木聚糖酶腸道定向表達(dá)載體及其細(xì)胞系的制作方法
【專利說明】木聚糖酶腸道定向表達(dá)載體及其細(xì)胞系
[0001] 一、技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉木聚糖酶腸道定向表達(dá)載體及其細(xì)胞系，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
[0002] 二、【背景技術(shù)】 環(huán)境友好型養(yǎng)殖業(yè)是畜牧業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的新方向。改革開放以來，隨著我國國民 經(jīng)濟(jì)的全面、快速發(fā)展，人民生活需求水平的不斷提高，我國畜牧產(chǎn)業(yè)規(guī)?；〉昧丝涨暗?發(fā)展。然而，隨著畜牧場規(guī)模化、集約化和機(jī)械化程度的提高，畜禽糞便已成為一個(gè)不可忽 視的污染源。同時(shí)，我國是一個(gè)養(yǎng)殖大國，飼料產(chǎn)量居世界第二，由于近年來我國養(yǎng)殖業(yè)的 快速發(fā)展，加劇了人畜爭糧矛盾，而且耕地面積日益減少，使糧食問題更加嚴(yán)峻。因此，增加 飼料的營養(yǎng)價(jià)值，提高飼料的利用率和轉(zhuǎn)化率，節(jié)約糧食資源就顯得尤為重要。木聚糖酶作 為一種環(huán)保型飼料酶制劑，應(yīng)用于飼料中提高了飼料的營養(yǎng)價(jià)值，突破了飼料資源開發(fā)利 用的局限，增強(qiáng)了動(dòng)物的生產(chǎn)和抗病能力，減少了動(dòng)物排泄物造成的污染，在發(fā)展環(huán)境友好 型養(yǎng)殖業(yè)中具有重要的意義和價(jià)值。
[0003] 木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物半纖維的重要組分，廣泛存在于植物細(xì)胞壁中， 它占植物碳水化合物總量的1/3,在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的生物質(zhì)資 源。木聚糖可阻止細(xì)胞內(nèi)養(yǎng)分釋放、增加食糜黏度、阻礙飼料營養(yǎng)物質(zhì)與消化液的接觸、 增加腸道不動(dòng)水層厚度，使消化器官代償性增加，并破壞腸道正常結(jié)構(gòu)和微生態(tài)平衡，影 響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，因此木聚糖是一種典型的抗?fàn)I養(yǎng)因子，因豬消化道內(nèi)缺乏相應(yīng)的 內(nèi)源性消化酶分解飼料中這類抗?fàn)I養(yǎng)因子，用作豬飼料的玉米、豆柏中的木聚糖難以被有 效利用，被直接排出體外，導(dǎo)致了飼料資源的浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染。內(nèi)切木聚糖酶 (endo-0-XynB)是水解木聚糖的關(guān)鍵酶，目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得的木聚糖酶產(chǎn)酶微生物主 要來源于自然界中的桿菌、黑曲霉菌、青霉菌屬、木霉屬以及放線菌屬，大部分真菌源木聚 糖酶具有嗜酸性，但細(xì)菌來源的最適pH。#均高于5. 5,本發(fā)明選擇研究來源于黑曲霉屬的 木聚糖酶基因，其酶蛋白？!1_在5. 5左右，酶活性在動(dòng)物胃的酸性環(huán)境中較高。
[0004] 基于以上研究進(jìn)展，利用木聚糖酶分解植物中木聚糖的生物學(xué)特性，綜合現(xiàn)在的 分子和細(xì)胞生物學(xué)手段，采用轉(zhuǎn)基因手段在目的動(dòng)物體細(xì)胞中導(dǎo)入具有特殊生物學(xué)功能的 外源木聚糖酶（XynB)基因，可望進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)途徑，獲得腸道中穩(wěn)定 表達(dá)和穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)XynB基因的豬新品種(系）。
[0005] 抵抗素樣分子0 (resistin-like molecule 0 )又稱發(fā)現(xiàn)于炎癥帶2 (Found in inflammatory zone 2, FIZZ2)，目前其相關(guān)研究主要集中在人類，生物學(xué)功能與腸管上 皮細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、腸道免疫應(yīng)答緊密相關(guān)，是研究腸道疾患及其靶向生物治療的新靶 標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，RELMP基因高度表達(dá)于腸道組織。而RELMP基因啟動(dòng)子是其高度表達(dá)于 腸道的關(guān)鍵，相關(guān)研究表明，RELMP基因啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)腸上皮特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。人 和豬同源性非常高，因此豬RELMP基因的生物學(xué)功能和啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)具有潛在的相似性。本 發(fā)明克隆得到豬RELM 0啟動(dòng)子序列，并篩選得到活性最強(qiáng)啟動(dòng)子片段，將其構(gòu)建成XynB基 因的腸道定向表達(dá)載體，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)XynB基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞系， 解決了轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)目的基因在腸道內(nèi)定向表達(dá)及其有效發(fā)揮其生物學(xué)功能的關(guān)鍵技術(shù) 問題。
[0006] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供木聚糖酶腸道定向表達(dá)載體及其細(xì)胞系，是專用于生命 科學(xué)和畜牧科研與生產(chǎn)的環(huán)保型的生物制品，可作為開展環(huán)境友好型轉(zhuǎn)基因豬研究提供必 要的生物材料及其相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)方法參考。
[0007] 技術(shù)方案木聚糖酶腸道定向表達(dá)載體，是通過以下方法構(gòu)建而成的： ⑴以原核載體pRSETA-XynB為模板，根據(jù)XynB基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物P1和P2, P1 引物5'端引入通〇 I酶切位點(diǎn)，在酶切位點(diǎn)與起始位點(diǎn)之間引入Kozak序列GCCACC，P2引 物 5' 端引入 J/7/7 I 酶切位點(diǎn)和 Myc-Tag 序列 CAGATCCTCTTCTGAGATGAGITITTGITC : P1: 5' -CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3'XhoI P2:5 ' -GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3'KpnI PCR 擴(kuò)增條件為：98°C，5min ;98°C，30s ;55°C，30s ;72°C，30s ;32 個(gè)循環(huán)；72°C，5min， PCR擴(kuò)增片段大小為678bp ; 將上述PCR終產(chǎn)物與pMD18T連接，得到克隆載體pMD18T-XynB-Myc ; ⑵將上述克隆載體pMD18T-XynB-Myc用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I雙酶切，同時(shí)用 相同限制性內(nèi)切酶雙酶切pcDNA3. 1 (-)，將酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3. 1 (-) 載體片段由T4 DNA連接酶4°C連接過夜，得到XynB真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-XynB-Myc ; ⑶根據(jù)XynB基因及GFP基因序列，設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物P3 / P4和P5 / P6,引物P3/ P4擴(kuò)增XynB-Myc，引物P5/P6擴(kuò)增GFP，P4有部分序列與GFP基因互補(bǔ)，P5有部分序列 與XynB-Myc基因片段互補(bǔ)，P6引物5'端引入終止密碼子TAA ; P3: 5' -CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3'XhoI P4: 5' -CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3' P5: 5, -GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3' P6: 5' -GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'KpnI 以pMD18T-XynB-Myc載體為模板，使用引物P3/P4,擴(kuò)增XynB-Myc片段，大小為682bp ; 以質(zhì)粒PEGFP-C3為模板，使用引物P5/P6,擴(kuò)增GFP片段，大小為768bp ; 以上述擴(kuò)增產(chǎn)物XynB-Myc片段及GFP片段為模板，用引物P3和P6,采用重疊PCR方法 將兩種組件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，該融合片段的大小為1398bp，擴(kuò)增程序?yàn)?8°C， 5min ;98°C，30s ;52°C，30s ;72°C，90s ;32 個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin ; 將上述PCR終產(chǎn)物XynB-myc-GFP片段與pMD18T在4°C條件下連接，獲得重組載體 pMD18T-XynB-myc-GFP ； ⑷將中間載體pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I雙酶切， 同時(shí)用同樣的限制性內(nèi)切酶雙酶切pcDNA3. 1 (-)，將酶切回收的XynB-myc-GFP目的 片段和pcDNA3. 1(_)載體片段采用T4 DNA連接酶4°C連接過夜，獲得真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1(-)-XynB-myc-GFP ； (5)豬RELM0基因啟動(dòng)子區(qū)目前未見報(bào)道，豬和人基因同源性極高，根據(jù)Genebank中 人RELMP基因5'側(cè)翼區(qū)序列AF352731，豬RELMP基因cDNA序列NC_010455,按照5'端 遞減原則，設(shè)計(jì)PCR正向引物P7-P12,引物5'端引入Me I酶切位點(diǎn)，反向引物P13,引物 5'端引入通〇1酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增不同長度豬RELMP啟動(dòng)子片段：
【主權(quán)項(xiàng)】
1.木聚糖酶腸道定向表達(dá)載體，是通過w下方法構(gòu)建而成的： (1) W原核載體pRSETA-XynB為模板，根據(jù)XynB基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物P1和P2, P1 引物5'端引