專利名稱：稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP及其方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pik-m功能性分子標(biāo)記PikmFNP及其方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是對(duì)水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的病害之一,姆年都造成嚴(yán)重的糧食損失。從環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的觀點(diǎn)來(lái)看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。傳統(tǒng)的水稻抗性育種依賴于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者必須具備豐富的接種、調(diào)查經(jīng)驗(yàn)，而且還容易受到環(huán)境以及人為因素的影響，鑒定結(jié)果容易造成誤差，目標(biāo)基因的選擇效率往往較低。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)生以及利用，其方便、直接、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)使得該技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值及前景越來(lái)越受到關(guān)注。在育種方面，通過(guò)開發(fā)與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，特別是在基因內(nèi)部開發(fā)其功能特異性的分子標(biāo)記來(lái)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，不僅選擇可靠性高，而且還大大加快了育種步伐。由于含有5個(gè)具有不同抗譜以及小種特異性的等位基因Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik-s，位于第11染色體長(zhǎng)臂端上的Pik位點(diǎn)一直是稻瘟病抗性研究以及抗病育種的焦點(diǎn)。其中，Pik-m(Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm—specific riceblast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、Pik(Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189:321-334)以及Pik_p(Yuan et al. 2011. The Pik-presistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linkedCC-NBS-LRR genes. TheorAppl Genet 122:1017-1028)已被成功地鑒定并克隆 研究表明，這3個(gè)等位基因的稻瘟病抗性須由2個(gè)相鄰的NBS-LRR類抗病基因共同介導(dǎo)。同時(shí)，在水稻群體中，包含這3個(gè)等位基因的基因組區(qū)域存在著基因型的分化，即當(dāng)相鄰的2個(gè)功能性的NBS-LRR基因同時(shí)存在時(shí)，該基因型定義為K型；而當(dāng)相鄰的2個(gè)功能性的NBS-LRR基因同時(shí)不存在時(shí)，該基因型定義為N型(基因型與感病水稻參考品種日本睛的相同)。為了加快Pik-m在抗病育種工作中的應(yīng)用，如在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、抗性基因Pik-m與其他功能基因的聚合育種、轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用，開發(fā)出準(zhǔn)確有效的且區(qū)別于其它稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性分子標(biāo)記顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的是提供一種稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的應(yīng)用。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP，它是由引物對(duì)SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2從水稻總DNA中擴(kuò)增出的核苷酸序列，并經(jīng)特異性酶切之后，與稻瘟病抗性基因Pik-m呈特異性帶型的分子標(biāo)記；所述的引物對(duì)的核苷酸序列如下所示
SEQ ID NO. 1(5，-3，)TCGCCGGTGACCTAAGAGAT ；SEQ ID NO. 2(5’ _3，) GATTTCACCGGCGCAAGCAT ；所述的水稻品種為Tsuyuake ；所述的稻瘟病抗性基因Pik-m包括2個(gè)編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pikml-TS和Pikm2-TS ；所述的特異性酶切指的是Mbo I酶切；所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列與Pikml-TS及Pikm2_TS做比對(duì)的方法，分析得到能區(qū)別于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性的I處單堿基差異(single nucleotide polymorphism, SNP),再通過(guò)引物設(shè)計(jì)得到SEQ IDNO. I及SEQ ID NO. 2，對(duì)水稻DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到Pik_m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP。優(yōu)選的，上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法，包括以下步驟(I)通過(guò)常規(guī)PCR法擴(kuò)增，獲得多個(gè)K型水稻品種的Pik-m等位基因的編碼區(qū)DNA序列；(2)利用多序列比對(duì)軟件工具(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)，將步驟⑴所獲得的序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后進(jìn)行比對(duì)，得到Pik_m抗性基因所特異的I個(gè)SNP，其位于Pik-m組成基因中的Pikml-TS的CC區(qū)域，最終導(dǎo)致功能特異性
氨基酸的改變；(3)根據(jù)步驟(2)所得到的 I 個(gè) SNP 以及 dCAPS(Derived Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequences)標(biāo)記的原理，利用 Primer Premier 5. 0 軟件工具(http://www.premierbiosoft. com)設(shè)計(jì)出引物對(duì)SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2 ;并用這組引物分別對(duì)不同水稻的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳，比較驗(yàn)證；(4)對(duì)步驟(3)所獲得的分子標(biāo)記在不同水稻品種中進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定Pik-m抗性基因的功能特異性的分子標(biāo)記PikmFNP。更優(yōu)選的，步驟(I)所述的K型水稻品種包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交4以及 Q1063 ；步驟(3)中在SNP處設(shè)計(jì)帶有錯(cuò)配堿基的功能特異性上游引物SEQ ID NO. 1，而在其下游100_200bp處設(shè)計(jì)功能特異性下游引物SEQ ID NO. 2 ；
步驟(3)中所述的PCR的反應(yīng)體系如下
10XPCR Buffer2 ^il
dNTPs (2.5 mM)1.6 ^il
上游引物(IOpM)0.5 ^il
下游引物(IOpM)0.5 ^il
r腳酶(5U4U)0.1 ^il
DNA模板(50ng/|il)Ifil
ddH20補(bǔ)至 20pl所述的PCR的反應(yīng)條件如下預(yù)變性94°C 3分鐘；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分鐘，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘;10°C保存。步驟(3)中所述的酶切為利用限制性內(nèi)切酶Mbo I對(duì)所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，
其反應(yīng)體系如下
10 X酶切緩沖液1.2 W
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 ^il
Mbo I0.25 ^il
ddH20補(bǔ)至 12 ^il在3rc條件下酶切3小時(shí)后，取適量酶切產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳條件為90V，2小時(shí)30分鐘。擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物大小為166bp，酶切后所得到的產(chǎn)物大小為145bp，后者即為抗性基因Pik-m的功能特異性分子標(biāo)記。所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的應(yīng)用，包括在水稻種質(zhì)資源中快速、直接地鑒定該抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明的Pik-m功能特異性選擇標(biāo)記以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，不僅能區(qū)分水稻品種的基因型，而且能夠方便、快捷、直接地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因Pik-m在水稻種質(zhì)資源以及育種后代中的鑒定，且不受環(huán)境以及人為因素的影響。因此，能夠得到廣泛的應(yīng)用，對(duì)降低勞動(dòng)成本，提高育種工作效率起到積極重要的作用。


圖I是具有功能特異性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的組成基因之一Pikml-TS與4個(gè)Pik位點(diǎn)等位基因及2個(gè)感病等位基因的蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖；黑色星號(hào)表示由PikmFNP造成的功能特異性氨基酸的改變。圖2是水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的另ー組成基因Pikm2_TS與4個(gè)Pik位點(diǎn)等位基因及2個(gè)感病等位基因的蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖。
圖3是Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP在12個(gè)水稻品種中的驗(yàn)證結(jié)果圖其中，泳道I :抗性基因供體品種Kusabue (Pik);泳道2 : IRBLk-Ka (Pik單基因系)；泳道3 :抗性品種Kando 51 (Pik);泳道4 :抗性品種Kuyuku 131 (Pik);泳道5 :抗性基因供體品種Tsuyuake (Pik-m);泳道6 : IRBLKm-TS (Pik-m單基因系)；泳道7 :抗性品種GA20 (Pik-m);泳道8 :抗性基因供體品種K60 (Pik_p);泳道9 :1RBLkp-K60 (Pik_p單基因系);泳道10 :抗性品種Taifenzhan(Pik-p);泳道11 =IRBLks-S(Pik-s單基因系);泳道12 IRBLKh-K3 (Pik-h 單基因系);泳道 M :DNAladder。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I :Pik等位基因編碼區(qū)序列的比對(duì)及SNP的鑒定通過(guò)常規(guī)的PCR擴(kuò)增(Yuanet al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes. TheorAppl Genet 122 :1017-1028 ;Zhai et al. 2011. The isolation and characterizationof Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologistl89 :321-334)、測(cè)序(上海英駿生物技術(shù)有限公司，廣州分公司)，從5個(gè)抗病水稻品種 Shin 2 (Pik-s 供體品種；Kiyosawa. 1987. With genetic view on themechanism of resistance and virulence. Japanese Journal of Genetics 41:89-92)、Tsuyuake(Pik-m 供體品種；Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm—specificrice blast resistance. Geneticsl80 :2267-2276)、Kusabue (Pik 供體品種；Zhai etal.2011. i'he isolation and cnaracterization of Pik, a rice blast resistancegene wmch emerged after rice domestication. New Phytologist 189 :321-334)、K3 (Pik-h 供體品種；Xu et al. 2008. Efficient authentic fine mapping of the riceblast resistance gene Pik-h in the Pik cluster，using new Pik-h-differentiatingisolates. Molecular Breeding 22 :289-299)、K60 (Pik-p 供體品種；Yuan et al. 2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair ofclosely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genetl22 :1017-1028)及 2 個(gè)感病水稻品種黑交(K 型感病品種；Zhai et al. 2011. The isolation and characterization ofPik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. NewPhytologist 189 :321-334)、Q1063 (K 型感病品種；Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189 :321-334)中獲得相應(yīng)的 Pik_m 等位基因編碼區(qū)DNA 序列[Pik-p (HM035369)，Pik(HM048900)，Pik_m(AB462256)，已經(jīng)公開于 http://www.ncbi. nlm. nih. gov];利用多序列比對(duì)軟件工具(http://multalin. toulouse. inra. fr/multalin/)，通過(guò)對(duì)這些序列翻譯后的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定到存在于Pikml-TS基因cDNA第685位點(diǎn)的功能特異性SNP。在第685位點(diǎn)處，Pikml-TS編碼的第229位氨基酸為谷氨酰胺(Q)，而其它等位基因在該位點(diǎn)則編碼谷氨酸或賴氨酸(E或K)，因此，該位點(diǎn)可以將Pik-m與其它等位基因區(qū)分開(圖I)。圖2是水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的另ー組成基因Pikm2-TS與4個(gè)Pik位點(diǎn)等位基因及2個(gè)感病等位基因的蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖。在此，不存在Pik-m功能特異性的SNP。實(shí)施例2 :Pik_m功能特異性分子標(biāo)記及其引物設(shè)計(jì)與檢測(cè)根據(jù)dCAPS 標(biāo)記的原理(Neff et al. , 2002. Web-based primer design for thesingle nucleotide polymorphism analysis. Trends in Genetics 18 :d13_615),在上述SNP位點(diǎn)處設(shè)計(jì)帶有錯(cuò)配堿基的功能特異性上游引物Pikm-FNP-F，如SEQ ID NO. I所示；在上述SNP位點(diǎn)下游100-200bp處設(shè)計(jì)功能特異性下游引物Pikm-FNP-R，如SEQ ID NO. 2所示。利用這該組引物對(duì)攜帶有Pik-m基因以及其他等位基因的品種DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。Pikm-FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下
10XPCR Buffer2 ^il dNTPs (2.5 mM)1.6 ^il 上游引物 Pikm-FNP-F (10 ^iM)0.5 ^il 下游引物 Pikm-FNP-R (10 ^iM)0.5 ^il r腳酶(5U4U)0.1 ^il DNA模板(50ng/|il)Ifil ddH20補(bǔ)至 20plPikm-FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溫度循環(huán)條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、58°C 30秒、720C I分鐘，35個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘；10°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用限制性內(nèi)切酶Mbo I對(duì)所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，其反應(yīng)
體系如下
10 X酶切緩沖液1.2 WPCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 ^ilMbo I0.25 ^il
ddH20補(bǔ)至 12 ^il在37°C條件下酶切3小時(shí)后，取適量酶切樣品在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳條件為90V，2小時(shí)30分鐘。擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物大小為166bp，酶切后所得到的產(chǎn)物大小為145bp，后者(能被酶切)即為抗性基因Pik-m的功能特異性分子標(biāo)記。實(shí)施例3 :抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記在鑒別不同稻瘟病抗性基因中的應(yīng)用提取含有不同的稻瘟病抗性基因的12個(gè)水稻品種([分別為KuSabue、Kand051、Kuyuku 131、GA20、Taifenzhan(Zhai et al. 2011. The isolation and characterizationof Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 :321-334)、Tsuyuake(Ashikawa et al. 2008. Two adjacentnucleotide-binding site—leucine rich repeat class genes are required to conferPikm-specif ic rice blast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、K60 (Yuan etal.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pairof closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122 :1017-1028)、IRBLk-Ka、IRBLKm-TS、IRBLkp_K60、IRBLks-S、及 IRBLKh_K3 (Kobayashi et al. 2007. Developmentofnew sets of international standard differential varieties for blast resistancein rice(Oryza sativa L.). JARQ 41:31-37]的基因組DNA，并以此為模板，利用實(shí)施例2中描述的Pikm-FNP的PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系和反應(yīng)條件，對(duì)抗性基因Pik_m功能特異性的分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切及電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果分別如圖3所示。如

的那樣，試驗(yàn)結(jié)果與設(shè)計(jì)分析的相吻合，說(shuō)明抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記可在鑒別Pik-m基因與其他稻瘟病抗性基因得到應(yīng)用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP，其特征在于是由引物對(duì)SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2從水稻總DNA中擴(kuò)增出的核苷酸序列，并經(jīng)特異性酶切之后，與稻瘟病抗性基因Pik-m呈特異性帶型的分子標(biāo)記； 所述的引物對(duì)的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I :5’ -TCGCCGGTGACCTAAGAGAT-3’ ；SEQ ID NO.2 :5’ -GATTTCACCGGCGCAAGCAT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP，其特征在于所述的水稻為水稻品種Tsuyuake。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pik-m包括2個(gè)編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pikml-TS和Pikm2-TS。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP，其特征在于所述的特異性酶切為Mbo I酶切。
5.權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法，其特征在于通過(guò)對(duì)多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列與Pikml-TS及Pikm2-TS做比對(duì)的方法，分析得到能區(qū)別于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性的I處單堿基差異，再通過(guò)引物設(shè)計(jì)得到SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2，對(duì)水稻DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到Pik_m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟 (1)通過(guò)常規(guī)PCR法擴(kuò)增，獲得多個(gè)K型水稻品種的Pik-m等位基因的編碼區(qū)DNA序列； (2)利用多序列比對(duì)軟件工具，將步驟(I)所獲得的序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后進(jìn)行比對(duì)，得到Pik-m抗性基因所特異的I個(gè)單堿基差異，其位于Pik-m組成基因中的Pikml-TS的CC區(qū)域，最終導(dǎo)致功能特異性氨基酸的改變； (3)根據(jù)步驟⑵所得到的I個(gè)單堿基差異以及dCAPS標(biāo)記的原理，利用PrimerPremier 5. 0軟件工具設(shè)計(jì)出引物對(duì)SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2 ;并用這組引物分別對(duì)不同水稻的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳，比較驗(yàn)證； (4)對(duì)步驟(3)所獲得的分子標(biāo)記在不同水稻品種中進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定Pik-m抗性基因的功能特異性的分子標(biāo)記PikmFNP。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(I)所述的K型水稻品種包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交4以及Q1063。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中所述的PCR的反應(yīng)體系如下10XPCR Buffer 2u 1,2. 5mMdNTP I. 6u l、10iiM 引物 SEQ ID NO. 10. 5 u l、10iiM 引物 SEQ ID NO. 20. 5 u l、5U/y I rTaq酶 0. I ii l、50ng/ V- I DNA 模板 I ii I、雙蒸水補(bǔ)至 20 ii I ; 所述的PCR的反應(yīng)條件如下預(yù)變性94°C 3分鐘；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分鐘，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘;10°C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的檢測(cè)方法，其特征在于 步驟(3)中所述的酶切為利用限制性內(nèi)切酶Mbo I對(duì)所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，其反應(yīng)體系如下=IOX酶切緩沖液I. 2 μ I、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ I、Mbo I酶O. 25 μ 1，雙蒸水補(bǔ)至 12μ I。
10.權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP的應(yīng)用，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP應(yīng)用于在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP及其方法與應(yīng)用。該分子標(biāo)記PikmFNP是由引物對(duì)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2從水稻總DNA中擴(kuò)增出來(lái)的核苷酸序列。本發(fā)明通過(guò)對(duì)多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列與Pikm1-TS及Pikm2-TS序列做比對(duì)的方法，分析得到能區(qū)別于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性的單堿基差異，再通過(guò)設(shè)計(jì)，得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，對(duì)水稻DNA擴(kuò)增，并經(jīng)特異性酶切之后，得到Pik功能特異性分子標(biāo)記PikmFNP。本發(fā)明可在大量的水稻種質(zhì)資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中的得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102618533SQ20121006027
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者林菲, 潘慶華, 王玲, 翟純 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)