一種昆蟲細胞表達抗菌肽Cecropin DC1的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種昆蟲細胞表達抗菌膚Cecropin DC1的方 法。
【背景技術】
[0002] 抗菌膚是一類具有生物活性的小分子堿性多膚，具有殺菌力強、抗菌譜廣、穩(wěn)定性 好及不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，更為重要的是抗菌膚對真核細胞幾乎沒作用，僅作用于原核細 胞及發(fā)生病變的真核細胞。
[0003] 現(xiàn)有技術查閱發(fā)現(xiàn)中國專利ZL200510032743. 8公布了一種抗菌膚DC及其制備 方法與應用，根據(jù)天然抗菌膚的序列，設計、合成抗菌膚DC基因，選擇酵母偏愛的遺傳密碼 子，轉化穿梭質粒，轉入季也蒙念球菌中表達。但目的基因DC在季也蒙念球菌中的表達量 受到限制、質粒轉化體不穩(wěn)定，目的基因容易丟失等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是在于提供一種昆蟲細胞表達抗菌膚CecropinDC1的方法，利用基 因工程，構建含有抗菌膚CecropinDC1基因的重組病毒，并利用Sf21細胞作為宿主，表達 生產(chǎn)具有生物活性的重組抗菌膚CecropinDC1。
[0005] 本發(fā)明通過W下技術方案來實現(xiàn)： 1、一種昆蟲細胞表達抗菌膚CecropinDC1，通過點突變技術，將第38位賴氨酸的密碼 子AAG改為天冬酷胺的密碼子AAC。此處氨基酸密碼子的改變對表達產(chǎn)物的殺菌活性明顯 的提局。
[0006] 2、所述的昆蟲細胞表達CecropinDC1，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0007] 3、一種昆蟲細胞表達CecropinDC1的重組核巧酸序列，包含沈QIDNO:1所示的 核巧酸序列。
[0008] 4、一種昆蟲細胞表達抗菌膚CecropinDC1的方法，包括W下步驟： 1)構建包含SEQIDNO: 1所示核巧酸序列的重組桿狀病毒轉移載體。
[0009] 2)將構建好的重組轉移載體與首猜銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV- DNA共轉 染Sf21昆蟲細胞，按W下方式獲得表達抗菌膚Cecropin的重組病毒。
[0010] 在1. 5ml滅菌的化pendo計管中加入2嗦重組轉移載體DNA、10嗦AcNPV-DNA及 0. 8ml共轉染緩沖液，將該混合物在室溫下解育30min后共轉染對數(shù)期的Sf21昆蟲細胞； 然后將共轉染后的Sf21細胞先用無血清培養(yǎng)基Sf-900IISFM培養(yǎng)基清洗兩次，再用含有 10%FBS的完全培養(yǎng)基在27°C下培養(yǎng)4~6d，收集培養(yǎng)基上清作為病毒原液用來篩選重組病 毒，重組病毒經(jīng)過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌膚CecropinDCl基 因的重組病毒。
[0011] 3)重組病毒感染旺盛生長的Sf21細胞，27°C培養(yǎng)4~6d進行感染表達，之后通過 離屯、收集培養(yǎng)液。
[0012] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果是： 1、抗菌膚CecropinDC1是一個經(jīng)過修飾改進的基因。將第38位的賴氨酸改為天冬酷 胺，運種氨基酸密碼子的改變使其具有較高的殺菌效價，特別是對多種病原微生物有較好 的抑菌作用，如大腸桿菌、金黃葡萄球菌等。
[0013] 2、本發(fā)明解決了抗菌膚CecropinDC1在季也蒙念球菌表達中質粒轉化體不穩(wěn)定， 目的基因容易丟失和在哺乳動物細胞生產(chǎn)成本太高等缺點，獲得的Sf21細胞表達重組抗 菌膚CecropinDC1具有較高的生物活性，且大部分被分泌到培養(yǎng)基中，有利于蛋白的快速 提取純化。本發(fā)明的抗菌膚CecropinDC1可W大量生產(chǎn)，并且為抗菌膚CecropinDC1在 醫(yī)學、食品和化妝品上的應用開辟了廣闊的前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1是抗菌膚Cecropin DC1的PCR擴增產(chǎn)物； 1 :目的基因PCR產(chǎn)物，M:Marker。
[0015] 圖2是本發(fā)明抗菌膚Cecropin DC1抗菌活性定量測定； 1:抗菌膚Cecropin DC1發(fā)酵液，2:抗菌膚DC發(fā)酵液，3:無菌水。
[0016] 圖3是本發(fā)明抗菌膚抗菌膚Cecropin DC1抗菌活性定性測定； 邸一:無菌水，CK+:Amp，1 :抗菌膚DC，2 :抗菌膚CecropinDC1。
【具體實施方式】
[0017]W下結合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限 定。
[001引 實施例1 抗菌膚CecropinDC1基因的克隆 根據(jù)抗菌膚CecropinDC1基因改造和克隆的需要，利用Primerpremier5.0軟件設 計、合成引物： P1 :5,ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAA3,； P2: 5'GTTAGCCAAGGCAGTAGC3' 所述PCR擴增反應為：93°C預變性5min; 93°C變性30s;58°C退火60s;72°C延伸Imin;30個循環(huán)后，72°C延伸10min，4°C保溫。
[0019] 用1%瓊脂糖凝膠電泳對抗菌膚CecropinDC1基因進行PCR產(chǎn)物分析(結果如圖 1所示)泳道1與DNA分子量Marker(DL2000)相對比可W清楚的看到140左右的目的片 段，說明成功合成了抗菌膚CecropinDC1基因。膠回收試劑盒（GelExtractionKit,OMEGA 公司）回收純化目的基因。并將隨機選取的質粒送金唯智基因公司測序。
[0020] 實施例2 獲得重組病毒 將構建好的重組轉移載體與首猜銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21昆蟲細胞，按W下方式獲得表達抗菌膚Cecropin DC1的重組病毒。
[0021] 在1. 5ml滅菌的化pendo計管中加入2嗦重組轉移載體DNA、10嗦AcNPV-DNA及 0. 8ml共轉染緩沖液，將該混合物在室溫下培育30min后共轉染對數(shù)生長期的Sf21昆蟲細 胞；然后將共轉染后的Sf21細胞先用無血清培養(yǎng)基Sf-900 II SFM培養(yǎng)基（不含抗生素或 其它添加物)清洗兩次，再用含有10% FCS的新鮮培養(yǎng)基在27°C下培養(yǎng)4~6d，收集培養(yǎng)基上 清作為病毒原液用來篩選重組病毒，重組病毒經(jīng)過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命 名為含有抗菌膚Cecropin DC1基因的重組病毒。
[00過實施例3 重組桿狀病毒的提取 1)取1.5 ml離屯、管，加入20W的Proteinase K溶液。
[0023] 2)向離屯、管中加入200W血清或血漿，然后再加入200WBufferGB，滿旋震蕩 15seco
[0024] 3) 5