一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCC2的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCC2的方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]ABCC2是ABC七大家族轉(zhuǎn)運(yùn)體中C族的蛋白成員之一，在人的正常細(xì)胞和腫瘤組織中均有表達(dá)，如小腸上皮頂膜、胎盤合胞體滋養(yǎng)層、腸小管膜、大腦微血管皮細(xì)胞、乳腺小葉、和乳腺癌細(xì)胞等。ABC蛋白的主要功能是小分子物質(zhì)及多肽分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)會(huì)通過改變形態(tài)允許某些分子通過。免疫組化顯示ABCC2主要在細(xì)胞膜和胞漿中表達(dá)，不僅具有吸收、分泌和排泄功能，而且具有抑制消化道吸收某些外源性物質(zhì)，參與形成血腦、胎血屏障等生理功能；同時(shí)ABCC2是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，需要結(jié)合水解胞漿中的ATP，以此確保轉(zhuǎn)運(yùn)底物所需的足夠能量，該蛋白及轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)的這些特殊反應(yīng)能夠使轉(zhuǎn)運(yùn)子與底物像齒輪一樣吻合并通過水解ATP來轉(zhuǎn)運(yùn)底物。此外，ABCC2也是與腫瘤多藥耐藥有關(guān)的新的藥物排出泵，是腫瘤多藥耐藥的重要機(jī)制之一。因此，對(duì)ABCC2的抑制劑或底物的研究具有重要意義。目前尚未有在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)hABCC2的相關(guān)方法報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提出一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCC2的方法，通過該方法制得的hABCC2可用于hABCC2底物或抑制劑的檢測(cè)。本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn):
一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)人hABCC2的方法，包括如下步驟:
步驟一，人工合成兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的hABCC2基因；
步驟二，將hABCC2基因克隆入pFastBacl載體的BamHI/Hindlll位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pFastBacl_hABCC2 ；
步驟三，將重組質(zhì)粒pFastBacl-hABCC2轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組，獲得插入hABCC2基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCC2 ；
步驟四，脂質(zhì)體介導(dǎo)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCC2轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲高滴度的hABCC2的重組病毒；
步驟五，hABCC2的重組病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞，大量表達(dá)hABCC2蛋白。
[0004]本發(fā)明進(jìn)一步地，步驟一所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的人hABCC2基因通過如下方法獲得:根據(jù)NCBI參考序列信息NM_000392.3，在5 ‘端添加BamHI酶切位點(diǎn)序列，在3’端添加HindIII酶切位點(diǎn)序列，序列總長度為4850bp。
[0005]本發(fā)明進(jìn)一步地，還包含對(duì)所述重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCC2的PCR鑒定方法，步驟如下:分別以 T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T-pFast R: (SEQ ID N0.2)、T-hABCC2 F: (SEQ ID N0.3)和 T_hABCC2 R: (SEQ ID N0.4)、或 \ 和 T-pFast F: (SEQ IDN0.1 )和 T-hABCC2 R: (SEQ ID N0.4)為引物組合對(duì) SF9_hABCC2 基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的5166bp、418bp、873bp目標(biāo)片段，即為hABCC2基因在SF9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)完成。
[0006]本發(fā)明進(jìn)一步地，還包括重組hABCC2蛋白功能的鑒定方法，步驟如下:將ABCC2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物加入表達(dá)ABCC2蛋白的細(xì)胞膜中，參與ATP/AMP反應(yīng)，反應(yīng)終止后將細(xì)胞膜中微囊泡外的轉(zhuǎn)運(yùn)底物洗去，通過液質(zhì)聯(lián)用、熒光測(cè)定法或同位素標(biāo)記底物法中的一種來測(cè)定微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度，從而判定ABCC2蛋白的活性。
[0007]本發(fā)明進(jìn)一步地，所述微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度越大，ABCC2的活性越高。
[0008]本發(fā)明進(jìn)一步地，所述的重組病毒培養(yǎng)基為無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0009]本發(fā)明的應(yīng)用和實(shí)施使其顯著技術(shù)效果為:
①參照序列合成了hABCC2基因，進(jìn)而將其克隆入pFastBacl載體，并進(jìn)一步獲得含hABCC2基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCC2，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了 hABCC2基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)，為hABCC2的大量獲得提供一條新途徑，為人ABCC2蛋白的應(yīng)用開發(fā)打下工作基礎(chǔ)；
②通過本發(fā)明方法可獲得高滴度的重組的桿狀病毒，進(jìn)而直接感染昆蟲細(xì)胞，有利于大規(guī)模生產(chǎn)其外源蛋白；
③利用本發(fā)明方法制得的重組人hABCC2蛋白制作成藥物體外測(cè)試試劑盒，可實(shí)現(xiàn)hABCC2蛋白底物或抑制劑藥物體外吸收測(cè)試的全自動(dòng)高通量篩選，與現(xiàn)有體外細(xì)胞ABCC2模型測(cè)試方法相比，靈活性更高、重復(fù)性更好。
[0010]以下便結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。
【具體實(shí)施方式】
[0011 ] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0012]一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)人hABCC2的方法，包括如下步驟:
步驟一，人工合成兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的hABCC2基因。
[0013]步驟二，將hABCC2基因克隆入pFastBacl載體的BamHI/Hindlll位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pFastBacl-hABCC2 ;所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的人hABCC2基因通過如下方法獲得:根據(jù)NCBI參考序列信息NM_000392.3，在5 ‘端添加BamHI酶切位點(diǎn)序列，在3’端添加HindIII酶切位點(diǎn)序列，序列總長度為4850bp，可將該序列信息發(fā)送至基因合成公司進(jìn)行人工合成基因。
[0014]步驟三，將重組質(zhì)粒pFastBacl_hABCC2轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組，獲得插入hABCC2基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCC2 ;該重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid_hABCC2的鑒定方法包括但不限于PCR鑒定，具體步驟詳述如下:
分別以 T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T-pFast R: (SEQ ID N0.2)、T_hABCC2 F: (SEQID N0.3)和 T-hABCC2 R: (SEQ ID N0.4)、或 \ 和 T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T_hABCC2R: (SEQ ID N0.4)為引物組合對(duì)SF9-hABCC2基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的5166bp、418bp、873bp目標(biāo)片段，即為hABCC2基因在SF9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)完成。
[0015]所述的重組病毒培養(yǎng)基為無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0016]步驟四，脂質(zhì)體介導(dǎo)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid_hABCC2轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲高滴度的hABCC2的重組病毒；
步驟五，hABCC2的重組病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞，大量表達(dá)hABCC2蛋白。
[0017]本發(fā)明具體實(shí)施例的，還包括重組hABCC2蛋白功能的鑒定方法，步驟如下:將ABCC2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物加入表達(dá)ABCC2蛋白的細(xì)胞膜中，加入ATP/AMP反應(yīng)，反應(yīng)終止后將細(xì)胞膜中微囊泡外面的轉(zhuǎn)運(yùn)底物洗去，細(xì)胞微囊泡是各類細(xì)胞遭受一系列應(yīng)激(激活或凋亡)時(shí)，從細(xì)胞質(zhì)膜上脫落而釋放的膜性小囊泡，可通過液質(zhì)聯(lián)用、熒光測(cè)定法或同位素標(biāo)記底物法中的一種來測(cè)定微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度，從而判定ABCC2蛋白的活性，所述微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度越大，ABCC2的活性越高。
[0018]本發(fā)明方法參照序列合成了 hABCC2基因，進(jìn)而將其克隆入pFastBacl載體，并進(jìn)一步獲得含MBCC2基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCC2，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了 hABCC2基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)，為hABCC2的大量獲得提供一條新途徑，為人ABCC2蛋白的應(yīng)用開發(fā)打下工作基礎(chǔ)；通過本發(fā)明方法可獲得高滴度的重組的桿狀病毒，進(jìn)而直接感染昆蟲細(xì)胞，有利于大規(guī)模生產(chǎn)其外源蛋白；利用本發(fā)明方法制得的重組人hABCC2蛋白制作成藥物體外測(cè)試試劑盒，可實(shí)現(xiàn)hABCC2蛋白底物或抑制劑藥物體外吸收測(cè)試的全自動(dòng)高通量篩選，與現(xiàn)有體外細(xì)胞ABCC2模型測(cè)試方法相比，靈活性更高、重復(fù)性更好。
[0019]【實(shí)施例1】pFastBacl_hABCC2表達(dá)載體的構(gòu)建
(I)獲得兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的hABCC2基因:
根據(jù)NCBI參考序列信息NM_000392.3，選定其中長度為4838bp的序列為目標(biāo)序列，在目標(biāo)序列的5 ‘端添加BamHI酶切位點(diǎn)序列和在3’端添加HindIII酶切位點(diǎn)序列，序列總長度為4850bp，序列詳細(xì)信息可見附表中的(SEQ ID N0.5)，把該序列信息發(fā)送至基因合成公司進(jìn)行人工合成基因(蘇州金唯智生物科技有限公司)。
[0020](SEQ ID N0.5): BamHI 酶切位點(diǎn)序列 GGATCCX NM_000392.3 堿基序列4838bp>AAGCTT HindIII 酶切位點(diǎn)序列。
[0021](2)hABCC2 基因克隆入 pFastBacl 載體:
利用BamHI和HindIII核酸內(nèi)切酶(New England B1labs Inc.)分別對(duì)步驟(I)得到的hABCC2基因和pFastBacl載體(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)進(jìn)行雙酶切，獲得hABCC2基因目的片段和pFastBacl載體線性片段,用DNA連接酶(New England B1labs Inc.)處理連接兩片段，得到連接產(chǎn)物。
[0022](3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒鑒定:
將步驟(2)得到的連接產(chǎn)物ΙΟμΙ加入200μ1感受態(tài)DH5a大腸桿菌(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)中，輕搖混勻，置冰上30分鐘；42°C熱處理90秒，迅速置冰上5分鐘；加入800μ? 37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)液，置于37°C，220rpm振搖I小時(shí)；500rpm離心后全部涂布于含lOOPg/mL氨芐西林的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取單獨(dú)菌落接種含lOOPg/mL氨芐西林的LB培養(yǎng)基37 °C過夜振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定。
[0023]分別以T-pFast F (SEQ ID N0.1)和 T-pFast R (SEQ ID N0.2) ;T_hABCC2 F (SEQID N0.3)和 T-hABCC2 R(SEQ ID N0.4) ；T-pFast F (SEQ ID N0.1)和 T_hABCC2 R(SEQ IDN0.4)為引物組合對(duì)提取的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的5166bp、418bp、873bp目標(biāo)片段的即為真正含有整合了目的基因的重組表達(dá)載體PFastBacl-hABCC2。引物設(shè)計(jì)如下:
(SEQ ID N0.1):名稱:T-pFast F，序列:GATAACCATCTCGCAAATAA ；
(SEQ ID N0.2):名稱:T-pFast R，序列:AATGCAGTGAAAAAAATGCT ；
(SEQ ID N0.3):名稱:T-hABCC2 F，序列:AGAGCTGGCCCTTGTACTCA ；
(SEQ ID N0.4):名稱:T-hABCC2 R，序列:AGGACGCTTGTAGCCTTTCA。
[0024]【實(shí)施例2】重組桿狀病毒的獲得
將pFastBacl-hABCC2重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(?緩窗基Π海)貿(mào)易有限公司)(其中含有一個(gè)桿狀病毒穿梭載體簡稱Bacmid，以及一個(gè)輔助質(zhì)粒)，以獲得插入hABCC2基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCC2。
[0025](I)重組pFastBacl_hABCC2轉(zhuǎn)化進(jìn)入DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)座): ①取Iug重組表達(dá)載體pFastBacl-hABC