一種抑制膠質(zhì)瘤生長的過表達(dá)bdnf的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及其臨床應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備抑制膠質(zhì)瘤生長的過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法以及 通過所述方法獲得過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì)胞，特別地，本發(fā)明涉及的過表達(dá)BDNF的間充 質(zhì)干細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中啟動(dòng)了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中microRNA-124的表達(dá)，抑制miR-124靶基因 STAT3、Akt和RelA的表達(dá)，從而抑制了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和成球生長能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑 制了膠質(zhì)瘤的生長和轉(zhuǎn)移；本發(fā)明的過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于臨床治療膠質(zhì) 瘤，針對(duì)性地抑制膠質(zhì)瘤生長，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化治療，從而達(dá)到靶向清除膠質(zhì)瘤干細(xì) 胞的目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠質(zhì)瘤的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的、多種癌基因和/或抑癌基因參與的協(xié)同 積累的過程。迄今為止，傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等治療方法治愈率仍然很低，腫瘤復(fù)發(fā)率 高，預(yù)后極差。傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤治療主要作用于腫瘤的實(shí)體，其療效有限，膠質(zhì)瘤本身的復(fù) 發(fā)轉(zhuǎn)移的能力使得手術(shù)后腫瘤再次生長和轉(zhuǎn)移。原因是腫瘤本質(zhì)上具有抵抗化學(xué)療法和 放射治療的能力或在治療過程中獲得此種能力。而執(zhí)行這一能力的可能是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 (Glioma stem cells，GSC)，其中的機(jī)制包括自噬作用、環(huán)氧化酶-2依賴的炎癥反應(yīng)、抑制 凋亡、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排功能、Notch信號(hào)通路介導(dǎo)作用、DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。
[0003] 針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞靶向治療目前研發(fā)一些治療手段，如通過靶向GSC殺傷可以逆 轉(zhuǎn)腫瘤放化療抵抗，提高放化療的敏感性；針對(duì)血管或內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管微環(huán)境的治療，均 能干擾腫瘤干細(xì)胞微環(huán)境的功能，在抑制腫瘤生長的同時(shí)還消弱了腫瘤的根本；可以識(shí)別 和清除GSCs的免疫細(xì)胞治療，也為抗膠質(zhì)瘤治療提供新的思路。
[0004] 本發(fā)明提供了一種在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)的微小核糖核酸124 (microRNA-124， miR-124)，造成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和成球生長，使得膠質(zhì)瘤生長和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。然而，提 高miR-124在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，抑制了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖與成球生長，引起膠質(zhì)瘤縮 小和抑制轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。本發(fā)明以人間充質(zhì)干細(xì)胞作為載體過表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，能有效地啟動(dòng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 miR-124 的 表達(dá)，從而抑制了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖與成球生長，抑制膠質(zhì)瘤的生長與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。人間充 質(zhì)干細(xì)胞來源方便，細(xì)胞培養(yǎng)獲得簡(jiǎn)單，可以做到個(gè)體化，也可以作為異體規(guī)?；a(chǎn)，是 基因表達(dá)理想的載體，因而，本發(fā)明抑制膠質(zhì)瘤生長的過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì)胞制備簡(jiǎn) 單，能個(gè)體化臨床治療膠質(zhì)瘤患者，也能作為規(guī)?；a(chǎn)的產(chǎn)品應(yīng)用于臨床治療膠質(zhì)瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤高度不均一性，分為三個(gè)等級(jí)，最高級(jí)的是腫瘤干細(xì)胞，位于塔頂， 接下來是分化階段的腫瘤祖細(xì)胞，位于塔底的是已分化的大量腫瘤細(xì)胞。現(xiàn)在的治療往往 針對(duì)的是腫瘤實(shí)體中的分化細(xì)胞，而忽視了前兩種細(xì)胞，雖然這些干細(xì)胞只占膠質(zhì)母細(xì)胞 瘤的很小一部分，但很可能負(fù)責(zé)腫瘤的起源和生長，侵襲和復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處播散。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 具有下列特性：自我更新、無限增殖、多向分化潛能、表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物、培養(yǎng)于干細(xì) 胞培養(yǎng)基中能形成細(xì)胞球、極小數(shù)量接種于免疫缺陷小鼠顱內(nèi)能獨(dú)立成瘤。GSCs的起源至 今未明，可能來源于遺傳或表觀遺傳突變的神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或者星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過 一系列的突變或重新編程而來。GSCs比一般細(xì)胞對(duì)放射治療和化學(xué)治療更加耐受。GSCs的 這些特性被視為是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性表型和術(shù)后復(fù)發(fā)的根源，GSCs是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的"種 子細(xì)胞"，針對(duì)GSCs的研宄或治療更能模擬膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的真實(shí)情況，可見GSCs已成為研 宄治療腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新工具。
[0006] 本發(fā)明是我們長期通過基礎(chǔ)研宄的科研成果，發(fā)現(xiàn)miR-124在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中 發(fā)揮著重要作用，是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞賴以生存的抑制分子。我們研宄發(fā)現(xiàn)miR-124可通過靶 向多個(gè)基因，包括白介素6(interleukin 6，IL-6)信號(hào)通路中的一個(gè)已知兀件信號(hào)傳導(dǎo)與 轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，白介 素1 (IL-1)信號(hào)通路中的一個(gè)已知元件核因子-kB (nuclear factor-kappa B，NF_kB)，以 及白介素8(IL_8)信號(hào)調(diào)控因子蛋白激酶B((serine/threonrine kinase，Akt)等，IL-6、 IL-1和IL-8信號(hào)可能刺激GSCs的生長和生存，其受體和糖蛋白優(yōu)先表達(dá)于GSCs，阻斷其 受體或干擾炎性分子的表達(dá)能抑制GSCs的增殖達(dá)到阻礙腫瘤的生長及延長荷GSCs來源 的膠質(zhì)瘤鼠的生存期及明顯消弱了 GSCs的增殖能力。在人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞中缺氧可導(dǎo)致 miR-124下調(diào)，從而使得STAT3、NF-kB和Akt激活，促使人類膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新、增 殖和侵襲能力。
[0007] 本發(fā)明通過研宄發(fā)現(xiàn)了 BDNF可以與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞膜上BDNF受體結(jié)合激活環(huán)腺 苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 1 (cyclic AMP-response element binding proteinl，CREB1)的 表達(dá)，miR-124啟動(dòng)子中存在著CREB1結(jié)合域，通過CREB1與miR-124啟動(dòng)子域結(jié)合活化 miR-124表達(dá)，高表達(dá)的miR-124可以靶向作用于STAT3、NF-kB和Akt，抑制其的激活，從 而影響炎性分子IL-6、IL-1和IL-8信號(hào)刺激的GSCs生長和生存，同時(shí)也干擾了 IL-6、IL-1 和IL-8等炎性分子的分泌，阻斷了 GSCs自分泌刺激機(jī)制，抑制了 GSCs的增殖和自我更新 能力，導(dǎo)致阻止了膠質(zhì)瘤生長與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。
[0008] 本發(fā)明提供了一種抑制膠質(zhì)瘤生長的BDNF4過表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其 中，所述方法包括通過獲取BDNF基因片段，構(gòu)建到病毒載體上，轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞制備 成過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì)胞。BDNF基因片段通過正常組織中DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DNA polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增或者化學(xué)合成法獲得，經(jīng)酶切位點(diǎn)連接到病毒載體 上，包裝到病毒表達(dá)系統(tǒng)上后轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0009] 人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSC)具有多向分化潛能、造 血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下， 可分化為脂肪、骨、軟骨、神經(jīng)、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞。本發(fā)明利用其干細(xì)胞歸巢趨化功能， 可以定向迀移到腦部受損的部位，發(fā)揮著神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和免疫調(diào)控的作用，是目的基因過 表達(dá)理想的載體，能定位到治療部位過表達(dá)BDNF，激活膠質(zhì)瘤表達(dá)miR-124從而達(dá)到治療 癌癥的作用。
[0010] 由于人間充質(zhì)干細(xì)胞來源方便，細(xì)胞培養(yǎng)獲得簡(jiǎn)單，可以從患者骨髓個(gè)體化獲得， 也可以作為異體規(guī)?；a(chǎn)，這樣一來制備抑制膠質(zhì)瘤生長的過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì) 胞簡(jiǎn)單，能做到個(gè)體化應(yīng)用，也能作為規(guī)模化生產(chǎn)的產(chǎn)品。人間充質(zhì)干細(xì)胞來源人廢棄臍 帶、胎盤、自體骨髓或自體脂肪組織等，優(yōu)選地，來源于人自體骨髓。
[0011] 本發(fā)明所述的病毒載體，可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定增殖和表達(dá)目的基因，主要為慢病毒、 腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等，優(yōu)選地，選擇慢病毒表達(dá)系統(tǒng)。
[0012] 本發(fā)明提供所述的過表達(dá)BDNF的間充質(zhì)干細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)中與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共 培養(yǎng)，啟動(dòng)了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中miR-124表達(dá)，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表 達(dá)，從而抑制了膠質(zhì)瘤干