。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述比生長速率可以被提高100 %。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，對培養(yǎng)基以化學(xué)方法進(jìn)行限定。在此使用的術(shù)語“以化學(xué)方法進(jìn)行限定”指的是，培養(yǎng)基不包含任何不明確的補(bǔ)充物，比如，諸如動(dòng)物組成部分、器官、腺體、植物、或酵母的提取物。因此，需要對以化學(xué)方法進(jìn)行限定的培養(yǎng)基各組分進(jìn)行精確地限定。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括下述步驟
(a)提供根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，以及
(b)在培養(yǎng)基中增殖細(xì)胞從而形成細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明不局限于任何類型的細(xì)胞。細(xì)胞類型的例子包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、鳥類的細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、和酵母細(xì)胞。該細(xì)胞可以是例如干細(xì)胞、或用重組基因表達(dá)用載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞、或者用制造病毒產(chǎn)物用病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。該細(xì)胞也可以是，例如，生產(chǎn)所研究蛋白質(zhì)的未進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，其可以例如通過類似Epstein Barr病毒感染的病毒感染而轉(zhuǎn)化成無限增殖狀態(tài)。該細(xì)胞也可以是例如初級細(xì)胞，例如雞胚細(xì)胞、或者原發(fā)細(xì)胞系。用于體外病毒生產(chǎn)的細(xì)胞是有用的。有用的細(xì)胞的具體例子包括BSC細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、RK細(xì)胞、TCMK-I細(xì)胞、LLCPK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、LLC-RK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、CHO細(xì)胞、NS-I細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、BHK細(xì)胞、293細(xì)胞、RK細(xì)胞、Per C6細(xì)胞、和雞胚細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞可以通過例如選自于分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、和恒化培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，所有這些方法通常是本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于表達(dá)至少一種蛋白質(zhì)比如異源蛋白或自體蛋白、或重組體蛋白的方法，包括下述步驟
a)提供細(xì)胞培養(yǎng)物；
b)將包含編碼至少一種蛋白質(zhì)的序列的至少一種核酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞；
c)選擇攜帶所述核酸序列的細(xì)胞；以及
d)在包含至少O.5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中表達(dá)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟d)的培養(yǎng)基是根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物已經(jīng)在根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行過培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，步驟a)至d)在根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。該包含至少一種蛋白質(zhì)編碼序列的核酸序列可以是載體。該載體可以通過病毒傳遞，或者可以是質(zhì)粒。該用于編碼蛋白質(zhì)的核酸序列可以是特異基因或其生物學(xué)功能部分。在一種實(shí)施方式中，該蛋白質(zhì)至少是凝血因子如Factor VIII的生物學(xué)活性部分，或者至少是包含在紅血球和血管生成素的產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)例如促紅細(xì)胞生成素的生物學(xué)活性部分，或者是單克隆抗體。在一種實(shí)施方式中，所述核酸序列包含編碼至少一種蛋白質(zhì)的序列，該蛋白質(zhì)選自于由凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、VffF, ADAMTS13和弗林蛋白酶所構(gòu)成的
組。、
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，該核酸還包括其他適合于控制蛋白質(zhì)表達(dá)的序列，比如啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子、TATA框、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、多聚接頭、限制酶切位點(diǎn)、聚A序列、蛋白質(zhì)加工序列、選擇性標(biāo)記等，它們通常已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞選自于由CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、和BHK細(xì)胞所構(gòu)成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，可以用重組載體轉(zhuǎn)化下述細(xì)胞系以便用于表達(dá)各產(chǎn)物用于生產(chǎn)重組凝血因子例如Fact or VII、和/或Factor VIII、和/或單克隆抗體的CHO細(xì)胞；用于生產(chǎn)重組紅細(xì)胞生成素的Epstein Barr病毒轉(zhuǎn)化BHK細(xì)胞；用于人抗體生產(chǎn)的無限增殖人B細(xì)胞。有用的細(xì)胞/蛋白質(zhì)組合例如是CH0細(xì)胞/凝血因子VIII、CHO細(xì)胞/凝血因子￥11、010細(xì)胞/^0410^13、010細(xì)胞/弗林蛋白酶、和293細(xì)胞/凝血因子IX。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，與通過不在本發(fā)明培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行的蛋白質(zhì)表達(dá)相比，至少一種通過在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所進(jìn)行的蛋白質(zhì)表達(dá)得到提聞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)提聞至少10% ;根據(jù)另一種實(shí)施方式，提聞至少50%。本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)至少一種病毒或病毒的至少一部分的方法，包括下述步驟
a)提供細(xì)胞培養(yǎng)物；
b)用至少一種病毒感染該細(xì)胞；
c)選擇受病毒感染的細(xì)胞；以及
d)在包含至少O.5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中于細(xì)胞內(nèi)增殖至少一種病毒。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟d)的培養(yǎng)基是根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物已經(jīng)在根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行過培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，步驟a)至d)在根據(jù)本發(fā)明的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。用于根據(jù)本發(fā)明的方法中的病毒可以是任何病毒，例如痘病毒，比如牛痘或者減毒牛痘病毒；冠狀病毒，例如SARS病毒；正粘病毒，例如流行性感冒A或B病毒；副粘病毒；反向病毒，例如慢病毒；披膜病毒，例如羅斯河病毒；黃病毒，例如西尼羅河病毒，黃熱病毒，或者FSME病毒(即蜱傳腦炎病毒)；腸道病毒，例如甲型肝炎病毒；細(xì)小核糖核酸病毒；嵌沙樣病毒；皰疫病毒；或者腺病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，病毒是修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)。該病毒可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行增殖，用于各疫苗的生產(chǎn)。病毒可以是野生型-病毒、減毒病毒、重排病毒、或重組細(xì)胞病毒或其組合物，例如減毒體和重組體。另外，可以使用感染性核酸克隆，以代替用病毒感染細(xì)胞的所用實(shí)際病毒子。也可以使用裂解的病毒子?？梢允褂糜糜谏a(chǎn)病毒的方法來生產(chǎn)包含病毒、病毒抗原或病毒類顆粒的免疫原組成物。用于根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)病毒的方法中的細(xì)胞可以選自于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、和酵母細(xì)胞所構(gòu)成的組。在一種實(shí)施方式中，用于根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)病毒的方法中的細(xì)胞選自于由VeiO細(xì)胞和雞胚細(xì)胞所構(gòu)成的組。
用于生產(chǎn)病毒或病毒一部分的細(xì)胞與病毒的有用組合是，例如=VeiO細(xì)胞/減毒牛痘、Vero細(xì)胞/牛痘、Vero細(xì)胞/甲型肝炎、Vero細(xì)胞/流感病毒、Vero細(xì)胞/西尼羅河病毒、VeiO細(xì)胞/SARS病毒、VeiO細(xì)胞/黃熱病毒、以及雞胚細(xì)胞/FSME病毒。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，細(xì)胞/病毒組合是雞胚細(xì)胞/修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)。有用的培養(yǎng)方法包括分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)。以下用實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例I :BAV培養(yǎng)基的制備
用包含無機(jī)鹽、氨基酸、維生素及其他組分的基本DMEM/Ham' s F12(l I)培養(yǎng)基(Life technologies公司，32500粉末)，制備無寡肽的培養(yǎng)基(BAV培養(yǎng)基)。還添加了L-谷氨酰胺(600mg/L)、抗壞血酸(20 μ Μ)、乙醇胺(25 μ M)、Synperonic (SERVA) (0. 25g/L)、亞硒酸鈉(50nM)。另外將下述必需氨基酸補(bǔ)充至細(xì)胞培養(yǎng)基一水L-天冬酰胺20mg/L、一水L-半胱氨酸鹽酸鹽15mg/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽20mg/L、L_脯氨酸35mg/L、L_色氨酸 20mg/L。
實(shí)施例2 :測定細(xì)胞數(shù)
可以用如 Schaerfe 等在文獻(xiàn) Biotechnologie in LaborPraxis 10:1096-1103(1988)中所述的CASY 細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過計(jì)數(shù)確定懸浮細(xì)胞或固定化細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)；也可以通過朽1檬酸萃取和細(xì)胞核突光染色、接著用Nucleo Counter (Chemometec公司，丹麥)通過計(jì)數(shù)來測定細(xì)胞數(shù)。根據(jù)某一時(shí)間段⑴內(nèi)懸浮細(xì)胞恒化培養(yǎng)物穩(wěn)態(tài)下的細(xì)胞密度(Xt)增加值和/或稀釋率(D)，按照下述公式計(jì)算出比生長速率(μ ):μ = D+In(Xt/XO) /1實(shí)施例3 =FVIII活性的測定
通過顯色分析(Chromogenic，瑞典)測量凝血因子VIII (FVIII)的活性(參見圖I至5)。
實(shí)施例4 :體積生產(chǎn)率(QP)和細(xì)胞比生產(chǎn)率(qp)的計(jì)算
由生產(chǎn)體系中每天每升反應(yīng)器體積產(chǎn)生的活性單位量(U/L/d)計(jì)算出體積生產(chǎn)率(QP)。
細(xì)胞比生產(chǎn)率(qp)被定義為每天每細(xì)胞數(shù)的蛋白特定生產(chǎn)量(U或者yg)。
實(shí)施例5 :細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)條件
將重組體哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如穩(wěn)定表達(dá)Factor VIII的CHO細(xì)胞，比如⑶8/6細(xì)胞)的細(xì)胞培養(yǎng)物加入IOL生物反應(yīng)器，在恒化培養(yǎng)基懸浮液中生長。恒定保持培養(yǎng)條件為37°C、氧飽和度20%、并且pH 7. O至7. I。培養(yǎng)基中恒定補(bǔ)料BAV培養(yǎng)基。
實(shí)施例6 :多胺的添加對FVIII表達(dá)的影響
如實(shí)施例5中描述的那樣，將GD8/6細(xì)胞加入IOL生物反應(yīng)器，在恒化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)進(jìn)料BAV培養(yǎng)基培養(yǎng)11天后，導(dǎo)致生產(chǎn)率降低至100U/L/d。通過添加腐胺二鹽酸鹽(2mg/L)，體積FVIII表達(dá)量提高800% (參見圖I)。因此，對于⑶8/6細(xì)胞系而言，腐胺可以清楚地確定為細(xì)胞特異表達(dá)的驅(qū)動(dòng)因子。
實(shí)施例7 :多胺和鐵(II)及銅(II)的添加對FVIII表達(dá)的影響
如在實(shí)施例5中描述的那樣，將GD8/6細(xì)胞在IOL生物反應(yīng)器中進(jìn)行恒化培養(yǎng)，直至、平均生產(chǎn)率為271U/L/D，同時(shí)細(xì)胞比生產(chǎn)率和比生長速率較低。通過添加腐胺二鹽酸鹽(2mg/L)，F(xiàn)VIII表達(dá)量增加到870U/L/D，這主要是因?yàn)榧?xì)胞比生產(chǎn)率被提高。以不同于原來包含在大豆水解物中的典型濃度而額外補(bǔ)充的鐵(II)和銅(II)導(dǎo)致了比生長速率提高大約至O. 60CT1，并且可以實(shí)現(xiàn)將細(xì)胞的比生產(chǎn)率提高至高于1700mU/106個(gè)細(xì)胞/天。在這些條件下，高于2685U/L/D的體積生產(chǎn)率被獲得。進(jìn)一步地，細(xì)胞密度的提高導(dǎo)致體積生產(chǎn)率超過3000U/L/D。在可比的發(fā)酵條件下，使用包含培養(yǎng)基的大豆水解物時(shí)的最大體積生產(chǎn)率是2000 2500U/L/D，表明僅包含腐胺和2種附加金屬離子的以化學(xué)方法進(jìn)行限定的培養(yǎng)基優(yōu)于以前該工藝中任何包含被研究的培養(yǎng)基配方的大豆水解物(參見圖2)。
實(shí)施例8 :細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)條件
在工作容積為200mL的Techne旋轉(zhuǎn)燒瓶中，在37°C，不控制pH和p02的條件下，以分批補(bǔ)料形式用GD8/6細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。該培養(yǎng)基中供給如上限定的BAV培養(yǎng)基，另外補(bǔ)充有腐胺二鹽酸鹽、鳥氨酸鹽酸鹽、精胺四鹽酸鹽、或乙醇胺、或其組合物，補(bǔ)充物的濃度范圍為0-18mg/L(相當(dāng)于0-10mg/L的非鹽酸鹽形式的生物胺(參見圖3至5)。
實(shí)施例9 :數(shù)種多胺和多胺組合物的添加對FVIII表達(dá)的影響
將如在實(shí)施例8中描述的用BAV培養(yǎng)基培養(yǎng)的GD8/6細(xì)胞進(jìn)行離心，接著轉(zhuǎn)移到工作容積為200mL的Techne旋轉(zhuǎn)燒瓶中，并且用限定的培養(yǎng)基以約1-2E06個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充有如圖3、4和5中所示的乙醇胺、腐胺、鳥氨酸、和/或精胺。作為生物胺路徑中腐胺的前體的鳥氨酸可以以依賴濃度的方式部分地代替腐胺。將不同濃度的鳥氨酸添加至包含腐胺二鹽酸鹽的培養(yǎng)基中，導(dǎo)致比FVIII生產(chǎn)率和比生長速率的額外提高(參見圖3)。然而，不是根據(jù)本發(fā)明的多胺的乙醇胺，既不能以任何研究的濃度代替腐胺，而且在包含腐胺的培養(yǎng)基中乙醇胺濃度的提高也不能導(dǎo)致體積生產(chǎn)率和比生長速率的顯著提高(參見圖5)。在相似條件下的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，作為生物胺路徑中的另一個(gè)中間體的精胺也可以以依賴濃度的方式代替腐胺(參見圖4)。
實(shí)施例10 :多胺的添加對MVA病毒生產(chǎn)的影響
將雞胚的初級細(xì)胞培養(yǎng)物加入Techne旋轉(zhuǎn)燒瓶(工作容積200mL)，使用未補(bǔ)充或補(bǔ)充了 3. 6mg/L腐胺二鹽酸鹽的無肽的培養(yǎng)基(FM培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。
用包含無機(jī)鹽、氨基酸、維生素及其他組分的基本M199培養(yǎng)基(Life technologies公司，31150粉末)，制備了 FM培養(yǎng)基。還添加了 NaHCO3 (添加量4. 4g/L)，硫酸慶大霉素(50 μ g/L)和硫酸新霉素(50 μ g/L)。
用MVA病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物，并且在TCID50試驗(yàn)中分析上清液的病毒滴度。通過添加腐胺，平均病毒滴度(各樣品η = 16個(gè))可以提高大約50% (參見圖6)。
實(shí)施例11 :數(shù)個(gè)劑量的多胺的添加對MVA病毒生產(chǎn)的影響
將雞胚的初級細(xì)胞培養(yǎng)物加入Techne旋轉(zhuǎn)燒瓶(工作容積200mL)，使用未補(bǔ)充或補(bǔ)充了 3. 6mg/L和9mg/L腐胺二鹽酸鹽的無肽的培養(yǎng)基(CEM培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。
用包含無機(jī)鹽、氨基酸、維生素及其他組分的基本DMEM/Ham' s F12(l I)培養(yǎng)基(Life technologies 公司，32500 粉末)，制備 CEM 培養(yǎng)基。還添加了 NaHCO3 (2g/L)、L_ 谷氨酰胺(600mg/L)、抗壞血酸(20 μ Μ)、乙醇胺(25 μ Μ), Synperonic (SERVA 公司)(O. 25g/L)、亞硒酸鈉(50nM)、FeSO4 ·7Η20(600 μ g/L)、硫酸慶大霉素(50 μ g/L)和硫酸新霉素(50 μ g/L)。另外將必需氨基酸補(bǔ)充至細(xì)胞培養(yǎng)基。另外將下述必需氨基酸補(bǔ)充至細(xì)胞培養(yǎng)基一水L-天冬酰胺20mg/L、一水L-半胱氨酸鹽酸鹽15mg/L、L_胱氨酸二鹽酸鹽20mg/L、L_脯氨酸 35mg/L、L-色氨酸 20mg/L。
用MVA病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物，并且在TCID50試驗(yàn)中分析上清液的病毒滴度。通過添加 9mg/L腐胺，平均病毒滴度(各樣品η = 4個(gè))可以提高大約60% (參見圖7)。
權(quán)利要求
1.一種無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含至少O. 5mg/L的多胺。
2.如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺選自于由尸胺、腐胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺、鳥氨酸及其組合物所構(gòu)成的組。
3.如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺通過合成方式制造。
4.如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多胺以約O.5 30mg/L的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
5.如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基不包含具有二十個(gè)以上氨基酸的寡肽。
6.如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基不包含具有三個(gè)以上氨基酸的寡肽，可選地包含谷胱甘肽。
7.如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基不包含具有兩個(gè)以上氨基酸的寡肽，可選地包含谷胱甘肽和/或至少一種穩(wěn)定形式的谷氨酰胺。
8.如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基以化學(xué)方法進(jìn)行限定。
9.一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括下述步驟 (a)提供如權(quán)利要求I所述的無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，以及 (b)在培養(yǎng)基中增殖細(xì)胞從而形成細(xì)胞培養(yǎng)物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞選自于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、和酵母細(xì)胞所構(gòu)成的組。
11.一種用于表達(dá)至少一種蛋白質(zhì)的方法，包括下述步驟 (a)提供細(xì)胞培養(yǎng)物； (b)將至少一種包含編碼至少一種蛋白質(zhì)的序列的核酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞； (c)選擇攜帶所述核酸序列的細(xì)胞；以及 (d)在包含至少O.5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中表達(dá)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是如權(quán)利要求I所述的無寡肽的培養(yǎng)基。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自于由凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、VffF, ADAMTS13和弗林蛋白酶所構(gòu)成的組。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞、293細(xì)胞或BHK細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞/蛋白質(zhì)組合選自于由CHO細(xì)胞/凝血因子VII、CH0細(xì)胞/凝血因子VIII、CH0細(xì)胞/ADAMTS13、CH0細(xì)胞/弗林蛋白酶、和293細(xì)胞/凝血因子IX所構(gòu)成的組。
16.一種用于生產(chǎn)至少一種病毒的方法，包括下述步驟 (a)提供細(xì)胞培養(yǎng)物； (b)用至少一種病毒感染所述細(xì)胞； (C)選擇受病毒感染的細(xì)胞；以及 (d)在包含至少O. 5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中于細(xì)胞中增殖所述至少一種病毒。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是如權(quán)利要求I所述的無寡肽的培養(yǎng)基。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述病毒選自于由痘病毒、冠狀病毒、正粘病毒、副粘病毒、反向病毒、披膜病毒、黃病毒、腸道病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、嵌沙樣病毒、皰疹病毒、以及腺病毒所構(gòu)成的組。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述病毒選自于由牛痘病毒、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、慢病毒、羅斯河病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒、FSME病毒、以及甲型肝炎病毒所構(gòu)成的組。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是Veix)細(xì)胞或雞胚細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞/病毒組合選自于由VeiO細(xì)胞/減毒牛痘、Vero細(xì)胞/牛痘、Vero細(xì)胞/甲型肝炎、Vero細(xì)胞/流感病毒、Vero細(xì)胞/西尼羅河病毒、Vero細(xì)胞/SARS病毒、Vero細(xì)胞/黃熱病毒、雞胚細(xì)胞/FSME病毒、以及雞胚細(xì)胞/修飾牛痘病毒安卡拉(MVA)所構(gòu)成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及無寡肽的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含至少0.5mg/L的多胺；本發(fā)明還涉及在所述包含至少0.5mg/L的多胺的無寡肽細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及在包含至少0.5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中表達(dá)至少一種蛋白質(zhì)的方法，并且涉及在包含至少0.5mg/L的多胺的培養(yǎng)基中制造至少一種病毒的方法。
文檔編號C12N5/071GK102643777SQ20121006038
公開日2012年8月22日 申請日期2007年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日
發(fā)明者利奧波德·格里伯格, 曼弗雷德·賴特, 沃爾夫?qū)っ商? 阿圖爾·米特雷爾 申請人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司