專利名稱：化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及用于細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。具體而言，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基可用于擴(kuò)增并同時保持可獲取軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的多能表型，本發(fā)明還涉及利用這群擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞群治療受益于施用治療量的這種擴(kuò)增和分化的間充質(zhì)干細(xì)胞群的疾病的方法。
背景技術(shù)：
在整形外科中、創(chuàng)傷外科中或摘除腫瘤病灶后的骨和軟骨片段的重構(gòu)中都要進(jìn)行骨和軟骨的移植。目前，用于該目的的是自體來源的或者來自活著或死亡的捐獻(xiàn)者的人體組織。隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展，源自間充質(zhì)干細(xì)胞的骨和軟骨細(xì)胞正成為用于骨骼修復(fù)的細(xì)胞來源。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可見于身體的某些組織中，例如骨髓、血液、真皮和骨膜中。它們具有分化為其它類型的細(xì)胞的能力，因此可有助于損傷后組織的愈合。MSC可以從骨髓中分離純化并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增。

目前，MSC的體外擴(kuò)增是在補(bǔ)充有胎牛血清(下文中稱作“FBS”)或補(bǔ)充有人的自體血清或基本相似或等同的血清(也稱為“血清”)的培養(yǎng)基中進(jìn)行。然而，從MSC培養(yǎng)物的潛在治療應(yīng)用的角度來看，MSC培養(yǎng)物中存在動物或人血清具有某些弊端和局限。首先，牛血清、人血清或其它動物血清可能含有血液傳播的病原體,例如病毒和瘋牛病朊病毒、牛海綿狀腦病(“BSE”)等。其次，牛血清會激發(fā)抗異型生物質(zhì)蛋白的抗體的產(chǎn)生，異型生物質(zhì)蛋白可激發(fā)受體患者的免疫應(yīng)答。第三，牛血清顯示出批間差異，可導(dǎo)致不一致的性能。顯然，如果本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基和使用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法能夠?qū)崿F(xiàn)包括MSC在內(nèi)的細(xì)胞的擴(kuò)增并進(jìn)而實(shí)現(xiàn)MSC在培養(yǎng)物中的分化，那么僅含有化學(xué)成分確定的物質(zhì)且不含血清和異型生物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基對MSC(以及其他細(xì)胞)的培養(yǎng)而言將非常理想。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主要目的可以是提供用于細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)成分確定的發(fā)明性無血清培養(yǎng)基(也稱為“無血清培養(yǎng)基”)的一種或多種實(shí)施方式，并且涉及用于體外擴(kuò)增MSC群(包括但不限于人MSC( “hMSC”))的該發(fā)明性無血清培養(yǎng)基的具體的非限制性實(shí)施方式。本發(fā)明的另一主要目的可以是提供含有化學(xué)成分的組合的無血清培養(yǎng)基的實(shí)施方式，所述化學(xué)成分能夠支持MSC在離體體外細(xì)胞培養(yǎng)物中的、特別是在不含任何血清(例如胎牛血清、自體血清或其它動物血清)的MSC體外培養(yǎng)物中的活力、增殖和分化。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)基的實(shí)施方式可用于支持MSC的活力、增殖和分化，其效果或結(jié)果與含有血清的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基相比基本相似或更好。本發(fā)明的另一主要目的可以是在導(dǎo)致MSC群擴(kuò)增和MSC分化以產(chǎn)生軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(例如MSC，特別是人MSC)的方法。本發(fā)明的又一主要目的可以是在帶負(fù)電的塑料表面(例如帶負(fù)電的聚苯乙烯塑料表面)上培養(yǎng)細(xì)胞(例如MSC)的方法，該方法避免了以纖連蛋白等包被表面的步驟。當(dāng)然，本發(fā)明的其它目的在說明書的其它部分、附圖、照片和權(quán)利要求中都有公開。


圖1提供了 對在含10%FBS的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hMSC和在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中培養(yǎng)的hMSC的細(xì)胞培養(yǎng)物形態(tài)學(xué)進(jìn)行比較的圖。圖2是細(xì)胞數(shù)量對天數(shù)的作圖，該圖比較了在含10%FBS的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hMSC的生長速率和在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中培養(yǎng)的hMSC的生長速率。圖3是細(xì)胞數(shù)量對傳代數(shù)的作圖，該圖比較了每次分瓶(split)時的hMSC總數(shù)，其中，起始傳代數(shù)為4，從含10%FBS的常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)入本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中或進(jìn)入含10%FBS的常規(guī)培養(yǎng)基中。圖4提供了對在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中培養(yǎng)的hMSC和在含10%FBS的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hMSC的集落形成能力進(jìn)行比較的圖。圖5提供了對在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中長期培養(yǎng)后的hMSC和在含10%FBS的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hMSC的多向分化潛能進(jìn)行比較的圖。圖6是細(xì)胞數(shù)量對傳代數(shù)的作圖，該圖顯示出，在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中的hMSC的生長速率在使用和未使用培養(yǎng)容器上的平板包被層的情況下都相似。圖7是細(xì)胞數(shù)量對傳代數(shù)的作圖，該圖比較了在補(bǔ)充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式中培養(yǎng)的源自臍帶血的MSC的生長速率與在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中培養(yǎng)的源自臍帶血的MSC的生長速率。圖8是細(xì)胞數(shù)量對傳代數(shù)的作圖，該圖比較了在補(bǔ)充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的源自脂肪組織的MSC的生長速率與在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中培養(yǎng)的源自脂肪組織的MSC的生長速率。圖9是在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中培養(yǎng)hMSC時總細(xì)胞數(shù)對所用的培養(yǎng)瓶的類型的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)細(xì)胞的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。具體而言，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基可用于單個核細(xì)胞(mononuclear cell)的離體擴(kuò)增并同時保持多能表型，其中軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞可源自所述間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明還涉及利用化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基使體外擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞群分化為軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞并治療可受益于所獲取的軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞群的骨和軟骨疾病的方法。
對于本發(fā)明，術(shù)語“無血清”表示不存在任何物種的任何血清，包括但不限于，不存在胎牛血清、小牛血清或人血清等或者它們的組合。對于本發(fā)明，無論是否明確指出，本文中所有數(shù)值均設(shè)定為由術(shù)語“約”修飾。對于本發(fā)明，各范圍可以表示為從“約”一個具體值至“約”另一個具體值。當(dāng)表述了這樣的范圍時，另一實(shí)施方式包括從所述一個具體值至所述另一個具體值。通過端點(diǎn)來描述的數(shù)值范圍包括了該范圍內(nèi)所含的所有數(shù)值。例如，I至5的數(shù)值范圍包括了數(shù)值1、1. 5、2、2. 75、
3、3. 80、4和5等。還應(yīng)該理解的是,每個范圍的端點(diǎn)不論相對于另一個端點(diǎn)還是獨(dú)立于另一個端點(diǎn)都具有顯著意義。當(dāng)利用了在前的“約”來將一個值表示為近似值時，應(yīng)該理解的是，該特定值構(gòu)成了另一實(shí)施方式。對于本發(fā)明，術(shù)語“組合”是指將兩種以上材料合在一起的任何方法。所述方法包括但不限于混合、共混、摻和、調(diào)混、勻化、合并、摻混或攪拌等。對于本發(fā)明，術(shù)語“ 一個”或“ 一種”事物是指一個/種或多個/種該事物；例如，“一種蛋白”或“一種肽”是指一種或多種所述化合物或至少一種化合物。這樣，術(shù)語“一個”或“一種”、“一個/種或多個/種”和“至少一個/種”在本文中可以互換使用。此外，“選自由……組成的組的”化合物是指其中所列的一種或多種化合物，包括兩種以上這些化合物的組合。根據(jù)本發(fā)明，分離的化合物是已從其天然環(huán)境中取出的化合物。這樣，“分離的”不必反映出該化合物的純化程度。本發(fā)明的分離的化合物可從其天然來源獲得，可利用分子生物學(xué)技術(shù)來制備，或者可以通過化學(xué)合成來制備。另外，雖然描述了本發(fā)明實(shí)施方式的特定成分或要素的某些來源以及這些成分或要素的具體產(chǎn)品號，但本發(fā)明并不限于此，而且，適合用于本發(fā)明實(shí)施方式的相同、等同或基本相似的成分或要素可以從多種多樣的來源獲得。包括本發(fā)明最佳模式的本發(fā)明的培養(yǎng)基的實(shí)施方式可提供無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(也稱為“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”)。無 血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可包括Dulbecco’s Modified EagleMedium或組成相同、等同或基本相似的培養(yǎng)基(下文中稱為“DMEM”)(本發(fā)明的實(shí)施方式使用的適合的 DMEM 可獲自 Invitrogen, 5791Van Allen Way, Carlsbad, CA, PNl 1965 (液體形式)或PN12100(粉末)，并根據(jù)制造商提供的使用說明制備)與MCDB201培養(yǎng)基或組成相同、等同或基本相似的培養(yǎng)基(下文中稱為“MCDB”)(本發(fā)明的實(shí)施方式使用的適合的MCDB可獲自Sigma-Aldrich(PN M6770))的混合物。還可以獲得加入了某些成分(例如谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES、酚紅、葡萄糖)且不含某些成分(例如蛋氨酸、半胱氨酸或鈣)的每種所述常規(guī)培養(yǎng)基，且每種所述培養(yǎng)基都可以根據(jù)用途而用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的某些實(shí)施方式中?；A(chǔ)培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式可包含DMEM和MCDB，且DMEM:MCDB的組合比(v/v)為約O. 75:1. 25至約1. 25:0. 75 ;然而，本發(fā)明并不限于此，利用選自以下組的DMEM:MCDB比能夠制得在具體用途中帶來益處的實(shí)施方式，所述組包括約O. 75:1. 25至約O. 85:1. 15，約 O. 80:1. 20 至約 O. 90:1. 10，約 O. 85:1. 15 至約 O. 95:1. 05，約 90:110 至約1. 05:0. 95，約1. 00:1. 00 至約1. 10:0. 90，約1. 05:0. 95 至約1. 15:0. 85，約1. 10:0. 90 至約1. 20:0. 80，和約1. 15:0. 85至約1.25:0.75。關(guān)于用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(“MSC”)、特別是人間充質(zhì)干細(xì)胞(“hMSC”)的本發(fā)明的特定實(shí)施方式，可利用具有適當(dāng)結(jié)果的約1:1v/V的DMEM:MCDB比?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含一種或多種下文中進(jìn)一步描述的成分，根據(jù)用途，這些成分可以與DMEM和MCDB的組合以各種排列方式、組合方式、濃度或量組合在一起。在每種情況中，可以以所述的范圍或量來使用所述一種或多種成分，并且，根據(jù)成分的用途或組合，可以采用針對任何特定成分或要素所描述的范圍的選定區(qū)段來實(shí)現(xiàn)某些益處?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含緩沖劑，例如量為約3. 2g/L基礎(chǔ)培養(yǎng)基至約
4.2g/L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳酸氫鈉,在特定實(shí)施方式中，為約3. 7g/L?？衫靡欢康臍溲趸c將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的PH調(diào)節(jié)為約7. 3至約7. 5的最終pH，在特定實(shí)施方式中pH為約7. 4?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含調(diào)控鐵源，該調(diào)控鐵源在結(jié)合所培養(yǎng)的細(xì)胞的受體時會釋放一定量 的鐵。調(diào)控鐵源的非限制性實(shí)例可以是一定量的轉(zhuǎn)鐵蛋白，其在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為約2mg/L至約10mg/L。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)鐵蛋白的量可選自以下組，該組包括約2mg/L至約4mg/L,約3mg/L至約5mg/L,約4mg/L至約6mg/L,約 5mg/L 至約 7mg/L,約 6mg/L 至約 8mg/L,約 7mg/L 至約 9mg/L,和約 8mg/L 至約10mg/L?；A(chǔ)培養(yǎng)基的特定實(shí)施方式可包含量為約5mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含電子傳遞激活劑。電子傳遞激活劑可包含一定量的硒或一定量的亞硒酸；然而，本發(fā)明不限于此，還可以利用其它微量元素、金屬酶或蛋白來支持電子傳遞。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含一定量的亞硒酸的實(shí)施方式中，其量可以為約O. 0000025g/L 至約 O. 0000050g/L，特定實(shí)施方式包含約 O. 0000037g/L?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含一種或多種抗氧化劑。作為非限制性實(shí)例，抗氧化劑可包含一定量的α -生育酚乙酸酯或一定量的抗壞血酸-2-磷酸酯，或一定量的α -生育酚乙酸酯和抗壞血酸-2-磷酸酯。特定實(shí)施方式可包含量為約O. 0001g/L至約
0.0003g/L的α -生育酚乙酸酯和量為約0. 02g/L至約0. 04g/L的抗壞血酸_2_磷酸酯。一個非限制性實(shí)例包含量為約0. 0002g/L的α -生育酚乙酸酯和量為約0. 0322g/L的抗壞血酸-2-磷酸酯。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含一種或多種類固醇。作為非限制性實(shí)例，類固醇可包含一定量的地塞米松或一定量的氫化可的松，或一定量的地塞米松和氫化可的松。特定實(shí)施方式可包含量為約2. O μ g/L至約5. O μ g/L的地塞米松與量為約0. 5mg/mL至約
1.5mg/mL的氫化可的松的組合?；A(chǔ)培養(yǎng)基的一個非限制性實(shí)例包含量為約0. 000004g/L的地塞米松與量為約0. 001g/L的氫化可的松的組合?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含量為約0. 001g/L至約0. 003g/L的5_羥色胺?；A(chǔ)培養(yǎng)基的一個非限制性實(shí)例包含量為約0. 002g/L的5-羥色胺?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)施方式還可以包含一定量的人血清白蛋白(“HSA”)(其可以是重組人血清白蛋白(“rHSA”))。特定實(shí)施方式可包含量為約0.1 g/L至約0. 3g/L的HSA。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的一個非限制性實(shí)例包含量為約0. 25g/L的HSA。用于培養(yǎng)MSC或hMSC的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的非限制性特定實(shí)施方式可以包含各自的終濃度如表I所示的成分組合，或基本由該成分組合構(gòu)成，或由該成分組合構(gòu)成。表1.用于MSC培養(yǎng)的培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含 a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含血清；和 b)基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，其包含 i) 一種或多種細(xì)胞生長因子； ) 一種或多種磷脂生長因子；和 iii) 一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑。
2.如權(quán)利要求1所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含一定量的DMEM和一定量的MCDB，其中DMEM與MCDB之比為約O. 75:1. 25v/v至約1. 25:0. 75v/v0
3.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述DMEM與MCDB之比選自由下述范圍組成的組:約O. 75:1. 25至約O. 85:1. 15，約O. 80:1. 20至約O. 90:1. 10，約 O. 85:1. 15 至約 O. 95:1. 05，約 90:110 至約1. 05:0. 95，約1. 00:1. 00 至約1. 10:0. 90，約1.05:0. 95 至約1. 15:0. 85，約1. 10:0. 90 至約1. 20:0. 80，和約1. 15:0. 85 至約 125:0. 75。
4.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種細(xì)胞生長因子選自由胰島素、bFGF、PDGF-bb, EGF, TGF- β I和IGF-1組成的組。
5.如權(quán)利要求4所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述胰島素在所述化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為約4mg/L至約6mg/L。
6.如權(quán)利要求5所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述bFGF、H)GF-bb、EGF,TGF-β I和IGF-1中的每一種在所述化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為約Ing/mL 至約 20ng/mL。
7.如權(quán)利要求6所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述bFGF、H)GF-bb、EGF,TGF-β I和IGF-1中的每一種在所述化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度選自由下述范圍組成的組約Ing/mL至約4ng/mL,約3ng/mL至約5ng/mL,約4ng/mL至約6ng/mL,約 5ng/mL 至約 7ng/mL,約 6ng/mL 至約 8ng/mL,約 7ng/mL 至約 9ng/mL,約 8ng/mL 至約10ng/mL,約 9ng/mL 至約 I Ing/mL,約 10ng/mL 至約 12ng/mL,約 I Ing/mL 至約 13ng/mL,約12ng/mL 至約 14ng/mL,約 13ng/mL 至約 15ng/mL,約 14ng/mL 至約 16ng/mL,約 15ng/mL 至約 17ng/mL,約 16ng/mL 至約 18ng/mL,約 18ng/mL 至約 20ng/mL,和約 19ng/mL 至約 20ng/ml
8.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種脂質(zhì)生長因子選自由LPA和SlP組成的組。
9.如權(quán)利要求8所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種脂質(zhì)生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為約IOOnM至約200ηΜ。
10.如權(quán)利要求9所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種脂質(zhì)生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度選自由下述范圍組成的組約IOOnM至約120ηΜ，約11OnM 至約 130ηΜ，約 120ηΜ 至約130ηΜ 至約 150ηΜ，約 140ηΜ 至約 160ηΜ，約 150ηΜ至約 170ηΜ，約 160ηΜ 至約 180ηΜ，約 190ηΜ 至約 200ηΜ。
11.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑選自由人WNT3A和RSPOl組成的組。
12.如權(quán)利要求11所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為約20ng/mL至約200ng/mL。
13.如權(quán)利要求12所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑包含濃度為約20ng/mL的人WNT3A和濃度為約40ng/mL的RSPOl的組合。
14.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含一種或多種類固醇。
15.如權(quán)利要求14所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種類固醇選自由地塞米松和氫化可的松組成的組。
16.如權(quán)利要求14所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一種或多種類固醇包含濃度為約2. O μ g/mL至約5. O μ g/mL的所述地塞米松和濃度為約O. 5mg/mL至約1. 5mg/mL的所述氫化可的松的組合。
17.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含調(diào)控鐵源。
18.如權(quán)利要求17所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述調(diào)控鐵源包含一定量的轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為約2mg/L至約10mg/L。
19.如權(quán)利要求18所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度選自由下述范圍組成的組約2mg/L至約4mg/L,約3mg/L至約5mg/L,約4mg/L至約6mg/L,約 5mg/L 至約 7mg/L,約 6mg/L 至約 8mg/L,約 7mg/L 至約 9mg/L,約 8mg/L 至約 10mg/L。
20.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含電子傳遞激活劑。
21.如權(quán)利要求20所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述電子傳遞激活劑選自由一定量的硒和一定量的亞硒酸組成的組。
22.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含一定量的HSA。
23.如權(quán)利要求22所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一定量的HSA在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為約100 μ g/mL至約350 μ g/mL。
24.如權(quán)利要求23所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述一定量的HSA包含一定量的重組HSA。
25.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含一種或多種抗氧化劑。
26.如權(quán)利要求25所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述抗氧化劑選自由α -生育酚乙酸酯和抗壞血酸-2-磷酸酯組成的組。
27.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含量為約O.OOlg/L至約O. 003g/L的5-羥色胺。
28.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含緩沖劑。
29.如權(quán)利要求25所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述緩沖劑包含量為約3. 2g/L至約4. 2g/L的碳酸氫鈉。
30.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含一定量的TGFB1，所述量的TGFBl對于從在所述化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞獲得軟骨細(xì)胞而言是足夠的。
31.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含一定量的BMP2，所述量的BMP2對于從在所述化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞獲得軟骨細(xì)胞而言是足夠的。
32.如權(quán)利要求1所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由以下a)至I)組成a)量為約O. 5L/L 的 MCDB201 ；b)量為約O. 5L/L 的 DMEM ； c)量為約3.7g/L的碳酸氫鈉； d)量為約O.25g/L的重組人血清白蛋白； e)量為約O.005g/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白； f)量為約O.005g/L的胰島素； g)量為約O.0000037g/L的亞硒酸； h)量為約O.032205g/L的抗壞血酸_2_磷酸酯； i)量為約O.002127g/L的5-羥色胺； j)量為約O. 000003925g/L的地塞米松； k)量為約O. OOlg/L的氫化可的松；和 I)量為約O. 0002g/L的α -生育酚乙酸酯。
33.如權(quán)利要求32所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑由以下a)至h)組成 a)量為約10ng/mL 的 PDGF-bb ； b)量為約10ng/mL 的 bFGF(155aa)； c)量為約20ng/mL 的 EGF ； d)量為約5ng/mL 的 IGFl ； e)量為約IOOnM的LPA； f)量為約150nM的SlP; g)量為約20ng/mL的WNT3A;和 h)量為約40ng/mL 的 RSPOl。
34.如權(quán)利要求33所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑還包含一定量的TGFBl。
35.如權(quán)利要求33所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑還包含一定量的BMP2。
36.一種制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法包括以下步驟 a)提供基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含血清；和 b)對所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充以使其進(jìn)一步包含 i)一種或多種細(xì)胞生長因子； ) 一種或多種磷脂生長因子；和 iii) 一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑。
37.如權(quán)利要求36所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其中，提供基礎(chǔ)培養(yǎng)基的所述步驟包括將一定量的DMEM和一定量的MCDB組合的步驟，其中DMEM與MCDB 之比為約 O. 75:1. 25v/v 至約1. 25:0. 75v/v。
38.如權(quán)利要求37所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其中，對所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充的所述步驟包括將以下a)至c)與所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合的步驟 a)選自由胰島素、bFGF、PDGF-bb,EGF, TGF-β I和IGF-1組成的組的一種或多種生長因子； b)選自由LPA和SlP組成的組的一種或多種脂質(zhì)生長因子；和 c)選自由人WNT3A蛋白和RSPOl組成的組的一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑。
39.如權(quán)利要求36所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混入選自由地塞米松和氫化可的松組成的組的一種或多種類固醇的步驟。
40.如權(quán)利要求39所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混入一定量的轉(zhuǎn)鐵蛋白的步驟。
41.如權(quán)利要求40所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混入一定量的亞硒酸的步驟。
42.如權(quán)利要求41所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混入一定量的5-羥色胺的步驟。
43.如權(quán)利要求42所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混入一定量的rHSA的步驟。
44.如權(quán)利要求43所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中混入一定量的選自由α -生育酚乙酸酯和抗壞血酸-2-磷酸酯組成的組的抗氧化劑的步驟。
45.如權(quán)利要求44所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括混入一定量的碳酸氫鈉的步驟。
46.如權(quán)利要求36所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括對所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充一定量的TGFBl的步驟。
47.如權(quán)利要求36所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法還包括對所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充一定量的ΒΜΡ2的步驟。
48.如權(quán)利要求36所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由以下a)至I)組成 a)量為約O. 5L/L 的 MCDB201 ； b)量為約O. 5L/L 的 DMEM ； c)量為約3.7g/L的碳酸氫鈉； d)量為約O.25g/L的重組人血清白蛋白； e)量為約O.005g/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白； f)量為約O.005g/L的胰島素； g)量為約O.0000037g/L的亞硒酸； h)量為約O.032205g/L的抗壞血酸_2_磷酸酯； i)量為約O.002127g/L的5-羥色胺； j)量為約O. 000003925g/L的地塞米松； k)量為約O. 001g/L的氫化可的松；和I)量為約O. 0002g/L的α -生育酚乙酸酯。
49.如權(quán)利要求48所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑由以下a)至h)組成 a)量為約10ng/mL 的 PDGF-bb ； b)量為約10ng/mL 的 bFGF155aa ； c)量為約20ng/mL 的 EGF ； d)量為約5ng/mL 的 IGFl ； e)量為約IOOnM的溶血磷脂酸； f)量為約150nM的鞘氨醇1-磷酸； g)量為約20ng/mL 的 WNT_3a ;和 h)量為約40ng/mT,的 RSpondin-1。
50.如權(quán)利要求44所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑還包含一定量的TGFBl。
51.如權(quán)利要求44所述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑還包含一定量的BMP。
52.一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括利用權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基離體擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞群的步驟。
53.如權(quán)利要求52所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括從選自由臍帶血、骨髓、臍帶基質(zhì)和脂肪組織組成的組的來源獲得所述間充質(zhì)干細(xì)胞群的步驟。
54.如權(quán)利要求52所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括獲得之前未暴露于血清的間充質(zhì)干細(xì)胞群以進(jìn)行離體擴(kuò)增的步驟。
55.如權(quán)利要求52所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括通過離體擴(kuò)增產(chǎn)生之前未暴露于血清的間充質(zhì)干細(xì)胞群的步驟。
56.如權(quán)利要求52或55中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括從所述間充質(zhì)干細(xì)胞群獲得軟骨細(xì)胞群的步驟。
57.如權(quán)利要求56所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括用一定量的TGFBl補(bǔ)充所述細(xì)胞培養(yǎng)基的步驟，并且其中所述一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑由人WNT3A組成。
58.如權(quán)利要求52或55中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括從所述間充質(zhì)干細(xì)胞群獲得骨細(xì)胞群的步驟。
59.如權(quán)利要求58所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括用一定量的BMP2補(bǔ)充所述細(xì)胞培養(yǎng)基的步驟，并且其中所述一種或多種WNT信號傳導(dǎo)途徑激活劑由人WNT-3a蛋白組成。
60.如權(quán)利要求52或55中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其還包括在未經(jīng)包被的培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增所述間充質(zhì)干細(xì)胞群的步驟。
61.一種治療方法，其包括以下步驟 a)獲得利用權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基離體擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞群；和 b)向個體施用治療有效量的所述間充質(zhì)干細(xì)胞群。
62.如權(quán)利要求61所述的治療方法，其中，獲得間充質(zhì)干細(xì)胞群的所述步驟包括獲得源自利用權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基離體擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞群的軟骨細(xì)胞群的步驟，并且其中向個體施用治療有效量的所述間充質(zhì)干細(xì)胞群的所述步驟包括向個體施用治療有效量的所述軟骨細(xì)胞群的步驟。
63.如權(quán)利要求62所述的治療方法，其中，所述治療有效量的所述軟骨細(xì)胞群包含足以重構(gòu)骨的量的所述軟骨細(xì)胞群。
64.如權(quán)利要求61所述的治療方法，其中，獲得間充質(zhì)干細(xì)胞群的所述步驟包括獲得源自利用權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基離體擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞群的骨細(xì)胞群的步驟，并且其中向個體施用治療有效量的所述間充質(zhì)干細(xì)胞群的所述步驟包括向個體施用治療有效量的所述骨細(xì)胞群的步驟。
65.如權(quán)利要求64所述的治療方法，其中，所述治療有效量的所述骨細(xì)胞群包含足以重構(gòu)軟骨組織的量的所述骨細(xì)胞群。
66.一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑盒，其包含權(quán)利要求1、32、33、34或35中任一項(xiàng)所述的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。
67.如權(quán)利要求1、32、33、34或35中任一項(xiàng)所述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，用于對人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行無血清細(xì)胞培養(yǎng)的方法中。
68.基本如本文中參考任何公開的實(shí)施方式所描述的權(quán)利要求1的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。
69.如本文中參考附圖所示的任何實(shí)施方式所描述的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。
70.基本如本文中參考任何公開的實(shí)施方式所描述的制備化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。
71.如本文中參考附圖所示的任何實(shí)施方式所描述的制備的化學(xué)成分確定的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。
72.基本如本文中參考任何公開的實(shí)施方式所描述的權(quán)利要求61的治療方法。
73.本文中所描述的或要求保護(hù)的任何發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)例如間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞的含有營養(yǎng)和生長因子且不含任何血清的化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)施方式，和利用所述細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)施方式來擴(kuò)增例如間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞群并同時保持多能表型的方法，以及通過在所述細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)施方式中混入分化因子從而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨發(fā)生和骨發(fā)生的方法。
文檔編號C12N5/00GK103068969SQ201180039771
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者安松柱, 朱亞楠 申請人:思迪公司