專利名稱：治療膽管癌的藥物組合物、抑制膽管癌生長或侵入的方法和治療膽管癌的方法
技術領域：
0001本發(fā)明涉及抑制膽管癌的生長或轉移的藥物組合物，其包括抑制L1CAM 活性或表達的物質——這種物質是存在于膽管癌細胞表面的蛋白，以及使用該組合物 的治療方法。
0002
背景技術：
0003膽管癌是膽管的癌癥，膽管將膽汁從肝臟排至小腸。最近的證據己表明 肝癌可起因自多能肝臟干細胞(Sell和Dunsford Am J. Pathol. 134:1347-1363， 1989)。 膽管癌全世界發(fā)生的發(fā)病率遠遠低于肝癌，其在東南亞的發(fā)生遠遠高于歐洲或北美。 膽管癌不能通過手術切除來有效治療，原因在于它的高返回率(return rate)。普通 的化學療法和放射療法也不可用于膽管癌的治療(Pederson等，Cancer Res. 4325-4332， 1997)。另外，膽管癌難于診斷，并且已觀察到由于細菌或寄生蟲的感染進入膽管引 起的慢性炎癥有發(fā)展成膽管癌的傾向(Roberts等，Gastroenterology 112:269-279, 1997)。
0004盡管有大量的研究結果，但是膽管癌的發(fā)病機理仍然未知。用于治療膽 管癌的靶向分子也了解甚少。作為某些細胞遺傳研究的結果，僅建立了幾個細胞系 (Y咖aguchi等，J. Nat'l Cancer Inst 75: 29-35,1985; Ding等，Br J Caner 67: 1007-1010，
1993) 。但是，沒有使用這些細胞系制備膽管癌特異性抗體的方法的報道。0005最近，從患有膽管癌的韓國患者建立了膽管癌細胞系Choi-CK和SCK
(Kim等，Genes， chromosome & Cancer, 30:48-56, 2001)。如果從用膽管癌細胞系注 射小鼠來制備對細胞表面特異的單克隆抗體，那么它們可應用于膽管癌治療。
0006表皮生長因子受體(EGFR)——已知為預后因子(prognostic factor) ——的基因是原癌基因。EGFR涉及腫瘤發(fā)生和攻擊生長行為。EGFR在各種癌癥中 過量表達，包括乳腺癌、肺癌、直腸癌、腎癌、膽囊癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、 癌性宮頸腫瘤和胃癌(Modjtahedi, H.和Dean, C., The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in Cancer. Int. J. Oncol. 4: 277-296，
1994) 。另外，EGFR的表達與癌癥預后的相關性在一種癌癥和另一種癌癥之間有所不同(Nicholson, R工等EGFR and Cancer prognosis. Eur. J. Cancer 37， S9-S15,2001)。 例如，EGFR可用作膀胱癌、癌性宮頸腫瘤、食道癌、頭頸癌癥和卵巢癌的強預后因 子，但被識別為非小細胞肺癌(NSCLC)的弱預后指示物。但是，還不知道關于膽 管癌預后因子的信息。
0007當針對EGFR的抗體應用于癌癥治療時，發(fā)現它們對癌細胞生長的抑制 活性對每種癌癥類型的功效在15-50%范圍內變化。而且，即使在相同癌癥類型中， 體外和體內生長抑制作用之間存在差別(Dassonville， O.等，EGFR targeting therapies: monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors similarities and differences. Critical Reviews in Oncology/Hematology 62， 53-61， 2007)。目前，針對EGFR的抗體 用于直腸癌和頭頸癌的治療劑，但不應用于上述所有EGFR過量表達的示例性癌性疾 病的治療。
0008如上所述，在癌細胞中表達不能簡單地保證蛋白是該癌癥的預后因子。 而且，蛋白在癌細胞中表達是否與癌癥預后相關取決于癌癥類型。癌癥的強和弱預后 因子不但可用于容易地預測治療劑對癌癥的治療和預后效果，而且可用于發(fā)展預后因 子-靶向治療劑，其可選擇性地和有效地應用于感興趣的癌癥。因此，這種對癌癥特 異性的預后因子的發(fā)現在癌癥的診斷和治療中十分重要。
0009
0010LI細胞粘附分子(LICAM)——一種220kDa的整合膜糖蛋白——是 細胞粘附分子(CAMs)免疫球蛋白超家族的成員，其介導細胞表面上的細胞與細胞 粘附。LICAM——最初在神經元中鑒定(Bateman等，EMBO J. 15:6050-6059; 1996) ——在神經遷移、神經突起和細胞遷移中發(fā)揮關鍵作用。使用源自小鼠和大鼠的 LICAM同源物的簡并寡核苷酸作為探針，從人胚胎腦cDNA文庫分離人LICAM基 因(Hlavin， M, L.和Lemmon， V. Genomics 11: 416-423,1991; 1999年2月16円公布 的美國專利號5,872,225) 。 LICAM主要在腦中表達，還可在某些JH常組織中檢測到 它的表達，并且最近在幾種癌癥中檢測到它的表達。
0011
0012LICAM和癌癥之間似乎存在聯系。已報道LICAM在許多腫瘤細胞類 型中表達，包括黑色素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌和直腸癌(Takeda等,J.Neurochem. 66:2338-2349， 1996; Thies等，Eur. J, Cancer, 38:1708-1716, 2002: Arlt等，Cancer Res. 66:936-943,2006; Gavert等，J. Cell Biol. 168:633-642， 2005)。己發(fā)現LICAM不但以 膜結合形式，而且還作為切割產物被分泌到細胞外基質(Gutwein等，FASEP J. 17 (2) :292-4,2003)。最近，已經顯示LICAM是在腫瘤細胞生長中發(fā)揮重要作用的 分子(Primiano等，Cancer Cell. 4 (1) :41-53 2003)并且正開始作為一種癌癥治療的 新靶標(2004年6月17日提交的US2004/0115206 Al)。最近的研究還顯示LICAM 在人結腸癌癥組織的侵入前端表達(Gavert等，J Cell Biol. 14;168 (4) :633-42.2005)和抗L1CAM抗體發(fā)揮抑制卵巢癌細胞生長和轉移的功能(Arit等，Cancer Res. 66:936-943.2006)。
0013以前的報道沒有提到L1CAM在膽管癌細胞中的表達。此外，還沒有 L1CAM是否涉及膽管癌的生長和轉移的任何信息。而且，根本沒有公開關于當 L1CAM在癌細胞中以較髙水平表達時，膽管癌患者是否顯示較高死亡率的數據，即 L1CAM是否是膽管癌的不良預后因子。因此，在本發(fā)明之前，針對L1CAM的抗體 通過抑制膽管癌的增殖和轉移作為治療藥物的潛能也是未知。
0014
0015EP 1,172,654 Al和美國專利公開號2004/0259084公開了用于卵巢或子 宮內膜腫瘤的診斷和預后的方法，該方法的特征在于測定患者樣品中L1CAM的水 平，基于L1CAM的存在表明卵巢或子宮內膜腫瘤的存在或是這種腫瘤的素因；以及 在需要這種治療的患者中治療卵巢或子宮內膜腫瘤的方法，其包括施用給患者足夠量 的L1CAM抗體或其偶聯至細胞毒性藥物的片段。如這些專利所公開的，L1CAM蛋 白僅描述為卵巢或子宮內膜腫瘤的特異性標志。
0016
0017美國專利公開號2004/0115206公開了在腫瘤細胞中使用特異性結合 L1CAM的抗體誘導細胞死亡的方法和試劑，以及包括L1CAM抗體的藥物組合物。 該方法的特征為以足夠在腫瘤細胞中抑制細胞生長或誘導細胞死亡的時間和濃度，用 有效量的抗L1CAM抗體接觸腫瘤細胞。提及乳腺癌、結腸癌和宮頸癌細胞作為表達 L1CAM腫瘤細胞的例子，該專利公開僅提供體外測試結果，但沒有體內數據支持。 文中沒有說明L1CAM和膽管癌之間的關系。此外，該專利公開僅顯示腫瘤細胞接觸 抗L1CAM抗體用以抑制細胞生長和誘導細胞死亡，而沒有任何暗示抗L1CAM抗 體能夠抑制腫瘤細胞的遷移、侵入和轉移。
0018國際專利申請?zhí)朠CT/EP2005/008148公開了在卵巢和子宮內膜癌中過量 表達的LICAM蛋白、干擾L1CAM表達的藥物組合物和使用該組合物預防和治療卵 巢和子宮內膜癌的方法。所述藥物組合物，其包括抗L1CAM抗體或其衍生物，被 描述為能夠通過抑制癌細胞的遷移和生長治療卵巢和子宮內膜癌。該專利申請也僅提 及卵巢和子宮內膜癌，在其中LICAM以細胞結合形式或可溶形式發(fā)揮功能來促進癌 細胞的遷移。
0019簡言之，先于本發(fā)明的文獻沒有公開L1CAM在膽管癌中以高水平表達， 并且因此可用作膽管癌特異的不良預后因子，以及L1CAM抑制物——例如L1CAM 的抗體——因此可用于膽管癌的診斷和治療。0020
公開內容 技術問題0021本發(fā)明人對用于癌癥診斷和治療的抗體的發(fā)展進行了深入透徹的研究。 用最近建立的膽管癌細胞系免疫小鼠(Kim等，Genes， Chromosomes & Cancer 30:48-56,2001)，從而獲得特異性結合膽管癌細胞表面的L1CAM的單克隆抗體。所 獲得的單克隆抗體命名為"A10-A3",并且發(fā)現該抗體特異性識別L1CAM。
0022而且，用A10-A3抗體和已知的抗L1CAM抗體分析，發(fā)現L1CAM在 膽管癌細胞表面表達，而不在正常細胞——例如外周淋巴細胞、肝細胞、血管內皮細 胞等——的表面表達。已知L1CAM在乳腺癌、卵巢癌、直腸癌、皮膚癌等中表達， 但在膽管癌的表達仍然未知。使用AI0-A3抗體，由本發(fā)明人進行的實驗顯示L1CAM 在42個肝內膽管癌患者的45.2%和103個肝外膽管癌患者的39.8%中過量表達，特 別是在侵入前端，其說明膽管癌的轉移起始。而且，L1CAM表達率和存活率之間的 相關性的統(tǒng)計分析顯示具有髙L1CAM表達率的膽管癌患者的死亡率遠遠高于具有 低L1CAM表達率的膽管癌患的死亡率。證明L1CAM是膽管癌的不良預后因子，該 結果顯示L1CAM可以是膽管癌治療的重要靶標。
0023
0024雖然EGFR在膽管癌中高水平表達，但是相反，EGFR其用作當前 臨床用于結腸癌治療的治療劑的靶標(例如cetuximab， EGFR的嵌合抗體)——證 叨不是膽管癌的不良預后因子，原因是在EGFR表達率和存活率之間的相關性分析中 未發(fā)現統(tǒng)計學顯著性。因此，EFGR不被識別為膽管癌的不良預后因子。因此，不是 所有在癌癥中過量表達的分子都可用作其治療的重要靶標。
0025
0026當通過將針對L1CAM的siRNA引入至表達L1CAM的膽管癌細胞系 (Choi-CK， SCK)來阻抑L1CAM表達時，發(fā)現它的生長、遷移和侵入被阻抑。這 些結果顯示L1CAM在膽管癌的生長和轉移中發(fā)揮重要作用。
0027如通過用A10-A3抗體或已知的抗L1CAM抗體(UJ127)治療膽管癌 細胞系(Choi-CK，SCK)所分析，發(fā)現L1CAM的抗體具有針對膽管癌細胞生長、遷 移或侵入的抑制活性。另外，在移植膽管癌細胞系的裸鼠中，注射A10-A3抗體抑制 膽管癌細胞的生長。此外，由獲自用人胚胎干細胞免疫的小鼠的雜交瘤(KCTC 10966BP)產生的單克隆抗體4-63識別癌細胞表面的L1CAM,并且抑制膽管癌的生 長。因此，引導本發(fā)明的，由本發(fā)明人進行的深入而廣泛的研究己得出抗L1CAM抗 體可用于膽管癌診斷和治療的結論。
0028
技術方案
0029因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于抑制膽管癌的生長和轉移的藥物組 合物，其包括抑制L1CAM活性或阻抑L1CAM表達的物質。
0030本發(fā)明的另 一個目標是提供基于藥物組合物的使用治療膽管癌的方法。
0031本發(fā)明進一步的目的是提供抑制L1CAM活性的抗L1CAM抗體。0032本發(fā)明更進一步的目的是提供抑制L1CAM表達的寡核苷酸。0033本發(fā)明還有的另一個目的是提供基于藥物組合物的使用抑制膽管癌細胞 增殖或轉移的方法。0034
附圖描述
0035
圖1顯示了小鼠單克隆抗體A10-A3 (A)和4-63 (B)以及已知抗體 5G3 (C)和UJ127 (D)與包括膽管癌的各種癌細胞系和正常細胞的細胞表面結合能 力的熒光細胞染色和流式細胞術結果。
0036圖2顯示了免疫沉淀和蛋白質印跡的結果，表明A10-A3特異性地結合 L1CAM。 A: Choi-CK膽管癌的細胞表面被生物素化，并用A10-A3抗體或已知的抗 L1CAM單克隆抗體(UJ127)進行免疫沉淀。被沉淀的蛋白用于10。/。SDS-PAGE和 用鏈酶抗生物素-HRP的蛋白質印跡。通過蛋白質印跡檢測L1CAM。B:用A10-A3抗 體免疫沉淀蛋白，在10。/。SDS-PAGE上分離并使用已知的抗L1CAM抗體(UJ127) 進行蛋白質印跡。通過蛋白質印跡檢測L1CAM。作為陰性對照"預清除"表示不存在 抗體的情況下進行的免疫沉淀(IP)，"用A10-A3的IP"表示使用A10-A3抗體進行 的IP，"用抗-LlCAM的IP"表示使用已知的抗L1CAM單克隆抗體進行的IP以及"僅 A10-A3"表示只有抗體的SDS-PAGE。 C:表達可溶性Ll的HEK293T細胞用于使用 已知的抗體UJ127和5G3，以及A10-A3和4-63抗體進行的蛋白質印跡。"-"表示不 攜帶L1表達載體的細胞培養(yǎng)上清液，以及"+"表示含有可溶性Ll表達載體的細胞培 養(yǎng)上清液。
0037圖3顯示了 Q-TOF分析的結果。來自Choi-CK細胞的蛋白使用A10-A3 抗體進行免疫沉淀，在SDS-PAGE上分離，并且用胰蛋白酶消化。使用Q-TOF分析 所獲得的肽,其顯示免疫沉淀的蛋白是L1CAM。下面的氨基酸序列代表全長L1CAM, 上面的氨基酸序列代表所分析的肽的序列，與全長L1CAM序列的下劃線部分一致。
0038圖4顯示了使用A10-A3 (A和C)以及4-63 (B)抗體對來自癌癥患 者的癌組織免疫組織化學染色的結果。發(fā)現抗體結合人膽管癌組織，但不結合正常肝 組織。
0039圖5提供了表格，其中概括了肝內膽管癌(A)和肝外膽管癌(B)中 L1CAM的表達與臨床病理性質之間的相關性。
0040圖6提供顯示L1CAM表達率與肝外膽管癌患者(60例)存活率之間 相關性的圖，其表示為OS (總存活，overall survival)和DFS (無病存活，disease free survival)。
0041圖7顯示用針對L1CAM的siRNA和非特異的siRNA轉染的膽管癌細 胞中L1CAM的表達水平(A)以及被轉染的細胞增殖、侵入和遷移程度(B)。0042圖8顯示抗L1CAM抗體A10-A3 (A) 、 4-63 (B)以及UJ127和5G3 (C)對膽管癌細胞系Choi-CK和SCK生長的抑制作用。卵巢癌細胞系SK-0V3 和A10-A3抗體不結合的腎癌細胞系ACHN分別用作陽性細胞對照和陰性細胞對照。 對于陰性抗體對照，不用抗體(對照)處理、用熱滅活抗體(煮沸的A10-A3b或4-63b) 或正常小鼠IgG進行處理。細胞生長程度表示為在用10 jig/ml的抗體溫育細胞72小 時后，相對于不含有任何抗體的對照的百分比。
0043圖9顯示抗L1CAM抗體A10-A3、4-63和5G3對膽管癌細胞(Choi-CK， SCK)侵入和遷移的抑制作用。A10-A3抗體不結合的腎癌細胞系被用作陰性細胞對 照，而對于陰性抗體對照，不用抗體(對照)處理、用熱滅活抗體(煮沸的A10-A3b 或4-63b)或正常小鼠IgG進行處理。細胞生長程度表示為在用10pg/ml的抗體溫宵 細胞72小時后，相對于不含有任何抗體的對照的百分比。
0044圖IO顯示A10-A3抗體抑制涉及癌細胞生長、遷移和存活的信號轉導。 用A10-A3抗體或小鼠IgG處理膽管癌細胞系Choi-CK或SCK,或不用任何抗體處 理，然后收集。細胞裂解物使用針對PCNA (A)、磷酸-MAPK (A)、磷酸-AKT (B)和磷酸-FAK (C)的抗體進行蛋白質印跡?？?P-肌動蛋白抗體用于檢測作為加 樣對照的P-肌動蛋白。
0045圖11顯示A10-A3抗體對人膽管癌異種移植小鼠模型中癌癥生長的抑 制作用。圖A顯示在5只施用抗體(A10-A3組)的小鼠和5只未施用抗體(對照) 的小鼠中，腫瘤體積隨時間的變化。圖11B顯示癌細胞移植三周后的腫瘤重量。圖 C以圖片顯示癌癥組織。圖D是監(jiān)測小鼠體重一段時間的圖。
0046
最佳實施方式
0047
一方面，本發(fā)明涉及抑制膽管癌生長或轉移的藥物組合物，其包括抑制 L1CAM活性或阻抑L1CAM表達的物質。
0048在其中的一個實施方式中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括抑制L1CAM 活性的物質。優(yōu)選地，所述抑制活性的物質是特異性地識別膽管癌細胞表面抗原或分 泌的表面抗原(L1CAM)的抗體。所述抗體包括所有單克隆抗體和其嵌合抗體、人 源化抗體和人抗體。新的抗體，以及本領域已知的抗體，落入本發(fā)明的范圍內。優(yōu)選 的是新的抗L1CAM單克隆抗體A10-A3或4-63,已知的抗L1CAM單克隆抗體UJ127 或其嵌合、人源化或人抗體。A10-A3和4-63抗體分別由具有KCTC登錄號KCTC 10卯9BP和KCTC 10966BP的雜交瘤分泌。
0049只要它們具有L1CAM的結合特異性，所述抗體包括具有兩條全長輕鏈 和兩條全長重鏈的完整形式，或可以是抗體分子的功能片段的形式。如本文所用，術 語"抗體分子的功能片段"的意圖是指至少保留抗原結合功能的片段，其示例性的為 Fab、 F(ab)、 F(ab')2和Fv。0050在這一方面的另一個實施方式中，根據本發(fā)明，藥物組合物可包括阻抑 L1CAM表達的物質。當它在表達L1CAM的腫瘤細胞中的表達水平被L1CAM表達 抑制物阻抑時，腫瘤細胞的生長和轉移降低，其因此可應用于這些癌癥的治療。優(yōu)選 地，L1CAM表達抑制物選自siRNAs、 shRNAs和反義寡核苷酸，并且優(yōu)選地是含 有5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3'或5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGG也dt-3'序列的 siRNA。
0051如本文所用，術語"siRNA"的意圖是指約20個核苷酸的小核酸分子， 其介導RNA干涉或基因沉默。術語"shRNA"是指短發(fā)夾RNA,其中siRNA耙向序 列的正義和反義序列被5至9個堿基的環(huán)狀結構分隔開。最近，已研究RNA干涉
(RNAi)現象以應用于在基因水平控制蛋白表達的方法。典型地，已顯示siRNA通 過特異性結合mRNA來抑制蛋白表達，所述mRNA具有與耙向基因互補的序列。
0052siRNA，其包含在根據本發(fā)明的組合物中，可用直接化學合成(Sui G 等，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520)或體外轉錄(Brummelkamp TR等,
(2002) Science 296:550-553)制備，但本發(fā)明不限于這些方法。而且，shRNAs被設 計以克服siRNAs的缺點，其包括昂貴的siRNA生物合成和低轉染效率，導致RNA 干涉作用的短期持續(xù)，shRNAs可由包含在腺病毒、慢病毒或質粒表達載體系統(tǒng)中的 基于RNA聚合酶III的啟動子來表達，所述系統(tǒng)已被引入細胞。使用細胞中的siRNA 加工酶(Dicer或RNase III) ， shRNA分子被加工成功能siRNA分子，并隨后誘導 耙向基因的沉默。
0053如本文所用，術語"反義"意圖指具有核苷酸堿基序列和亞基-至-亞基骨 架的寡聚體，其使反義寡聚體與RNA中的目標序列通過Watson-Crick堿基配對而雜 交，以在目標序列內形成RNA:寡聚體異源雙鏈體，通常是與mRNA。寡聚體可與 目標序列具有精確的序列互補性或與其接近的互補性。這些反義寡聚體可阻斷或抑制
mRNA的翻譯，和/或修飾mRNA加工以產生該mRNA的剪接變體。因此，本發(fā)明 的反義寡聚體是與L1CAM基因的mRNA互補的反義寡聚體。
0054優(yōu)選地，根據本發(fā)明的組合物可包括已知的治療劑，其直接地或間接地 與抗體偶聯或以非偶聯形式存在。能夠結合抗體的治療劑包括但不限于放射性核素、 藥物、淋巴因子、毒素和雙特異性抗體。只要當偶聯至抗體或與siRNA、 shRNA或 反義寡核苷酸組合施用時，它可對癌癥發(fā)揮治療效果，那么任何已知的治療劑都可用 于本發(fā)明。
0055放射性核素的實施例包括但不限于3H、 "C、 32P、 35S、 36C1、 51Cr、 57Co、 58Co、外Fe、卯Y、 1251、出I和"6Re。
0056可用于本發(fā)明的藥物和毒素包括表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩 糖苷、阿霉素、柔紅霉素、洋紅霉素、氨喋呤、更生霉素、絲裂霉素、順鉑以及順鉑 的類似物、博來霉素、埃斯波霉素、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、氮芥、但不限于此。
90057優(yōu)選地,根據本發(fā)明的組合物可包括適合于其給藥方式的可接受的載體。0058適合于給藥方式的配方是本領域己知的。而且，本發(fā)明的藥物組合物可
以以用于癌癥治療的藥學上有效的量施用。通常的劑量可使用標準臨床技術來最優(yōu)化。
0059根據其另一方面，本發(fā)明涉及基于藥物組合物的使用來治療膽管癌的方法。
0060更詳細地，該方法包括將藥學上有效量的藥物組合物施用給機體。藥物 組合物可腸胃外、皮下、肺內或鼻內施用。對于局部免疫阻抑治療，如果期望，組合 物可使用合適的方法施用，包括病灶內施用。腸胃外注射包括肌肉內、靜脈內、動脈 內、腹膜內和皮下途徑。優(yōu)選的給藥方式包括靜脈內、皮下、皮內、肌肉內和滴注。
0061可通過將本發(fā)明藥物組合物施用給機體來治療膽管癌，其中組合物中含 有的L1CAM特異性抗體結合癌細胞表面抗原L1CAM，從而抑制膽管癌細胞的增殖 或轉移。
0062而且，可通過將本發(fā)明藥物組合物施用給機體以使抗體能夠結合分泌的 L1CAM來治療膽管癌，其誘導癌細胞生長和轉移的阻斷?？蛇x地，當被注射時，抗 體結合癌細胞表面抗原L1CAM，以使免疫細胞識別這種結合，從而導致癌細胞的吞 噬、凋亡或殺死。
0063也可通過使用本發(fā)明藥物組合物中含有的L1CAM表達抑制物抑制 L1CAM的表達來實現膽管癌的治療。在這種情況下，L1CAM對膽管癌細胞的生長 和轉移的刺激性作用降低。
0064根據其進一歩方面，本發(fā)明涉及用于抑制L1CAM活性的針對L1CAM 的抗體，或用于抑制L1CAM表達的針對L1CAM的寡核苷酸。
0065在這方面的一個實施方式中，如根據本發(fā)明的組合物所述，只要抗體特 異性地結合L1CAM,抗體包括具有兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈的完整形式，以及 抗體分子的功能片段。抗體分子的功能片段是至少保留抗原結合功能的片段，并且包 括Fab、 F(ab)、 F(ab')2和Fv。
0066優(yōu)選地，抗體識別膽管癌細胞表面抗原或分泌的表面抗原(L1CAM)。 抗體的特征是它結合膽管癌細胞表面蛋白L1CAM以抑制或中和L1CAM的作用；以 及通過結合癌細胞，它抑制細胞的生長和轉移、吞噬細胞、在細胞內誘導凋亡或殺死 細胞。
0067如申請US20040115206中所述，抗L1CAM抗體不總是抑制L1CAM 的作用。本抗體的特征是它不刺激L1CAM的作用，而抑制L1CAM的活性。0068更優(yōu)選地，抗體是新的單克隆抗體A10-A3或4-63。0069在另一個實施方式中，針對L1CAM的本發(fā)明寡核苷酸——功能為阻抑 L1CAM的表達——選自針對LlCAM的siRNAs、 shRNAs和反義寡核苷酸，其針對本發(fā)明組合物被詳細說明。
0070在進一步的實施方式中，大量培養(yǎng)膽管癌細胞并將其注射至小鼠的爪墊。 從小鼠的淋巴結提取淋巴細胞并與骨髄瘤的腫瘤細胞融合以產生小鼠雜交瘤，該小鼠 雜交瘤產生結合膽管癌細胞的抗體。
0071詳細地，將膽管癌細胞系SCK和Choi-CK注射至小鼠的爪墊，并且從 小鼠的淋巴結提取淋巴細胞。所分離的淋巴細胞與FO骨髄瘤細胞融合，并且選擇表 達抗體的克隆。在所選擇的克隆中，測試相對穩(wěn)定地分泌單克隆抗體的雜交瘤上清液 結合膽管癌細胞的能力。由此建立的單克隆抗體-分泌雜交瘤命名為"雜交瘤 A10-A3"。該雜交瘤于2006年2月20日保藏于國際保藏機構KCTC (韓國典型培養(yǎng) 物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures);韓國生物科學和生物技術研究所 (Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB),韓國)并給予登 錄號KCTC10909BP。
0072
0073分別地，使用人胚胎干細胞獲得識別LlCAM的另一個抗體4-63，并發(fā) 現該抗體結合膽管癌和肺癌細胞。分泌4-63抗體的雜交瘤保藏于KCTC并給予登錄 號KCTC10966BP。詳細地，發(fā)現單克隆抗體結合癌細胞系——例如膽管癌(參見圖 1),但不結合正常細胞——包括肝細胞、HUVEC (人臍靜脈內皮細胞)或外周血淋 巴細胞(參見圖l)。該抗體抑制膽管癌的生長、遷移或侵入。而且，觀察到已知的 抗L1CAM抗體5G3結合膽管癌細胞，但只能以低效率抑制癌癥生長(參見圖8); 而發(fā)現另一個已知的抗L1CAM抗體UJ127結合膽管癌細胞并因此抑制細胞的生長。 這些結果顯示抗L1CAM抗體不總是抑制L1CAM的作用。
0074
0075在本發(fā)明的另一個實施方式中，發(fā)現在分別用 5-TGGTACAGTCTGGGdtdt國3和5-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3的siRNA序 列轉染的Choi-CK和SCK細胞系中，L1CAM的表達水平低于在用非特異性寡核苷 酸轉染的同樣的細胞系中的水平。而且觀察到，與正常表達L1CAM的癌細胞組相比， LlCAM的siRNA敲除的癌細胞組的增殖、侵入和遷移被降低。
0076如本發(fā)明的實施例證實(參考實施例5、 6和7),本發(fā)明人首次發(fā)現 在約40%的膽管癌患者中，L1CAM在膽管癌細胞中以過量表達的程度被表達。本發(fā) 明人還首次揭示，L1CAM是不良預后因子，其在膽管癌細胞的腫瘤進展中發(fā)揮重要 作用，從而增加死亡的危險；并且以前已知是癌癥不良預后因子的EGFR，不是膽管 癌的不良指示物。因此，根據本發(fā)明的針對LiCAM活性或表達的抑制物可特異性地 應用于表達L1CAM的癌癥——特別是膽管癌——的診斷和治療。
0077此外，免疫組織化學染色分析顯示，LiCAM在非小細胞肺癌(NSCLC) 細胞上以低于10%的水平被表達。當用A10-A3抗體處理表達UCAM的NSCLC細胞系A549和NCI-H522時，它們的生長被分別抑制14%和24%的量，其遠遠低于 40%_A10-A3對膽管癌生長的近似抑制率，這說明本發(fā)明的組合物對于膽管癌在 治療上是特別有效的。這種比較進一步地描述于與本申請同日提交的韓國專利申請 (名稱為治療膽管癌的藥物組合物、抑制膽管癌生長或侵入的方法和治療膽管癌的 方法)中，其全部內容通過引用并入本文。
0078可通過如下實施例獲得對本發(fā)明的更好的理解，實施例用于說明，而不 被解釋為對本發(fā)明的限制。
0079
發(fā)明實施方式
0080實施例1:癌細胞的培養(yǎng)0081
0082使用如下培養(yǎng)基——含有10°/。胎牛血清(FBS;Gibco)——在37'C、 5%(:02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)癌細胞系。使用MEM培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)SH-J1 (肝細胞 癌)、SCK (膽管癌)、Choi-CK (膽管癌)和ACHN (腎細胞腺癌)細胞；和使用 McCoy 5A培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)SK-OV3 (卵巢腺癌)細胞。在Ham's F12K培養(yǎng)基 中培養(yǎng)A549 (非小細胞肺癌)細胞，以及在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)CI-H522 (非 小細胞肺癌)、DMS114 (小細胞肺癌)、DMS53 (小細胞肺癌)和NCI-H69 (小細 胞肺癌)細胞。SH-J1、 SCK和Choi-CK細胞系獲贈自Daegon Kim博士 (全北國立 大學醫(yī)學院(Medical School, Chonbuk National University))以及其它癌細胞系購自 ATCC。正常肝細胞和HUVEC (人臍靜脈內皮細胞)均購自Cambrax，使用含有10% FBS (Gibco)的EGM-2培養(yǎng)基(Hyclo加)在37'C、 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過 Ficoll-梯度離心從人血分離外周淋巴細胞(PBL)。
0083
0084實施例2:結合癌細胞Choi-CK和SCK的A10-A3單克隆抗體的制備0085
0086使用細胞解離緩沖液(Invitrogen)分離培養(yǎng)的Choi-CK和SCK癌細胞， 并且5xl05個細胞懸浮于30 pi的PBS。用Choi-CK細胞注射Balb/c小鼠的右爪墊， 并且3天后用SCK細胞注射左爪墊。然后以3-4天的間隔，小鼠被加強6次，并且 最后在細胞融合的前一天進行免疫。在細胞融合前兩周，待與淋巴結細胞融合的F0 骨髓瘤細胞(ATCC， USA)的培養(yǎng)在含有10°/。FBS的DMEM (Gibco)中開始。從 用Choi-CK和SCK細胞免疫的小鼠去除胭淋巴結，用DMEM培養(yǎng)基(Gibco)充 分洗滌并精細切片。將細胞懸浮液轉移至15-ml管。通過離心收集F0骨髓瘤細胞， 懸浮于10ml的DMEM培養(yǎng)基中，并連同淋巴結細胞一起計數。然后，將1(^個F0 骨髓瘤細胞和107個淋巴結細胞在50-ml管中混合，并且以200xg離心5 min。棄除 上清液后，將管在含有水的燒杯在37'C中溫育2min。輕打管以松動細胞沉淀后，將
121 ml的PEG (Gibco)在超過一分鐘的時間里緩慢地加入管中，同時在37C水浴中輕 搖管。在100xg離心細胞2min后，將5 ml的DMEM培養(yǎng)基以超過3 min緩慢地加 入管中，并且將5 ml的DMEM培養(yǎng)基以超過2 min進一步地緩慢加入。然后通過200 xg離心收集細胞。為了增加細胞融合效率和細胞存活率，基本培養(yǎng)基(DMEM + 20% FBS)預先補充10%雜交瘤克隆因子(BioVeris，USA)?；厥盏募毎恍⌒牡貞腋≡?30ml補充雜交瘤克隆因子的正常培養(yǎng)基(DMEM+ 20% FBS)中。將細胞懸浮液在 37'C在CO2培養(yǎng)箱中溫育30min后，105個細胞(70 nl)被等分至96孔板并在37"C 在C02培養(yǎng)箱中溫育。第二天，將70 pl的HAT培養(yǎng)基加入每個孔，并且以3天為 間隔在超過2周的時間內，觀察板內是否在HAT培養(yǎng)基中形成集落。通過淋巴細胞 與骨髓瘤細胞融合獲得的雜交瘤集落的培養(yǎng)上清液用于下面的測試，其中淋巴細胞從 用Choi-CK細胞免疫的小鼠淋巴結中和從用SCK細胞免疫的小鼠的淋巴結中分離。
0087使用夾層ELISA (酶聯免疫吸附分析)選擇表達抗體的克隆。將100 ^ 的雜交瘤培養(yǎng)物加入用2ng/ml的抗-小鼠IgG或IgM抗體包被的板，并使其在37'C 反應1小時。然后在1:5,000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP; Sigma)-偶聯的抗-小鼠 IgG或IgM抗體中溫育板1小時。用含有0.08% Tween 20的磷酸鹽緩沖液洗滌板后， 將含有OPD( Sigma)和H202的底物溶液加至每個孔，并且使用分光光度計在492 nm 測定吸光率用以選擇產生抗體的克隆。
0088在所選擇的克隆中，測試相對穩(wěn)定地分泌單克隆抗體的雜交瘤的培養(yǎng)匕 清液與SCK和Choi-CK細胞的結合能力。詳細地，用細胞解離緩沖液(Gibco)在 37'C處理培養(yǎng)的Choi-CK細胞20 min以將其解離至單個細胞，并將其通過40卞m的 滲濾器。5X1()S個細胞用于流式細胞術。將解離至單個細胞的SCK和Choi-CK細胞 懸浮于PBA (PBS中1% BSA),并使抗體上清液在4'C反應30 min。以1200 rpm 離心細胞5min后，棄除100pl的上清液,并且使細胞與1:200稀釋的抗-小鼠Ig-FITC (BD)在4'C反應30 min。用PBA洗滌細胞兩次后，選擇碘化丙錠(propidium iodide， PI)陰性細胞并使用流式細胞儀(FACS caliber)評價與SCK和Choi-CK細胞的結合 能力。
0089選擇分泌與SCK和Choi-CK細胞結合的抗體的各種雜交瘤，其通過連 續(xù)亞培養(yǎng)(傳代培養(yǎng))來穩(wěn)定，然后亞克隆。選擇分泌抗體A10-A3的雜交瘤，其通過 亞克隆穩(wěn)定地保持對SCK和Choi-CK細胞的特異性。
OO卯分泌A10-A3抗體的雜交瘤命名為"雜交瘤A10-A3"。該雜交瘤于2006 年2月20 R保藏于KCTC (韓國典型培養(yǎng)物保藏中心韓國生物科學和生物技術研 究所(KRIBB)， 52, Oun-dong, Yusong-ku，韓國大田市)并指定登錄號KCTC10909BP。
0091
0092實施例3:在肺癌細胞系中評價L1CAM的細胞表面表達00930094.在無血清培養(yǎng)基(PFHM， Invi加gen)中培養(yǎng)雜交瘤A10-A3細胞系， 并且使用G蛋白-瓊脂糖柱(Pharmacia, Sweden)純化分泌的A10-A3抗體(Fike等， Focus 12: 79， 19卯)。使用熒光染色，根據與實施例3相同的方法(圖1)評價純化 的A10-A3抗體對膽管癌細胞的結合能力。圖1中，用實線描繪輪廓的空峰代表用單 克隆抗體A10-A3和4-63以及已知的抗L1CAM抗體5G3 (Phaimingen, SanDiego， USA)和UJ127 (Chemicon)處理的樣品，而實峰是單獨存在第二抗體的背景熒光。 使用流式細胞儀分析A10-A3、 4-63、 5G3和UJ127抗體對各種癌細胞的結合能力。 FACS分析揭示，單克隆抗體結合NCI-H522、 A549、 DMS114、 DMS53和NCI-H69 肺癌細胞(圖1的圖A、 B、 C和D)，而它們不結合ACHN癌細胞、正常細胞、肝 細胞、HUVEC或外周淋巴細胞(PBL)。
0095
0096實施例4:單克隆抗體A10-A3識別的抗原的分離和鑒定0097
0098實施例4-l:抗原分離0099
0100按如下分離單克隆抗體A10-A3識別的細胞表面蛋白。首先，用PBS 洗滌Choi-CK細胞并用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce, Rockford， IL)生物素 化該細胞。在裂解緩沖液(25mMTris-HCl， pH7.5, 250mMNaCl， 5mMEDTA' 1% Nonidet P-40, 2pg/ml牛胰蛋白酶抑制劑，100jig/ml苯甲基磺酰氟，5ng/ml抑蛋 白酶醛肽)中以4'C溫宵細胞20min。離心細胞去除細胞碎片后，回收上清液，并使 用二辛可寧酸(bicinchoninicacid, BCA)蛋白分析試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度。
0101在4'C將細胞裂解物與20nlG蛋白plus-瓊脂糖(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz)反應2小時，并離心去除非特異性結合G蛋白plus-瓊脂糖的蛋白?；?收上清液并將其與約1叫抗體在4'C反應12小時。將20jU的G蛋白plus-瓊脂糖加 入反應混合物，然后在4'C溫育2小時。離心反應混合物并回收沉淀物。用細胞裂解 緩沖液洗滌回收的沉淀物十次以上，并使用10%SDS-PAGE分離保留的蛋白。
0102將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上并進行蛋白質印跡。用含有5%脫脂奶的 PBST (PBS + 0.1%Tween20)封閉硝酸纖維素膜1小時，并用PBST洗滌兩次以上。 然后，將印跡(blot)與鏈酶抗生物素-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物(1:1,500; Amersham Biosciences)溫育1小時。用PBST洗滌印跡五次后，用ECL試齊U(Amersham Biosciences)顯影生物素化的蛋白。
0103發(fā)現A10-A3抗體結合約200kDa的蛋白(圖2中的圖A)。為了收集 被A10-A3抗體免疫沉淀的蛋白，將1X 108Choi-CK細胞的細胞裂解物根據如上所述 的相同方法進行免疫沉淀，并在SDS-PAGE凝膠上電泳。用考馬斯G250 (Biorad) 染色凝膠。0104
0105實施例4-2:使用質譜鑒定抗原0106
0107用考馬斯G250(Coomassie G250) (BIO-RAD)染色含有被A10-A3抗體 免疫沉淀的蛋白的SDS凝膠。從凝膠上切割蛋白條帶，用30o/o甲醇洗滌5min,并精 細切割。凝膠片用100。/。乙腈脫水10min，并在真空離心機中完全干燥30min。將干 燥的凝膠片與50mM碳酸氫銨中的300ng胰蛋白酶(Promega)在37C溫育16小時。 用100pl的50mM碳酸氫銨提取消化的肽三次，并在真空離心機中干燥。使用電噴 霧四極桿飛行時間串聯質譜(electrospray quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry, ESI Q-TOF MS/MS) (Q-TOF micro, MicroMass)分析肽混合物。Al0-A3 抗體識別的蛋白被鑒定為L1細胞粘附分子(L1CAM)(圖3)。圖3中，下劃線區(qū) 域表示由Q-TOF實際鑒定的氨基酸序列。因此，如實施例3-1所述，用購自Chemicon (USA)的抗L1CAM單克隆抗體JU127.11免疫沉淀生物素標記的Choi-CK細胞裂 解物，并用ECL顯影印跡。如圖2(A)所示，發(fā)現A10-A3抗體和抗L1CAM抗體免 疫沉淀了約200 kDa的相同分子量的蛋白。
0108
0109實施例4-3:使用蛋白質印跡鑒定L1CAM抗原0110
0111為了確定A10-A3抗體識別L1CAM，使用A10-A3抗體在Choi-CK細 胞裂解物中進行免疫沉淀。
0112在4'C將細胞裂解物與20 nl G蛋白plus-瓊脂糖(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz)反應2小時，并離心去除非特異性結合G蛋白plus-瓊 脂糖的蛋白?；厥丈锨逡翰⑵渑c約l pg抗體在4X:反應12小時。將20^的G蛋 白plus-瓊脂糖加入反應混合物，然后在4'C溫宵2小時。離心反應混合物并回收沉 淀物(圖2的預洗)。用細胞裂解緩沖液洗滌回收的沉淀物多于十次，并使用不含巰 基乙醇的10% SDS-PAGE分離保留的蛋白。
0113將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上并進行蛋白質印跡。用含有5%脫脂奶的 PBST (PBS + 0.1%Tween20)封閉硝酸纖維素膜1小時，并用PBST洗滌兩次以上。 然后，用作為初次抗體的已知抗L1CAM抗體UJ127 (Chemicon)溫育印跡1小時。 用PBST洗滌五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶聯物(1:1，500; Sigma)溫育印跡1小時。 用PBST洗滌印跡五次后，用ECL試劑(AmershamBiosciences)顯影生物素化的蛋 白。發(fā)現抗L1CAM抗體結合約200kDa的蛋白，該蛋白用A10-A3抗體免疫沉淀(圖 2的圖B)。該結果證實A10-A3抗體識別L1CAM。
0114
0115實施例4-4:可溶性L1CAM的表達
10116
0117為了構建表達可溶性L1CAM的表達載體,使用RNA提取試劑盒(Roche co.)從Choi-CK癌細胞分離總RNA。使用RT-PCR試劑盒(Roche Co.)進行PCR, 該PCR使用該分離的總RNA作為模板，兩個末端引物為Ig-dom-F(5'-GAGGAGGAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG國3', 38 mer)和Ll-Fn-Stop-R (5'-CTC TAG AGT TCT CGA GTC AGA GCC TCA CGC GGC C-3'， 34 mer)以及pfii 聚合酶(SolgentCo.) 。 PCR條件包括在95'C預溫育5min，以95。C 30sec、 58" 30 sec和72X: 2 min進行25個循環(huán)，以及最終在72'C延伸10 min。
0118用EcoR I和Xho I消化被擴增的可溶性LI DNA片段，并在1%瓊脂糖 凝膠上電泳。將L1 DNA片段從凝膠上切離，并用凝膠純化試劑盒(Intronco.)純化。 使用T4 DNA連接酶(Roche co.)，在16'C將消化的LI DNA片段與用EcoR I和Xho I消化的pJK-dhfr2表達載體(Aprogen)連接30 min，并通過熱擊轉化至大腸桿菌 DH5a。從轉化的細胞分離質粒DNA,并測定其DNA序列。DNA測序顯示成功克隆 可溶性LICAM的cDNA。如此獲得的表達載體被命名為"pJK-dhfr2-Ll-單體"。
0119為了以單體形式表達可溶性L1CAM，將pJK-dhfr2-Ll-單體DNA轉染 至HEK293T細胞(ATCC CRL11268，下文中稱為293T)。
0120將10嗎的表達載體DNA和Lipofect咖ine 2000(脂轉染試劑)(Invitrogen co.)單獨地加至500 nl Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)，并使其在室溫靜置5 min。 然后，將該載體DNA與lipofectamine混合，并且使混合物在室溫反應15 min。在 DNA-lipofectamine復合物形成過程中，小心地用PBS (pH7.4)洗滌293T細胞，并 將Opti-MEM培養(yǎng)基小心地加至細胞，然后去除。將DNA-lipofectamine復合物與4 ml Opti-MEM培養(yǎng)基混合，并小心地滴在細胞上。將細胞于37'C在培養(yǎng)箱內溫宵。6小 時后，細胞再次給予5mlOpti-MEM培養(yǎng)基，并進一步培養(yǎng)3天。
0121
0122實施例4-5:抗體與可溶性L1CAM的結合特異性的評價0123
0124將表達可溶性L1CAM的293T細胞的培養(yǎng)液和另一種不表達可溶性 L1CAM的293T細胞培養(yǎng)液進行10% SDS-PAGE，然后進行蛋白質印跡。用含有5% 脫脂奶的TBST(TBS + 0.05% Tween20)在4'C封閉硝酸纖維素膜1小時，并用TBST 洗滌兩次以上。然后，用初次抗體——已知的抗L1CAM抗體UJ127 (Chemicon)和 5G3 (Pharmingen)以及A10-A3和4-63抗體溫育印跡1小時，每種抗體在含有5% 脫脂奶的TBST中稀釋1:10,000。用TBST洗滌五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶聯物 U:l，500; Sigma)溫育印跡1小時。用PBST洗滌印跡五次，并用ECL試劑(Amersham Biosciences)顯影。發(fā)現每種抗體結合約200 kDa的可溶性L1CAM (圖2(C))。而 且，使用上述抗體對表達L1的細胞培養(yǎng)物的ELISA顯示，每種抗體對表達的可溶性L1CAM具有結合特異性。0125
0126實施例5:膽管癌組織的免疫組織化學染色0127
0128制備腫瘤的3jun厚的切片用于膽管癌組織的免疫組織化學染色。將切 片放置于用聚-L-賴氨酸包被的載玻片上，并在60"C干燥3小時。然后在室溫將切片 在二甲苯中脫蠟5min，三次，并在100%、卯°/ 、 80%以及隨后在70%的醇中水合， 每種lmin。將載玻片浸泡在靶標恢復液(target retrieval solution) (DAKO,Caipinteria， CA)中以恢復抗原性，并用TBST (Tris緩沖鹽-Tween20)洗滌，使用壓力鍋將TBST 預先煮沸4min。將無生物素的酪胺信號擴增系統(tǒng)，CSA II (DAKO， Carpinteria， CA)用于免疫組織化學染色的高靈敏檢測。將載玻片在3%過氧化氫中溫育5 min 以阻斷抗體的非特異性結合。用TBST洗滌兩次，每次5min后，用充分地無血清的 蛋白封閉液溫育切片5 min以阻斷蛋白的非特異性結合。用初次抗體(A10-A3和 4-63， l:50稀釋)溫育組織切片15min，然后用抗小鼠免疫球蛋白-HRP溫育15 min。 然后用擴增試劑和抗-熒光素-HRP溫育切片，每種溫育15min。最后，用DAB染色 切片5min，并且用Meyer's蘇木精復染，隨后用TBST洗滌5 min，兩次。根據如上
所述的相同方法來染色陰性對照，除了用不含有初次抗體的正常綿羊血清或正常小鼠 IgGl血清代替初次抗體。發(fā)現A10-A3或4-63抗體都不結合正常組織，但觀察到它 們結合膽管癌組織(圖4)。
0129該結果說明L1CAM在膽管癌組織中的表達。
0130
0131使用A10-A3抗體進行免疫組織化學染色分析，在42位肝內膽管癌患 者的45.2%和103位肝外膽管癌患者的39.8%中觀察到L1CAM的表達(圖5)。特 別地，在侵入前端L1CAM以高水平表達，這解釋了膽管癌的轉移起始(圖4)。
0132
0133實施例6:膽管癌中L1CAM表達率和膽管癌患者存活率的統(tǒng)計學分析0134
0135在患有肝外膽管癌的患者(60例)中分析L1CAM表達率和存活率之 間的相關性。在顯示高L1CAM表達率的患者組中發(fā)現其總存活(OS)與無病存活 (DFS)的統(tǒng)計學顯著性降低，即與那些具有低L1CAM表達率的患者組相比，死 亡風險增加(圖6)。如存活曲線所示，在顯示高和低L1CAM表達率的膽管癌患者 之間2年OS中存在很大差異和統(tǒng)計學顯著性。而且，具有低L1CAM表達率的膽管 癌患者的2年DFS與具有髙L1CAM表達率的膽管癌患者的2年DFS之間存在具有 統(tǒng)計學顯著性的差異。
0136相反，患者的存活與EGFR (表皮生長因子受體)表達率之間的相關性不存在統(tǒng)計學顯著性(圖6)，已知EGFR在膽管癌或其他腫瘤中過量表達。這些結 果暗示L1CAM的抗體對膽管癌的診斷和治療有用，并可應用于膽管癌轉移的早期診 斷，從而增加其對疾病的治療作用。從L1CAM表達率與存活之間相關性的統(tǒng)計分析 數據明顯得出，具有L1CAM髙表達率的膽管癌患者發(fā)生比L1CAM低表達率患者更 髙的死亡率。0137
0138通過說明L1CAM是不良預后因子，其結果顯示L1CAM可以是治療膽 管癌的靶標。雖然EGFR在膽管癌中高水平表達，但是相反，由EGFR表達率和存活 率的相關性推斷，EGFR_其已作為治療劑的靶標目前臨床上用于結腸癌的治療(例 如cetuximab, EGFR的嵌合抗體)——被證實不是膽管癌的不良預后因子。這證實 不是所有在癌癥中過量表達的分子都是癌癥的不良預后因子并因此作為其治療的重 要靶標。
0139
0140實施例7: L1CAM表達的阻抑對膽管癌細胞的影響0141
0142實施例7-1:使用siRNAs在膽管癌細胞中抑制L1CAM表達0143
0144在Choi-CK和SCK細胞中敲除L1CAM的表達。為此，用L1CAM的 兩條siRNA寡核苷酸(5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3鄰5'-CAGCAACTTTGCTCAGA GGdtdt-3')或非特異性寡核苷酸(5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGGdtdt-3')轉染癌細 胞并將其培養(yǎng)72小時。通過流式細胞術、RT-PCR和使用A10-A3抗體的蛋白質印跡， 評價L1CAM的敲除。結果，與用非特異性siRNA處理的對照相比，經測定用siRNAs 處理的Choi-CK和SCK細胞在L1CAM的總表達和細胞表面L1CAM水平上降低(圖 7中的圖A)。
0145
0146實施例7-2:用針對L1CAM的siRNA處理后膽管癌細胞活性的評價0147
0148比較用針對L1CAM的siRNA和非特異性siRNA轉染的膽管癌細胞之 間的細胞增殖、侵入和遷移。通過培養(yǎng)相同數目的細胞72小時后借助臺盼藍計算細 胞數目來評價增殖程度。分別使用QCM24孔細胞侵入分析試劑盒(Chemicon)和 QCM 24孔比色細胞遷移分析試劑盒(Chemicon)分析侵入和遷移程度。用siRNA 敲除L1CAM的癌細胞，與正常水平表達L1CAM的癌細胞相比，前者顯示出增殖、 侵入和遷移程度的降低。這些結果顯示，L1CAM在膽管癌細胞的生長、遷移和侵入 中發(fā)揮作用(圖7中的圖B)。
0149
18說明書第17/20頁
0150實施例8: L1CAM特異性的抗體對膽管癌細胞生長的抑制0151
0152評價抗L1CAM抗體對膽管癌細胞生長的抑制效果。A10-A3抗體可結 合的Choi-CK和SCK細胞用于該測試，而卵巢癌細胞系(SK-0V-3)和ACNH分別 作為陽性對照和陰性對照。將這些細胞以2xl()5細胞/孔的密度接種于每孔含有3 ml 培養(yǎng)基的24孔板并培養(yǎng)。將單克隆抗體以10ng/ml的濃度加至每孔，隨后將細胞在 37'C培養(yǎng)箱中溫育10天。收集后，使用0.2%臺盼藍對存活的和死亡的細胞計數，并 且細胞的存活率表達為總細胞數的百分比。當用A10-A3抗體處理時，Choi-CK和SCK 細胞的生長速率明顯地降低，類似SK-OV3細胞，而ACHN細胞正常增殖(圖8中 圖A)。另一方面，發(fā)現4-63抗體抑制膽管癌細胞的生長(圖8中圖B)。
0153當以此治療膽管癌細胞時，已知特異性地結合L1CAM的UJ127 (Chemicon)抗體顯著抑制癌細胞的生長。但是，在5G3 (Pharmingen)的情況下一 一其也特異性地結合L1CAM~~僅微微抑制膽管癌細胞(Choi-CK)的生長(圖8 中的圖C)。發(fā)現5G3抗體結合Choi-SK細胞(圖1中圖C)。這些結果顯示，抗 L1CAM抗體與腫瘤細胞的結合不一定抑制腫瘤細胞的生長。
0154
0155實施例9: L1CAM特異性抗體對膽管癌細胞侵入和遷移的抑制作用0156
0157使用QCM 24孔細胞侵入分析試劑盒(CHEMICON)進行細胞侵入分 析。使用300fxl的預熱無血清培養(yǎng)基(RPMI, 10 mM HEPES， pH 7.4)在室溫再水 合每個插入物(insert)的ECM層30 min。用PBS洗錄Choi-CK、SCK、SK-OV3和ACHN 細胞兩次，并用3ml胰蛋白酶-EDTA在培養(yǎng)箱中于37"C處理。收集分開的細胞并在 20(Hil侵入培養(yǎng)基(RPMI， lOmMHEPES, pH7.4， 0.5%BSA)中調整至密度1 x105 細胞。然后將細胞插入至每個插入物，并用A10-A3抗體、4-63抗體、5G3抗體(10 Hg/ml)和正常小鼠IgG( 10 pg/ml)溫育。用補充10% FBS的侵入培養(yǎng)基填充下室(lower chamber),并在培養(yǎng)箱中于37'C溫育72小時。然后，去除保留在每個插入物中的細 胞和培養(yǎng)基，并將每個插入物轉移至新孔。將每個插入物置于225^1預熱的細胞脫離 溶液(detachment solution),并在培養(yǎng)箱中于37C溫育30 min。振蕩插入物以使保留的 細胞完全脫離，并將75^的裂解緩沖液/染液加入到每個含有細胞和細胞脫離溶液的 孔，然后在室溫溫育15 min。將200^1的混合物轉移至96孔板，在480/520 nm讀取 熒光。發(fā)現A10-A3抗體抑制Choi-SK、 SCK和SK-OV3的細胞侵入，但不誘導細胞 侵入的抑制(圖9中的圖A)。而且，4-63抗體降低Choi-SK細胞的侵入(圖9中的 圖A) 。 5G3抗體對Choi-SK細胞侵入抑制的效果低于A10-A3和4-63抗體(圖7 中的圖A)。
0158用如上所述的相同方法進行細胞遷移分析，除了將膠原I型以10g/ml的濃度鋪層于插入物的底部。觀察到A10-A3抗體抑制Choi-SK、 SCK和SK-0V-3 的細胞遷移，但不抑制ACHN的細胞遷移(圖9)。而且，所述抗體抑制Choi-SK、 SCK和SK-OV-3的遷移(圖9)。0159
0160實施例10: A10-A3抗體對癌細胞信號轉導的抑制作用0161
0162實施例10-1: A10"A3抗體對癌細胞的PCNA表達的抑制0163
0164進行蛋白質印跡以檢測是否增殖性細胞核抗原(PCNA)的表達——說 明細胞增殖——被A10-A3抗體抑制。在這一點上，用A10-A3或IgG 10溫育Choi-SK 細胞72小時，收集并溶解于細胞裂解緩沖液。使用BCA (二辛可寧酸)蛋白分析試 劑盒(Pierce)測定蛋白濃度。將40嗎的蛋白在8% SDS-PAGE上電泳，并以25 V 90 min轉移至硝酸纖維素膜上。將印跡在5%脫脂奶中4'C過夜封閉，并用小鼠單克隆 抗-PCNA (Novocastra Laboratories 1:500)抗體和抗p肌動蛋白(Oncogene, 1:4000) 抗體溫育1小時。然后，用抗小鼠辣根過氧化物酶-偶聯抗體(Cell Signaling, 1:1000) 處理膜并用PBST洗滌，之后用增強的化學發(fā)光試劑(ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)使得PCNA和P-肌動蛋白可見。觀察到只有用A10-A3抗體處理的Choi-SK 細胞存在顯著降低的PCNA表達。
0165
0166實施例10-2: PCNA的表達對ERK磷酸化的抑制0167
0168進行蛋白質印跡以檢測A10-A3抗體是否降低參與腫瘤細胞生長、遷移 和存活的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。用10ng/ml的A10-A3抗體或小鼠IgG 溫存Choi-SK細胞72小時，收集并用細胞裂解緩沖液裂解。使用二辛可寧酸(BCA) 蛋白分析試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度，并將40嗎的蛋白在12% SDS-PAGE上電 泳。以25V90min將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。將印跡用5%脫脂奶于4'C過夜封 閉，并用在1%脫脂奶中的兔多克隆抗磷酸MAPK抗體(Abeam,以1:1000稀釋) 過夜溫育。根據如上所述的相同方法處理相同量的蛋白，以研究非磷酸化MAPK的 表達，并且用抗-MAPK抗體(Abcam，以1:1000稀釋)溫育被封閉的硝酸纖維素膜 1小時。用抗兔HRP偶聯抗體(Cell Signaling,以1:10000稀釋)溫育印跡。用PBST 洗滌印跡后，使用ECL (Amersham Pharmacia Biotech)檢測磷酸MAPK和MAPK。 在表達相同MAPK的Choi-CK細胞中，只有那些用A10-A3抗體處理的細胞在磷酸 -MAPK水平上顯著降低(圖10A)。
0169
0170實施例10-3:用A10-A3抗體抑制AKT的磷酸化0171
0172進行蛋白質印跡以檢測A10-A3抗體是否降低參與腫瘤細胞存活的AKT 磷酸化。用10ng/ml的A10-A3或小鼠IgG溫育Choi-CK細胞l、 1.5和2小時，收 集并用細胞裂解緩沖液裂解細胞。使用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度， 并將40嗎的蛋白在12% SDS-PAGE上電泳。以25 V、卯min將蛋白轉移至硝酸纖 維素膜上。將因此形成的印跡用5。/。脫脂奶于4X:過夜封閉，并用在1%脫脂奶中的兔 多克隆抗磷酸Akt抗體(Ab cam， 1:1000稀釋〉和兔多克隆抗Akt (Abcam， 1:1000 稀釋)過夜溫育，隨后用抗兔IgGHRP(SantaCruzl: 1000稀釋)反應1小時。用PBST 洗滌印跡后，使用ECL (Amersham Pharmacia Biotech)檢測磷酸Akt和總Akt。只有 在A10-A3抗體處理的Choi-CK細胞中，磷酸-Akt水平顯著降低(圖10B)。
0173
0174實施例10-4:用A10-A3抗體抑制FAK激活0175
0176進行蛋白質印跡以檢測A10-A3抗體是否降低在腫瘤細胞的生長和遷移 中發(fā)揮重要作用的黏著斑激酶(FAK)的磷酸化。用10ng/ml的A10-A3抗體溫宵 Choi-SK和SCK細胞0.5、 1、 1.5和2小時，收集并用細胞裂解緩沖液裂解細胞。使 用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度，并將40嗎的蛋白在7.5 % SDS-PAGE 上屯泳。以25V卯min將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶將如此形成的 印跡4'C過夜封閉，并用在1%脫脂奶中的兔多克隆抗磷酸FAK抗體(Abcam， 1:1000 稀釋)和抗-p-肌動蛋白(Oncoge加，1:4000稀釋)溫育1小時。然后用抗兔HRP-偶聯抗體(Cell Spring, 1:10000稀釋)溫育1小時。用PBST洗滌印跡后，使用增強 的化學發(fā)光試劑(ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)檢測磷酸FAK和P-肌動蛋 白水平。在用A10-A3抗體處理的Choi-CK和SCK細胞中都觀察到磷酸-FAK水平的 降低(圖IOC)。
0177
0178實施例ll:在小鼠模型中A10-A3抗體對癌細胞的抑制活性的分析0179
0180通過Central Lab. Animal Inc.從Japan SLC購買6~8周齡且體重18~22 g 的裸鼠Balb/cnu/mi，并在韓國生物科學和生物技術研究所的實驗室習服(馴化)一周。 將Choi-CK細胞(3X106)皮下移植入小鼠并在第20天生長成具有390mmS大小的 腫瘤塊(圖10A)。根據公式V-長軸(mm)x短軸(mm)x高度(mm)x1/2來估定腫瘤體 積。在最后一天，用C02氣體處死小鼠，并且分離和稱重腫瘤。還測量小鼠體重以 測定毒性。使用ANOVA (Prism，GraphPad Software, USA)和t檢驗(students t-test) 來評價標準偏差(SDs)和p值。
01810182當從第1天起， 一周三次將A10-A3抗體以10 mg/kg的劑量注射入尾靜 脈時，直到第20天觀察到有效的抗癌癥效果(圖1A)。將小鼠IgG抗體以相同劑量 注射作為對照。經測定標準腫瘤體積為232 mm3,其說明抗癌癥活性比對照高約40% (圖11A)。在最后一天(第20天)，分離并稱重腫瘤(圖11 B)。對照組和A10-A3-施用組的標準腫瘤重量分別為872 mg和516 mg，其說明的事實是A10-A3抗體的抗 癌癥活性比對照的抗癌癥活性髙40% 。
0183監(jiān)測裸鼠體重20天以預測A10-A3的毒性。而且，用裸眼觀察小鼠的 行為(圖11D)。在第20天觀察到與對照相比，用感興趣抗體處理的小鼠既沒有體 重變化，又沒有異常行為。
0184
工業(yè)實用性
0185到目前所述為止，本發(fā)明首次發(fā)現L1CAM表達在膽管癌的細胞表面上， 在癌癥的生長和侵入中發(fā)揮重要作用并且是膽管癌的不良預后因子。因此，抗體—— 結合膽管癌細胞表面的L1CAM蛋白，或siRNAs、反義寡核苷酸或shRNAs~~在膽 管癌細胞中阻抑L1CAM表達，和包括根據本發(fā)明的抗體、siRNAs、反義寡核苷酸或 shRNAs的藥物組合物可應用于膽管癌的治療，原因在于它們被證實抑制膽管癌的生 長、侵入和遷移。
0186
權利要求
1.抑制膽管癌的生長或轉移的藥物組合物，其包括L1CAM活性或表達抑制物，所述L1CAM活性抑制物選自抑制L1CAM活性的抗L1CAM抗體、所述抗L1CAM抗體的抗原結合片段、所述抗L1CAM抗體的變體和所述抗L1CAM抗體的所述抗原結合片段的變體，所述L1CAM表達抑制物是阻抑L1CAM表達的寡核苷酸。
2. 根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述L1CAM活性抑制物識別膜結合形 式或可溶形式的L1CAM。
3. 根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述阻抑L1CAM表達的寡核苷酸 選自針對編碼L1CAM的基因的反義寡核苷酸、siRNA和shRNA。
4. 根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述抗體是4-63，其由具有登錄號 KCTC 10966BP或UJ127的雜交瘤分泌。
5. 根據權利要求3所述的藥物組合物，其中所述siRNA具有 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3'或5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'的序列。
6. —種治療膽管癌的方法，其包括施用權利要求l所述的組合物。
7. —種抑制膽管癌的生長或轉移的方法，通過抑制L1CAM的活性或阻抑 L1CAM的表達來進行。
8. —種診斷膽管癌的方法，其使用對L1CAM特異的抗L1CAM抗體。
全文摘要
本文公開的是抑制膽管癌的生長或轉移的藥物組合物，其包括L1CAM活性抑制物或表達阻抑物，以及使用該組合物的治療方法。這是基于如下的發(fā)現L1CAM在膽管癌中過量表達和在膽管癌的生長和轉移中發(fā)揮重要作用，以及膽管癌患者的死亡率隨L1CAM表達率的增加而增加。而且，發(fā)現抑制L1CAM活性的抗體或阻抑L1CAM表達的siRNA降低膽管癌細胞的生長和侵入。識別膽管癌細胞表面上的L1CAM蛋白和特異性結合膽管癌組織的小鼠單克隆抗體、或siRNAs、反義寡核苷酸或shRNAs可通過抑制膽管癌細胞的生長、侵入和遷移來用于膽管癌的治療。
文檔編號A61K39/395GK101605560SQ200780039170
公開日2009年12月16日 申請日期2007年8月23日 優(yōu)先權日2006年8月23日
發(fā)明者孫演晟, 李應碩, 李重屷, 洪孝貞, 金鎮(zhèn)萬 申請人:韓國生命工學研究院