當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞及其制備和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞及其制備和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前植物生物技術(shù)都以誘導(dǎo)愈傷組織、培養(yǎng)植物器官或是分離原生質(zhì)體等方法進(jìn) 行研宄，而形成層的分離培養(yǎng)方法近期才出現(xiàn)。
[0003] 愈傷組織為植物脫分化后形成的薄壁組織，但是經(jīng)過(guò)脫分化后，其次級(jí)代謝產(chǎn)物 的量與種類(lèi)都會(huì)減少，同時(shí)含有中央大液泡，在擴(kuò)大培養(yǎng)(如發(fā)酵罐培養(yǎng)等）時(shí)中央大液泡 容易碎裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡，培養(yǎng)環(huán)境苛刻。
[0004] 植物的器官培養(yǎng)一般包括植物根或是芽的培養(yǎng)，保持了植物的體細(xì)胞的一些狀 態(tài)，相對(duì)于愈傷組織而言，次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量較多，但由于其易分化成為植物個(gè)體，導(dǎo)致 其不能較好的用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0005] 植物的原生質(zhì)體不含有細(xì)胞壁，細(xì)胞較為脆弱，對(duì)滲透壓，pH等要求特別嚴(yán)格，一 般用于轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)，再用于植株再生，很難用于工業(yè)生產(chǎn)中。
[0006] 由于形成層分生組織擁有無(wú)限增殖的特征，因而被稱(chēng)為"植物干細(xì)胞"。形成層細(xì) 胞系的分離和擴(kuò)大培養(yǎng)在近期才出現(xiàn)，2010年11月，NatureBiotechnology中刊登了一篇 名為〈〈Culturedcambialmeristematiccellsasasourceofplantnaturalproducts)) 的文章，成功的分離擴(kuò)大了紅豆杉的形成層干細(xì)胞系。這種未脫分化細(xì)胞的細(xì)胞活性以及 次級(jí)代謝產(chǎn)物含量較愈傷組織多100倍以上，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有大量小液泡結(jié)構(gòu)，在工業(yè)生 產(chǎn)中具有更大的優(yōu)勢(shì)。
[0007] 在含有貯藏根的植物中，貯藏根的作用為吸收無(wú)機(jī)鹽貯存養(yǎng)分，含有大量的淀粉 以及較多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而植物根的形成層是通過(guò)細(xì)胞橫向分裂并分化成為根的髓部以 及韌皮部，因此貯藏根的形成層是這些植物根部增粗的主要組織。但是在生長(zhǎng)過(guò)程中貯藏 根中含有大量的內(nèi)生菌與共生菌。所以在作為外植體培養(yǎng)組織時(shí)需要進(jìn)行深度滅菌來(lái)減少 組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染。
[0008] 國(guó)際專(zhuān)利W02010/137878K0以及中國(guó)專(zhuān)利CN102459572A公開(kāi)了銀杏科的形成層 來(lái)源的植物干細(xì)胞及其分離方法提供了木本植物的形成層干細(xì)胞系的分離擴(kuò)大的方法。
[0009] 國(guó)際專(zhuān)利W02009/038416EN以及中國(guó)專(zhuān)利CN101939415A公開(kāi)了來(lái)自靜止中心 的植物干細(xì)胞系及其分離方法。
[0010] 國(guó)際專(zhuān)利W02009/038417EN以及中國(guó)專(zhuān)利CN101939414A公開(kāi)了將來(lái)自具有儲(chǔ)藏 根的草本植物形成層的植物干細(xì)胞系及其分離方法，將人參、胡蘿卜等一些貯藏根植物的 干細(xì)胞進(jìn)行分離擴(kuò)大。該方法將含有貯藏根植物的根進(jìn)行切片，通過(guò)滲透壓處理，使切片中 非形成層部分死亡或是不分裂，再通過(guò)適合的培養(yǎng)基將形成層干細(xì)胞系分離并擴(kuò)大。
[0011] 目前檢測(cè)其細(xì)胞是否為干細(xì)胞的方法有通過(guò)顯微鏡檢查是否為含有大量小液泡 狀態(tài)以及對(duì)輻射或是類(lèi)輻射藥物的敏感性來(lái)確定是否為植物干細(xì)胞系。
[0012] 現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)存在以下方面，通過(guò)實(shí)際運(yùn)用，模仿關(guān)于貯藏根形成層細(xì)胞分 離方法的專(zhuān)利的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在一些當(dāng)歸屬植物中如當(dāng)歸（J/we/ica (Oliv.) Niels'),Angelicadahurica(Fisch.exHoffm. )Benth.etHook.f.exFranch.etSav)，紫花前胡（ofectfrsiFa(Miq. )Franch.etSavat)等植物中不能夠分 離出形成層干細(xì)胞系。說(shuō)明現(xiàn)有貯藏根形成層細(xì)胞分離技術(shù)方法在如上植物中不適用，需 要新的方法來(lái)處理這類(lèi)植物，以分離出形成層干細(xì)胞系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞的制備方法。
[0014] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞的培養(yǎng) 方法。
[0015] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟： 1) 外植體的選取和滅菌：取當(dāng)歸屬植物貯藏根作為外植體，清洗干凈后，再進(jìn)行滅菌處 理，使外植體的表面和內(nèi)部均無(wú)菌體存在； 2) 外植體的切片：將上述滅菌后的外植體在無(wú)菌條件下進(jìn)行切片，得外植體切片； 3) 篩選培養(yǎng)：將切片貼附于篩選培養(yǎng)基上；于4°C~30°C條件下處理16~72h，使切片中 非形成層部分的細(xì)胞不發(fā)生分裂； 所述篩選培養(yǎng)基為含有蔗糖1?6%和瓊脂7. 5~8. 5g/L的MS培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH為2 ?12 ; 4) 分離培養(yǎng)：將上述篩選培養(yǎng)后的外植體切片取出放入切片液中進(jìn)行恢復(fù)，然后再將 切片放入分離培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)形成層細(xì)胞的分裂且不使其發(fā)生脫分化，而其他組 織細(xì)胞死亡或是不分裂；培養(yǎng)6~16天后獲得初步分離出來(lái)的形成層細(xì)胞； 所述分離培養(yǎng)基為含有生長(zhǎng)素〇. 1?2mg/L、蔗糖1?6%、瓊脂7. 5~8. 5g/L的MS培養(yǎng) 基，該培養(yǎng)基pH為5.0?5.9 ; 所述生長(zhǎng)素選自二氯苯氧乙酸（2,4-D)、吲哚丁酸（IBA)、萘乙酸（NAA)和吲哚乙酸 (IBA)中至少一種； 5) 繼代培養(yǎng)：將上述分離出的形成層細(xì)胞移至繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)5?16天，然后轉(zhuǎn)移 至分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)5?16天，再轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)交替地培養(yǎng)，交替培養(yǎng)后獲 得的大量細(xì)胞中仍然含有大量小液泡結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞即為當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物 干細(xì)胞； 所述繼代培養(yǎng)基為含蔗糖1?6%、0.2~1.2mg/L2,4-0、0.01~0.51^/1激動(dòng)素〇、 0? 5~2mg/LNAA、7. 5~8. 5g/L瓊脂、0? 08~0. 12g/L活性炭的B5培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH為5. 0? 5. 9〇
[0016] 進(jìn)一步的，上述步驟1)中所述滅菌處理的具體過(guò)程為：先進(jìn)行表面滅菌，即對(duì)洗 凈的外植體依次經(jīng)乙醇溶液、次氯酸鈉溶液、升汞溶液進(jìn)行表面滅菌，清洗干凈后；再進(jìn)行 深層滅菌，即將表面滅菌后的外植體在防褐化深層滅菌液中振搖20?40min。
[0017] 進(jìn)一步的，上述防褐化深層滅菌液為含有蔗糖1?6%、青霉素100~400mg/L、鏈霉 素 100~400mg/L、頭孢霉素 100~400mg/L、多菌靈 0? 5~2g/L、L-抗壞血酸 100~400mg/L、檸檬 酸 100~400mg/L、0. 008%。~0. 020%。吐溫-20 的 1/2MS培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH為 5. 0 ?5. 9。
[0018] 進(jìn)一步的，上述步驟2)中所述外植體切片厚0. 5?2mm，含有形成層。
[0019] 進(jìn)一步的，上述步驟3)中所述篩選培養(yǎng)基的pH為2?5或8~12。
[0020] 進(jìn)一步的，上述步驟4)中所述切片液為含有蔗糖1?6%、青霉素100~400mg/L、鏈 霉素 100~400mg/L、頭孢霉素 100~400mg/L、L-抗壞血酸 100~400mg/L、檸檬酸 100~400mg/L的1/2MS培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH為5. 0?5. 9。
[0021] 進(jìn)一步的，上述步驟4)分離培養(yǎng)的培養(yǎng)條件和步驟5)中所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)條 件均為：溫度為24~26°C、濕度為50~70%。
[0022] 進(jìn)一步的，上述當(dāng)歸屬植物包括當(dāng)歸(Oliv. )Diels、白]E Angelica dahurica(Fisch.exHoffm. )Benth.etHook.f.exFranch.etSav、紫花 Angelica decursiva(Miq. )Franch.etSavat>jE|tPfAngelica laxifoliata Angelica polymorpha Angelica biserrata(ShanetYuan) YuanetShan。
[0023] 當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：將 上述方法制備的植物干細(xì)胞以濕重40~120g/L接種于液體的懸浮培養(yǎng)基中，在溫度為 23°C~27°C，轉(zhuǎn)速為100~140rpm的條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)10~25天，即可； 所述懸浮培養(yǎng)基為含1?6%蔗糖、0? 2~2mg/L2, 4-D、0. 01~0. 5mg/L激動(dòng)素KT、 0? 5~2mg/LNAA的B5培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH為5. 0~5. 9。
[0024]當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞的發(fā)酵罐培養(yǎng)方法，包括以下步驟：將上 述方法制備的植物干細(xì)胞接種于液體繼代培養(yǎng)基中，接種量為每升培養(yǎng)基中含濕重28~32g 的植物干細(xì)胞，在溫度為23°C~27°C，溶氧率為0. 20~0. 40,轉(zhuǎn)速為100~140rpm的條件培養(yǎng) 10~25 天； 所述液體繼代培養(yǎng)基為含1?6%蔗糖、0? 2~2mg/L2, 4-D、0. 01~0. 5mg/L激動(dòng)素KT、 0? 5~2mg/LNAA、0? 08~0. 12g/L活性炭的B5 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH為 5. 0~5. 9。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明提供了一種新的植物形成層干細(xì)胞的制備方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)當(dāng)歸屬植物貯藏根形 成層的植物干細(xì)胞的分離，并對(duì)其擴(kuò)大培養(yǎng)的方法進(jìn)行了研宄，提供了適應(yīng)其擴(kuò)大培養(yǎng)的 懸浮培養(yǎng)方法和發(fā)酵罐培養(yǎng)方法，這對(duì)當(dāng)歸屬植物在藥用植物組織培養(yǎng)方面提供新的制備 和培養(yǎng)方式，對(duì)當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層干細(xì)胞大量的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也為當(dāng)歸屬 植物貯藏根形成層干細(xì)胞提供了新的細(xì)胞來(lái)源。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為分離培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)歸貯藏根外植體切片的生長(zhǎng)情況，其中a為切片從篩選 培養(yǎng)基中取出并進(jìn)行分離培養(yǎng)的第1天的照片，b為分離培養(yǎng)第2天的狀態(tài)，c為分離培養(yǎng) 第4天的狀態(tài)，d為分離培養(yǎng)第6天的狀態(tài)； 圖2為繼代培養(yǎng)穩(wěn)定后，獲得的形成層干細(xì)胞系； 圖3為本發(fā)明制備的形成層干細(xì)胞與愈傷組織細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)；a為形成層干細(xì)胞的 顯微結(jié)構(gòu)，b為中性紅染色后的形成層干細(xì)胞，c為愈傷組織細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)，d為中性紅 染色后的愈傷組織細(xì)胞； 圖4為本發(fā)明制備的形成層干細(xì)胞的中性紅染色圖； 圖5愈傷組織細(xì)胞與本發(fā)明制備的形成層干細(xì)胞經(jīng)博來(lái)霉素處理后的細(xì)胞死亡率； 圖6為懸浮培養(yǎng)15天后形成層干細(xì)胞的狀態(tài)； 圖7為愈傷組織懸浮培養(yǎng)15天后的圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟： 1) 外植體的選取和滅菌：取當(dāng)歸屬植物貯藏根作為外植體，清洗干凈后，再進(jìn)行滅菌處 理，使外植體的表面和內(nèi)部均無(wú)菌體存在； 2) 外植體的切片：將上述滅菌后的外植體在無(wú)菌條件下進(jìn)行切片，得外植體切片； 3) 篩選培養(yǎng)：將切片貼附于篩選培養(yǎng)基上；于4°C~30°C條件下處理16~72h，使切片中 非形成層部分的細(xì)胞分裂不發(fā)生分裂； 4) 分離培養(yǎng)：將上述篩選培養(yǎng)后的外植體切片取出放入切片液中進(jìn)行恢復(fù)，然后再將 切片放入分離培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)形成層細(xì)胞的分裂且不使其發(fā)生脫分化，而其他組 織細(xì)胞死亡或是不分裂；培養(yǎng)6~16天后獲得初步分離出來(lái)的形成層細(xì)胞； 5) 繼代培養(yǎng)：將上述分離出的形成層細(xì)胞移至繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)5?16天，然后轉(zhuǎn)移 至分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)5?16天，再轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)交替地培養(yǎng)，交替培養(yǎng)后獲 得的大量細(xì)胞中仍然含有大量小液泡結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞即為當(dāng)歸屬植物貯藏根形成層的植物 干細(xì)胞。
[0028] 優(yōu)選的，上述外植體為當(dāng)歸屬植物一年生幼苗的直徑為0. 5?1cm含有形成層的 貯藏根。
[0029] 優(yōu)選的，上述步驟1)中所述滅菌處理的具體過(guò)程為：先進(jìn)行表面滅菌，即對(duì)洗凈 的外