入ZAo I酶切位點，在酶切位點與起始位點之間引入Kozak序列GCCACC，P2引 物 5' 端引入 I 酶切位點和 Myc-Tag 序列 CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC ; P1: 5' -CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3' Xho I P2:5 ^ -GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3' Kpn I PCR 擴增條件為：98°C，5min ;98°C，30s ;55°C，30s ;72°C，30s ;32 個循環(huán)；72°C，5min， PCR擴增片段大小為678bp; 將上述PCR終產(chǎn)物與PMD18T連接，得到克隆載體pMD18T-XynB-Myc ; (2) 將上述克隆載體pMD18T-XynB-Myc用限制性內(nèi)切酶化0 I和化n I雙酶化同時用 相同限制性內(nèi)切酶雙酶切PCDNA3. 1 (-)，將酶切回收的XynB-Myc目的片段和PCDNA3. 1 (-) 載體片段由T4 DNA連接酶4°C連接過夜，得到XynB真核表達載體PCDNA3. 1-XynB-Myc ; (3) 根據(jù)XynB基因及GFP基因序列，設(shè)計PCR反應(yīng)引物P3 / P4和P5 / P6,引物P3/ P4擴增XynB-Myc,引物P5/P6擴增GFP，P4有部分序列與GFP基因互補，P5有部分序列 與XynB-Myc基因片段互補，P6引物5'端引入終止密碼子TAA ; P3: 5' -CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3' Xho I P4: 5> -CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3' P5: 5> -GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3' P6: 5' -GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3' Kpn I W pMD18T-XynB-Myc載體為模板，使用引物P3/P4,擴增XynB-Myc片段，大小為68化P ; W質(zhì)粒祀GFP-C3為模板，使用引物P5/P6,擴增GFP片段，大小為768bp ; W上述擴增產(chǎn)物XynB-Myc片段及GFP片段為模板，用引物P3和P6,采用重疊PCR方法 將兩種組件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，該融合片段的大小為1398bp，擴增程序為98C， 5min ;98°C，30s ;52°C，30s ;72°C，90s ;32 個循環(huán)；72°C，lOmin ; 將上述PCR終產(chǎn)物XynB-myc-GFP片段與pMDlST在4°C條件下連接，獲得重組載體 pMD18T-XynB-myc-GFP ； (4) 將中間載體pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性內(nèi)切酶化o I和化n I雙酶切， 同時用同樣的限制性內(nèi)切酶雙酶切PCDNA3. 1 (-)，將酶切回收的XynB-myc-GFP目的 片段和PCDNA3. 1(-)載體片段采用T4 DNA連接酶4°C連接過夜，獲得真核表達載體 pcDNAS. 1(-)-XynB-myc-GFP ； (5) 豬RELM目基因啟動子區(qū)目前未見報道，豬和人基因同源性極高，根據(jù)Genebank中 人RELM目基因5'側(cè)翼區(qū)序列AF352731，豬RELM目基因cDNA序列NC_010455,按照5'端 遞減原則，設(shè)計PCR正向引物P7-P12,引物5'端引入魁e I酶切位點，反向引物P13,引物 5'端引入ZAoI酶切位點，擴增不同長度豬RELM目啟動子片段：

(6) 上述擴增得到的RELM目s啟動子片段連接到PMD18T載體，構(gòu)建中間載體 PMD18T-RELM目S，pGL3-Enhancer載體和上述獲得的PMD18T-RELM目S分別經(jīng)Me I和 ZAoI雙酶切、凝膠回收，使用T4 DNA連接酶4°C過夜連接，將RELM目S定向克隆到英 光素酶報告基因載體pGL3-Enhancer中，利用雙酶切和測序方法，篩選構(gòu)建正確的重組 pGkRELM目S基因啟動子英光素酶報告質(zhì)粒； (7) 分別接種人胚腎293T細胞和人結(jié)腸腺癌細胞HT29于96孔板，用含有10%胎牛血 清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5% C〇2條件下培養(yǎng)，當細胞 生長至匯合率70-80%時，采用脂質(zhì)體Lipo LTX轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的pGkRELM目s-Enhancer系 列缺失片段英光素酶報告載體轉(zhuǎn)染HT29細胞，同時轉(zhuǎn)染pGL3-basic為陰性對照組，P化-TK 為內(nèi)參質(zhì)粒； 雙英光素酶活性檢測，篩選啟動子活性最高片段； (8) 雙英光素酶活性檢測結(jié)果顯示，RELM目啟動子-574?+215區(qū)域活性最強，W引物 P9和P13擴增RELM目啟動子片段并克隆到PMD18T載體上，獲得重組載體PMD18T-RELM目； 采用Me I和ZAo I進行雙酶切，凝膠回收，T4 DNA連接酶4°C過夜連接，將RELM目片 段克隆到PCDNA3. 1-XynB-myc-GFP相應(yīng)的酶切位點，獲得木聚糖酶腸道定向表達載體 PCDNA3. 1-RELM目-XynB-myc-GFP。
2. 用權(quán)利要求1所述木聚糖酶腸道定向表達載體pcDNA3. 1-RELM目-XynB-myc-GFP制 備的慢病毒載體。
3. 用權(quán)利要求1所述木聚糖酶腸道定向表達載體pcDNA3. 1-RELM目-XynB-myc-GFP制 備慢病毒載體的方法，其特征在于： 權(quán)利要求1所述重組載體PCDNA3. 1-RELM目-XynB-myc-GFP采用魁e I、1雙酶切 后經(jīng)瓊脂糖凝膠分離純化后獲取RELM目-XynB-myc-GFP,利用相同酶切方法處理pLenti4 質(zhì)粒獲取含慢病毒轉(zhuǎn)運載體序列的DM片段，將此片段與RELM目-XynB-myc-GFP連接，獲 得新的重組質(zhì)粒pLenti4-RELM目-XynB-myc-GFP，與病毒輔助質(zhì)粒pC-GP和pC-VSVG共轉(zhuǎn) 染肥K293細胞制備獲得慢病毒載體pLenti4-RELM目-XynB-myc-GFP。
4. 用權(quán)利要求1所述木聚糖酶腸道定向表達載體PCDNA3. 1-RELM目-XynB-myc-GFP轉(zhuǎn) 染豬胎兒成纖維細胞后獲得的轉(zhuǎn)基因細胞系或細胞株。
5. 用權(quán)利要求2或3所述慢病毒載體pLenti4-RELM目-XynB-myc-GFP轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖 維細胞后獲得轉(zhuǎn)基因細胞系或細胞株。
6. 用權(quán)利要求1所述木聚糖酶腸道定向表達載體PCDNA3. 1-RELM目-XynB-myc-GFP轉(zhuǎn) 染 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT29細胞檢測XynB酶蛋白活性的方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及木聚糖酶腸道定向表達載體及其細胞系，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。將XynB基因插入真核表達載體pcDNA3.1(-)，并構(gòu)建慢病毒重組載體Lanti4-blockit-RELMβ-XynB-myc-GFP，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的豬胎兒成纖維細胞，構(gòu)建腸道定向表達XynB酶蛋白的真核細胞系。為進一步開展體細胞核移植克隆轉(zhuǎn)XynB基因胚胎，培育高飼料利用率、低污染物排放的轉(zhuǎn)基因豬新品種及其相關(guān)生物學科研與生產(chǎn)領(lǐng)域提供必要的轉(zhuǎn)基因生物材料和關(guān)鍵技術(shù)體系支撐。
【IPC分類】C12N15-867, C12Q1-02, C12N15-56, C12N15-66, C12Q1-34, C12N5-10, C12N15-85
【公開號】CN104593417
【申請?zhí)枴緾N201510057829
【發(fā)明人】陳哲, 王公金, 于建寧, 徐小波
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年2月4日