聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA、基因敲除載體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA、基因敲除載體及其應(yīng)用：具體包括選擇適合CRISPR?Cas9靶向剪輯的人乳頭瘤病毒16型基因和人PD?1基因的sgRNA序列，將其與CRISPR?Cas9核酸酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HPV16+的人宮頸癌細(xì)胞、荷HPV16+移植瘤小鼠，可以明顯降低HPV16的表達(dá)，并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明制備的基因表達(dá)載體方法步驟簡(jiǎn)單、sgRNA靶向性好、CRISPR?Cas9系統(tǒng)的敲除效率高,并且不僅能夠精確靶向剪接高危型HPV16型和PD?1基因，高效降低高危型HPV16型的基因表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用還能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
【專利說(shuō)明】
聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA、基因敲除載體及 其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明屬于基因工程及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及CRISPR/Cas9特異性修飾高危型HPV16 及ro-1多個(gè)基因靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)方法，通過靶向敲除高危型HPV16的癌基因表達(dá)預(yù)防人宮頸癌， 并應(yīng)用聯(lián)合免疫基因治療策略獲得增強(qiáng)靶向剪接高危型HPV16的癌基因治療HPV16+小鼠移 植瘤的良好效果。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，基因組編輯工具廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而成簇的規(guī)律間隔的短回文 重復(fù)序列(CRISPR)技術(shù)已成為基因組編輯的熱點(diǎn)。CRISPR是自然存在于細(xì)菌DNA中的序列， 與CRISPR相關(guān)(Cas)核酸酶結(jié)合，具有指導(dǎo)RNAs保護(hù)細(xì)菌基因組免受侵入性噬菌體中檢測(cè) 到的靶向特異性序列攻擊的作用。CRISPR/Cas9技術(shù)被Nature、Science雜志分別評(píng)為2013 年前10位的明星技術(shù)之一，并位居2015年科學(xué)雜志評(píng)選出來(lái)的十大發(fā)現(xiàn)之首。該項(xiàng)技術(shù)將 成為功能基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。
[0003] 全世界每年有50多萬(wàn)的女性罹患宮頸癌，約26萬(wàn)人死于該病，成為女性患者死亡 的第二位原因。宮頸癌是少數(shù)幾個(gè)致病原因清楚的人類腫瘤之一，高危型人乳頭瘤病毒 (HPV)感染與其發(fā)生明確相關(guān)。HPV是一種極為常見的病毒，高達(dá)75%的女性在一生的某一 階段會(huì)感染HPV，大多數(shù)感染可通過自發(fā)的免疫反應(yīng)迅速清除，但少部分感染會(huì)持續(xù)，并成 為宮頸癌以及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的主要病因。高危型HPV包括HPV-16，HPV-18，HPV-31， HPV-33，HPV-45等類型。大量的流行病學(xué)資料顯示，HPV16型為目前誘發(fā)宮頸癌的高危亞型， 可在50~60%的宮頸癌組織中檢測(cè)到此型HPV，其E6和E7基因?yàn)槊鞔_的致癌基因。目前，已 有針對(duì)高危型HPV感染的預(yù)防性疫苗在發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛應(yīng)用，具有預(yù)防高危型HPV感染的效 果。但是臨床上仍然使用手術(shù)和放化療治療宮頸癌，其對(duì)中晚期宮頸癌患者的治療效果還 很不理想，而且對(duì)解除高危型HPV感染持續(xù)存在也還缺乏有效的方法和措施。因此，對(duì)人正 常宮頸上皮細(xì)胞感染高危型HPV后的病毒清除以及中晚期人宮頸癌治療都有待于出現(xiàn)新的 特異性藥物和新的治療方法。
[0004] 研究表明，人宮頸癌患者的免疫耐受涉及先天性免疫和獲得性免疫兩個(gè)環(huán)節(jié)。首 先，參與先天免疫反應(yīng)的抗原提呈細(xì)胞(APC)、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量下降，其次參與獲得 性免疫的Thl/Th2細(xì)胞平衡被打破。目前還沒有發(fā)現(xiàn)十分明確的宮頸癌特異性免疫耐受標(biāo) 志物，但研究表明，宮頸癌患者外周免疫系統(tǒng)中ro-i顯著上調(diào)。故可以從腫瘤通用的免疫調(diào) 節(jié)途徑如ro-1/PD-Li共抑制分子入手，將ro-i基因作為人宮頸癌治療的干預(yù)靶點(diǎn)。
[0005] 脂質(zhì)體是具有良好的生物相容性的傳遞載體，其表面修飾配體是構(gòu)建主動(dòng)靶向脂 質(zhì)體的重要方式。細(xì)胞穿膜肽(TAT)能夠穿過與之接觸的任何細(xì)胞的細(xì)胞膜，而對(duì)細(xì)胞膜沒 有損傷，葉酸受體存在于多種人細(xì)胞表面，包括人宮頸上皮細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞，因而可以贏 應(yīng)用設(shè)計(jì)的革G向腫瘤細(xì)胞給藥(如葉酸修飾包裹革E1向HPV 16基因的sgRNA質(zhì)粒的脂質(zhì)體)方 式抑制HPV16基因的表達(dá)，預(yù)防癌癥的發(fā)生。
[0006] 現(xiàn)在人正常宮頸上皮高危型HPV感染清除和中晚期宮頸癌治療存在的問題：（1)藥 物不能有效清除細(xì)胞內(nèi)感染的高危型HPV; (2)其他方法特異性敲除HPV E6、E7基因的效率 低，降低HPV基因表達(dá)效果較差；（3)靶向人宮頸癌的治療藥物很少，效果有限，副作用較明 顯；（4)利用多種治療方法聯(lián)合治療宮頸癌的策略需要提高治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA、基因敲除載體 及其應(yīng)用。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA，該抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA包括在 CRISPR-Cas9特異性修飾人PD-1基因中可特異性靶向人PD-1基因的sgRNA，該sgRNA的序列 如 SEQ.ID.N0.4或 SEQ.ID.N0.5所示。
[0010] 所述抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA還包括與所述可特異性靶向人H)-l基因的sgRNA 聯(lián)用的可特異性靶向高危型HPV16的sgRNA，該sgRNA的序列如SEQ.ID.N0.6、SEQ.ID.N0.7S SEQ.ID.N0.8。
[0011] 聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體，該基因敲除載體選自重組質(zhì) 粒PGL3-U6-PD1 sgl、pGL3-U6-PDl sg2中的一種，pGL3-U6-PDl sgl由序列如SEQ.ID.N0.4 所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-PDl sg2 由序列如SEQ. ID. NO. 5所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲 得，通過連接SEQ. ID. N0.4或SEQ. ID. N0.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒的多克隆位 點(diǎn)內(nèi)，或者，該基因敲除載體為構(gòu)建于用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)?；A(chǔ)上的重組質(zhì)粒，所述 用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)內(nèi)分別插入有如SEQ.ID.NO.4、SEQ. ID.N0.5所示 序列中的一種或兩種以及如SEQ. ID.NO.6、SEQ. ID.NO.7、SEQ. ID.NO.8所示序列中的一種、 兩種或二種。
[0012] 聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體組合物，該組合物包括PGL3-U6-PD1 質(zhì)粒，所述pGL3-U6-PDl質(zhì)粒選自重組質(zhì)粒pGL3-U6-PDl sgl、pGL3-U6-PDl sg2中一 種或兩種，PGL3-U6-PD1 sgl由序列如SEQ. ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性 化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-roi sg2由序列如SEQ? ID? N0? 5所示的sgRNA的寡 聚核苷酸雙鏈與線性化口613-1]6-8 81?難質(zhì)粒連接獲得，通過連接3￡〇.10.糾.4或 SEQ. 10.從).5所示序列插入至口613-1]6-881?熟質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。
[0013] 所述pGL3-U6-PDl sgl與pGL3-U6-PDl sg2的質(zhì)量比為（1~2):(1~2)。
[0014] 所述組合物還包括pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒，所述pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒選自重組 質(zhì)粒PGL3-U6-HBV16-P sg、pGL3-U6-HPV-E6 sg、pGL3-U6-HPV16-E7 sg中的一種、兩種或三 種，PGL3-U6-HBV16-P sg由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化 pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-HPV-E6 sg 由序列如SEQ ? ID ? N0 ? 7所示的 sgRNA的寡 聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-HPV-E7 sg由序列如 SEQ. ID. N0.8所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，通過 連接SEQ. ID.N0.6、SEQ. ID. N0.7或SEQ. ID. N0.8所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒的多克 隆位點(diǎn)內(nèi)。
[0015] 所述PGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒與PGL3-U6-PD1質(zhì)粒的質(zhì)量比為（1~3):(1~2);所述 PGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒采用pGL3-U6-HPV16-P sg與pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg聯(lián)用，pGL3-U6-HPV16-P sg與pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg的質(zhì)量比 為（1 ~2): (1 ~2);或者，所述pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒采用pGL3-U6-HBV16-P sg與pGL3-U6-HPV-E6 sg以及pGL3-U6-HPV16-E7 sg聯(lián)用，pGL3-U6-HPV16-P sg:pGL3-U6-HPV-E6 sg: PGL3-U6-HPV16-E7 sg的質(zhì)量比為（1~2): (1~2): (1~2)。
[0016]所述組合物還包括用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒，所述用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì) 粒:PGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒:pGL3-U6-PDl質(zhì)粒的質(zhì)量比為（1~4): (1~3): (1~2)，所述用 于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒:pGL3-U6-PDl質(zhì)粒的質(zhì)量比（1~2): (1~2)。
[0017] 上述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA在制備用于抗HPV16+人宮頸癌高 危型人乳頭瘤病毒藥物或者治療人宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
[0018] 上述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體或載體組合物在制備用于 抗HPV16+人宮頸癌高危型人乳頭瘤病毒藥物或者治療人宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0020] 本發(fā)明提出了適合CRISPR-Cas9靶向剪輯的人ro-1基因的SgRNA序列，其與適合適 合CRISPR-Cas9靶向剪輯的人乳頭瘤病毒(HPV)16型基因，可用于構(gòu)建表達(dá)抑制高危型人乳 頭瘤病毒16型基因（P、E6、E7)和人H)-l基因的sgRNA質(zhì)粒載體，共同轉(zhuǎn)入荷HPV16+移植瘤小 鼠體內(nèi)可以明顯降低HPV16的表達(dá)，并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明制備的基因表達(dá)載體方法步 驟簡(jiǎn)單、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的敲除效率高。
[0021] 本發(fā)明制備的特異性靶向高危型HPV16型和ro-1基因的SgRNA載體，不僅能夠精確 靶向剪接高危型HPV16型和ro-1基因，高效降低高危型HPV16型的基因表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用可以 明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，既顯示出免疫基因方法治療惡性腫瘤的優(yōu)效性，還將成為制備靶向 治療高危型人乳頭瘤病毒16+宮頸癌新型藥物的核心成分。
[0022] 本發(fā)明可應(yīng)用CRISPR/Cas9快速、簡(jiǎn)便、高效、特異性剪接高危型宮頸癌HPV16基因 和人PD-1基因的方法，并為將來(lái)采用葉酸與細(xì)胞穿膜肽等共修飾包裹靶向HPV16基因的 sgRNA脂質(zhì)體及其他給藥方式奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，展現(xiàn)出可能有效清除人正常宮頸上皮內(nèi)持 續(xù)存在高危型HPV16型，并能解決目前宮頸癌治療中存在問題的明顯優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明具有（1) 概念新，利用CRISPR/Cas9剪輯高危型HPV16抑制其病毒復(fù)制，繼而預(yù)防宮頸癌的發(fā)生；（2) 效率高，在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)可明顯降低E6，E7的表達(dá)，可以清除高危型HPV的感染，預(yù)防腫瘤的 發(fā)生，還可抑制腫瘤的生長(zhǎng);（3)多靶點(diǎn)，可以同時(shí)敲除修飾多個(gè)靶點(diǎn)基因的突出特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為Cas9實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切割導(dǎo)致DNA及雙鏈斷裂過程示意圖；
[0024] 圖2為sgRNA/Cas9介導(dǎo)的HPV特異性切割造成HPV16E6(a)、E7(b)表達(dá)變化情況；
[0025]圖3為MTT比色法檢測(cè)刺激指數(shù)的結(jié)果；
[0026] 圖4為觀察腫瘤及體積的變化的結(jié)果；1、對(duì)照組；2、單獨(dú)敲低PD1組;3、單獨(dú)敲低 HPV16組；4、聯(lián)合敲低PD1+HPV16組；
[0027] 圖5為用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的變化情況；1、對(duì)照組;2、單獨(dú)敲低 PD1組;3、單獨(dú)敲低HPV16組;4、聯(lián)合敲低PD1+HPV16組；
[0028] 圖6為載體PgL3-U6-sgRNA的結(jié)構(gòu)；
[0029] 圖 7 為載體 pST1374-NLS-flag-cas9_ZF 的結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。
[0031] 參見圖1，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)基因的定向識(shí)別和剪切是由sgRNA和Cas9實(shí)現(xiàn)的， sgRNA決定了 Cas9的靶向性，也決定了 Cas9的切割活性。本發(fā)明旨在應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)， 以高危型HPV16+的人宮頸癌細(xì)胞和荷HPV16+移植瘤小鼠模型為研究對(duì)象，采用靶致病基因 HPV16，以及協(xié)同靶向腫瘤免疫調(diào)節(jié)分子PD-1的基因編輯策略。首先，通過體內(nèi)外篩選針對(duì) HPV16基因的gRNA序列，實(shí)現(xiàn)HPV16基因的有效敲除;然后，通過體內(nèi)外篩選針對(duì)ro-1的gRNA 序列，通過共轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)多基因協(xié)同編輯效應(yīng)，進(jìn)而考察聯(lián)合干預(yù)不同靶點(diǎn)的治療策略是否 對(duì)HPV16+小鼠移植瘤治療具有"1 + 1>2"的協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明是采用cas9能夠?qū)崿F(xiàn)多重基因 敲除的優(yōu)勢(shì)，采取特異性靶向"單一基因"或"協(xié)同作戰(zhàn)"的方法，針對(duì)疾病的內(nèi)外因涉及的 主要分子靶點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行干預(yù)，能夠聯(lián)合發(fā)揮被動(dòng)清除病毒致癌基因和主動(dòng)免疫的治療作 用，從而為人宮頸上皮高危型HPV16基因清除和宮頸癌的有效治療提供新的策略。
[0032] 本發(fā)明在直接靶向剪接高危型HPV16基因的基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9聯(lián)合特異性 敲除HPV16和人ro-1基因的方法，對(duì)小鼠HPV16+的移植瘤實(shí)施免疫基因治療的策略。首先分 別設(shè)計(jì)和合成特異性靶向HPV16基因的sgRNAl和特異性靶向H)-l基因的sgRNA2,將sgRNAl 和sgRNA2與線性的pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接成pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PDl質(zhì)粒。 在驗(yàn)證將PGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒和pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HPV16+的Siha細(xì) 胞后可以明顯抑制HPV16基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，將pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PDl質(zhì)粒 聯(lián)合轉(zhuǎn)入荷HPV16+移植瘤的小鼠體內(nèi)，獲得高效敲除HPV16基因表達(dá)并明顯抑制移植瘤生 長(zhǎng)的效果。
[0033] 一、靶向HPV16的sgRNAl和靶向PD1的sgRNA2寡核苷酸的設(shè)計(jì)和選擇，如無(wú)特殊說(shuō) 明，文中sgRNAl是靶向HPV16的序列；sgRNA2是靶向人H)-l的序列。
[0034] 1、在HPV16基因上選擇5 ' -GGN(19)GG的序列，如果沒有5 ' -GGN(19)GG的序列，5 ' -GN(20)GG或者5'-N(21)GG也可以。ro-1基因上選擇5'-GGN(19)GG的序列，如果沒有5'-GGN (19)GG 的序列，5'-GN(20)GG 或者 5'-N(21)GG 也可以。
[0035] 2、sgRNAl在HPV16的靶向位點(diǎn)分別位于HPV16的啟動(dòng)子，E6和E7區(qū)域。sgRNA2在人 PD-1基因上的靶點(diǎn)位于基因的外顯子，這樣更容易引起片段的缺失或移框突變，從而達(dá)到 基因完全失活的目的。sgRNA2在人H)-l基因上的靶位點(diǎn)位于不同的各種剪切形式的共有外 顯子上。
[0036] 3、在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAT或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST，確定sgRNAl和sgRNA2的靶序 列是否唯一，減少潛在的脫靶位點(diǎn)。
[0037] 4、如果用針對(duì)HPV16不同區(qū)域的sgRNAl來(lái)實(shí)現(xiàn)聯(lián)合靶向HPV16基因，即可更有效的 敲低HPV基因。
[0038] 5、如果用靶向HPV16不同區(qū)域的三個(gè)sgRNAl聯(lián)合靶向人H)-l基因的sgRNA2,能更 有效的抑制小鼠體內(nèi)荷HPV16+移植瘤的生長(zhǎng)。
[0039]二、構(gòu)建sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈
[0040] 根據(jù)選擇的s gRNA 1 s和s gRNA2 s，在其5 '加上CCGG得到正向寡核苷酸 (Forwardoligo)，如果序列本身在5'端已經(jīng)有1或者2個(gè)G，那么就對(duì)應(yīng)的省略1或者2個(gè)G;根 據(jù)選擇的sgRNA，獲得其對(duì)應(yīng)DNA的互補(bǔ)鏈，并且在其5'加上AAAC得到反向寡核苷酸 (Reverse oligo);分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷 酸的forward oligo和reverse oligo成對(duì)退火。
[0041] 退火反應(yīng)體系如下： 1|:鏈0丨匕〇(丨00#，1) 2.5}.iL 負(fù)敏 0丨igo(lOOiiM) 2.5j,iL
[0042] ddH2Q 4pL NEB Buflcr ljiL
[0043] 在PCR儀中按照以下touch down程序運(yùn)行：95°C，5min; 95-85°Cat-2°C/s; 85-25°C at-〇. 1 °C/s；hold at 4°C
[0044] 退火之后形成可以連入U(xiǎn)6真核表達(dá)載體的雙鏈，序列如下：
[0045] Forward 〇1i go:5'-CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0046] Reverse oligo:NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5,〇
[0047] 三、sgRNA寡聚核苷酸質(zhì)粒的構(gòu)建
[0048] 1 ?線性化pGL3_U6_sgRNA質(zhì)粒（如圖6所不，Addgene(Cambridge ,MA,USA))酶切體 系和條件如下：2yg pGL3-U6-sgRNA(400ng/yL);lyL CutSmart Buffer ;lyL Bsal (NEB) ?補(bǔ) 水至50yL，37°C孵育3-4小時(shí)；酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)純化 回收至20-40UL滅菌水中。
[0049] 2.將退火的sgRNAl寡聚核苷酸雙鏈和退火的sgRNA2寡聚核苷酸雙鏈與線性化 pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒分別連接，獲得pGL3-U6-HBV16 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PDl質(zhì)粒。
[0050] 3 ?轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并涂Amp+平板(50iig/mL)。
[00511 4.用SEQ. ID. NO. 1的通用引物U6測(cè)序的方法鑒定陽(yáng)性克隆。
[0052] 5.37°C搖床搖菌過夜培養(yǎng)陽(yáng)性克隆并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP_MN-P-250)抽提pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PDl質(zhì)粒。
[0053] 四、轉(zhuǎn)染人宮頸癌SiHa(HPV16+)細(xì)胞
[0054] 1 ?按Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen，11668-019)的操 作手冊(cè)，將分別帶有對(duì)應(yīng)HPV16基因的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒(單獨(dú)靶 向 HPV16 啟動(dòng)子、E6 或 E7)與 pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF 質(zhì)粒（結(jié)構(gòu)如圖 7 所示，Addgene (Cambridge，MA，USA)混勻，共轉(zhuǎn)染 SiHa 細(xì)胞。
[0055] 2.為提高基因敲除效率，在靶向HPV16基因的sgRNA寡核苷酸設(shè)計(jì)、選擇和合成之 后，將靶向HPV16基因的sgRNAl寡聚核苷酸（即靶向HPV啟動(dòng)子、E6或E7的sgRNA)分別與線性 化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得含靶向HPV16啟動(dòng)子，E6和E7的sgRNA寡聚核苷酸的載體 pGL3_U6_HPVl6 sg，按如下操作轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞：按照Lipofectamine 2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手冊(cè)，分別將兩組(第一組:革E向HPV16啟動(dòng)子區(qū)的 sgRNAl-P寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-HPV16-P sg(對(duì)應(yīng)的sgRNA為序列表的SEQ.ID.N0.6) 和靶向HPV16 E6區(qū)的sgRNAl-E6寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-HPV-E6 sg(對(duì)應(yīng)的sgRNA參照 序列表中的SEQ.ID.NO. 7);第二組：靶向HPV16啟動(dòng)子區(qū)的sgRNAl-P寡聚核苷酸的載體 PGL3-U6-HPV16-P sg和靶向HPV16 E7區(qū)的sgRNAl-E7寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-HPV16-E7 sg(對(duì)應(yīng)的sgRNA參照序列表中的SEQ.ID.NO.8)，每組內(nèi)的兩種質(zhì)?；旌媳壤?:1(病人類 型不同，對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)的量也可調(diào)整），混合質(zhì)粒與pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)?；靹?，共 轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞。
[0056] 在轉(zhuǎn)染后二天，提取細(xì)胞RNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)E6、E7基因的表達(dá)。
[0058] 參見圖2,對(duì)照組(gRNA empty vector)是轉(zhuǎn)入了沒有切割活性的sgRNA載體pGL3- U6-HPV16 sg(對(duì)應(yīng)的sgRNA為3￡〇.10.勵(lì).2)，處理組是單獨(dú)（圖2&及圖213中￡637)或者聯(lián)合 加入（圖 2a 及圖 2b 中 Promoter+E6、Promoter+E7)針對(duì) HPV16 的 sgRNA 載體 pGL3-U6-HPV16 sg。用RT-PCR方法檢測(cè)單獨(dú)或者聯(lián)合sgRNAl轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，E6，E7基因的表達(dá)情況。圖2中的 Blank是不加任何質(zhì)粒的細(xì)胞，圖2結(jié)果表明：相比較空白組和對(duì)照組，單獨(dú)敲除可以有效降 低E6或E7的表達(dá)，聯(lián)合敲除相比較單獨(dú)敲除有更好的效果。
[0059]五、敲除人H)-l基因，采用MTT比色法檢測(cè)其刺激指數(shù) [0060] 1.DC細(xì)胞的制備和培養(yǎng)
[0061] (1)斷頸處死小鼠，浸沒在75%酒精消毒5min，無(wú)菌條件下分離取出小鼠兩股骨和 脛骨，剔除肌肉和筋膜，于75%酒精消毒30s，置于生理鹽水中備用；
[0062] (2)用剪刀剪去脛骨和股骨的兩端，暴露骨髓管，用10mL針筒吸取生理鹽水，分別 插入骨髓兩端，沖出骨髓于50mL離心管；
[0063] (3)于1500rpm離心10min，棄上清，沉淀加入2ml紅細(xì)胞裂解液，吹打均勻作用約 2min，再加入約40mL生理鹽水沉淀混勻終止；
[0064] (4)于lOOOrpm離心10min，棄上清，加入新鮮1640培養(yǎng)液5mL，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞量，以 lxl06mL細(xì)胞密度種入6孔培養(yǎng)板，每孔2mL;
[0065] (5)置37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，生理鹽水輕輕洗去未貼壁細(xì)胞；
[0066] (6)加入1640培養(yǎng)液，并加入1'111611-〇5?(2〇1^/111]^)，1'1111]^-4(2〇1^/11^)，非必需氨基 酸（1:100)，丙酮酸鈉（1:100)，F(xiàn)CS(10 % )，每孔約2mL，最后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天半量換 液。然后分為對(duì)照組和轉(zhuǎn)染PD-1-CRISPR/Cas9組（帶有對(duì)應(yīng)PD-1的sgRNA寡聚核苷酸的 PGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒與pST1374-NLS-f Iag-Cas9-ZF質(zhì)?；靹颍?。
[0067] 2. T淋巴細(xì)胞分離和純化
[0068] (1)無(wú)菌條件下分離出小鼠脾臟，用生理鹽水沖洗干凈，用剪刀反復(fù)剪碎，經(jīng)200目 細(xì)胞濾器過濾，去掉血管及一些結(jié)締組織，收集細(xì)胞懸液至50ml離心管；
[0069] (2)于1500rpm離心15min，棄上清，沉淀加入4ml紅細(xì)胞裂解液(NH4CI)，吹打均勻 作用約2min，再加入約40mL生理鹽水混勻終止；
[0070] (3)于lOOOrpm離心10min，棄上清，重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%FCS)備用；
[0071] (4)尼龍毛用0.2M的HCI侵泡過夜，用雙蒸水洗凈HCI，烘干后仔細(xì)撕開梳整，取約 〇. 3g均勻裝入5mL的一次性注射器，高壓滅菌；
[0072] (5)用預(yù)溫至37°C的RPMI-1640培養(yǎng)基潤(rùn)洗尼龍毛3遍，再浸潤(rùn)后置于37°C培養(yǎng)箱 靜止lh;
[0073] (6)放出注射器里的液體，立即加入2xl〇VmL細(xì)胞懸液(置于含約10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中）約2mL，再加約0.5mL含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱靜止lh; [0074] (7)收集濾液，速度控制在1滴/S，然后用預(yù)溫至37°C、含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng) 基15-20mL洗柱3遍，收集洗液，同樣速度控制在1滴/s;
[0075] (8)收集到的液體于lOOOrpm離心10min，得到的沉淀即為T淋巴細(xì)胞，將部分T細(xì)胞 凍存，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0076] 3、MTT比色法檢測(cè)刺激指數(shù)
[0077] (1)將上述凍存的T細(xì)胞復(fù)蘇，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基；
[0078] (2)取步驟（1)培養(yǎng)到第9天的DC細(xì)胞，分別用完全RPMI -164培養(yǎng)液懸浮為1 X 106 個(gè)/mL，加入絲裂霉素25yg/mL，37°C水浴30min去增殖后，用不完全RPM 1-1640培養(yǎng)液洗滌3 次，再用含10%胎牛血清的1?^1-1640完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞；
[0079] (3)按1:10、1:20、1:50的DC與T細(xì)胞比例加入96孔圓底培養(yǎng)板中，終體積為200此， 每組各設(shè)3復(fù)孔，在37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4d;
[0080] (4)培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入5mg/mL的MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2 )-2，5-二苯基四 氮唑溴鹽）15yL，繼續(xù)在37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0081 ] (5)4h后棄去全部上清（lOOOr Pmin離心5min)，每孔加入DMS0 100此，充分振蕩 10min，測(cè)定波長(zhǎng)490nm的吸光度(A)值，結(jié)果以3孔均值表示。
[0082] 參見圖3,對(duì)照組是與pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入的沒有切割活性 的 sgRNA 載體 pGL3-U6-roi sg(對(duì)應(yīng)的 sgRNA 為 SEQ.ID.N0.3，gRNA-empty vector)，處理組 是聯(lián)合加入針對(duì)H)1的sgRNA載體pGL3-U6-roi sgl和pGL3-U6-roi sg2(對(duì)應(yīng)的sgRNA為 SEQ? ID? NO? 4和SEQ? ID ? NO? 5，gRNA-PDl-(sgl+sg2)組，1:1，病人類型不同，對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)的量 也可調(diào)整），以及僅加一種針對(duì)PD1的sgRNA載體pGL3-U6-PDl sgl(gRNA-PDl-sgl組）或 PGL3-U6-PD1 sg2(gRNA-PDl-sg2組）。在同一靶效比的條件下，CRISPR/Cas9-PD1 組DC刺激T 淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組。
[0083] 六、建立小鼠荷HPV16+移植瘤模型，觀察聯(lián)合靶向剪接HPV16和PD1基因抑制腫瘤 的效果
[0084] 1、建立小鼠荷HPV16+移植瘤模型
[0085]培養(yǎng)小鼠TC-1細(xì)胞，按每個(gè)注射點(diǎn)2X106個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種Balb/c小鼠背部皮 下，總共20只。
[0086] 2、分組體內(nèi)聯(lián)合免疫基因治療實(shí)驗(yàn)
[0087] 待移植瘤長(zhǎng)至2謹(jǐn)3大小，將其分為分為4組，即對(duì)照組、敲低HPV16組、敲低PD1組以 及聯(lián)合敲低TO1+HPV16組。采用電穿孔注射靶向HPV16和人roi基因質(zhì)粒的方法，每組給的劑 量分別為對(duì)照組：40yg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+20yg空gRNA;敲低HPV16組：40yg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10yg pGL3-U6-HPV16-P sg+lOyg pGL3-U6-HPV16-E6 sg+lOy g PGL3-U6-HPV16-E7 sg;單獨(dú)敲除人 PD1 組：40yg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10yg PGL3-U6-PD1 sgl + lOyg pGL3-U6-PDl sg2;聯(lián)合敲低PD1+HPV16組：40辟。51'1374，1^-flag-Cas9-ZF+10ygpGL3-U6-HPV16-Psg+10ygpGL3-U6-HPV16-E6sg+10ygpGL3-U6-HP16V-E7+10yg pGL3-U6-PDl sgl+lOyg pGL3-U6-PDl sg2。
[0088] 3、觀察移植瘤生長(zhǎng)與HPV16基因表達(dá)改變
[0089] 于給藥后3d/7d/14d分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑制瘤大?。?次），計(jì)算、觀察移植瘤變 化情況，在給藥后于22d脫白處死小鼠，稱量移植瘤，并測(cè)定HPV16E6和E7基因的表達(dá)改變。 參見圖4，相比較于對(duì)照組，單獨(dú)敲除roi或HPV有很好的效果;聯(lián)合敲除HH+HPV相比較對(duì)照 組和單獨(dú)敲除組有更好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
[0090] 4、測(cè)定CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化
[0091]處死小鼠時(shí)留取其脾細(xì)胞，分離淋巴細(xì)胞；調(diào)整收集的淋巴細(xì)胞密度至3 X106/ mL，取lyg anti-⑶8-FITC對(duì)應(yīng)106細(xì)胞，冰浴、避光染色30min后，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定⑶8+T 細(xì)胞數(shù)量變化。參見圖5,相比較于對(duì)照組和單獨(dú)敲除組，聯(lián)合敲除PD1+HPV可以顯著提高體 內(nèi)⑶8+T細(xì)胞的數(shù)量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA，其特征在于：該抑制高危型HPV表達(dá)的 sgRNA包括在CRISPR-Cas9特異性修飾人ro-Ι基因中可特異性靶向人ro-Ι基因的sgRNA，該 sgRNA 的序列如 SEQ.ID.NO .4或 SEQ.ID.NO .5所示。2. 如權(quán)利要求1所述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA，其特征在于:所述抑制 高危型HPV表達(dá)的sgRNA還包括與所述可特異性靶向人Η)-1基因的sgRNA聯(lián)用的可特異性靶 向高危型 HPV16 的 sgRNA，該 sgRNA 的序列如 SEQ.ID.N0.6、SEQ.ID.N0.7SSEQ.ID.N0.8。3. 聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體，其特征在于:該基因敲除載體選 自重組質(zhì)粒pGL3-U6-roi sgl、pGL3-U6-PDl sg2中的一種，pGL3-U6-PDl sgl 由序列如 SEQ · ID · N0 · 4所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-PD1 sg2由序列如SEQ. ID. NO. 5所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA 質(zhì)粒連接獲得，通過連接SEQ. ID. NO. 4或SEQ. ID. NO. 5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒 的多克隆位點(diǎn)內(nèi)，或者，該基因敲除載體為構(gòu)建于用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)?；A(chǔ)上的重 組質(zhì)粒，所述用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)內(nèi)分別插入有如SEQ. ID. N0.4、 SEQ·ID·N0·5所示序列中的一種或兩種以及如SEQ·ID·N0·6、SEQ·ID·N0·7、SEQ·ID·N0·8所 示序列中的一種、兩種或三種。4. 聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體組合物，其特征在于:該組合物包 括PGL3-U6-PD1 質(zhì)粒，所述pGL3-U6-PDl質(zhì)粒選自重組質(zhì)粒pGL3-U6-roi sgl、pGL3-U6-PDl sg2中一種或兩種，pGL3-U6-rolsgl由序列如SEQ.ID.N0.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈 與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-PDlsg2由序列如SEQ · ID · NO · 5所示的 sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，通過連接SEQ. ID.NO. 4或 SEQ. 10.從).5所示序列插入至?61^3-1]6-881?熟質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。5. 如權(quán)利要求4所述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體組合物，其特征 在于：所述PGL3-U6-PD1 sgl與pGL3-U6-PDl sg2的質(zhì)量比為（1~2):(1~2)。6. 如權(quán)利要求4所述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體組合物，其特征 在于：所述組合物還包括pGL3-U6-HPV16sg質(zhì)粒，所述pGL3-U6-HPV16sg質(zhì)粒選自重組質(zhì)粒 PGL3-U6-HBV16-P sg、pGL3-U6-HPV-E6 sg、pGL3-U6-HPV16-E7 sg中的一種、兩種或三種， PGL3-U6-HBV16-P sg由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-HPV-E6sg由序列如SEQ·ID·N0·7所示的sgRNA的寡聚核 苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-HPV-E7 sg由序列如 SEQ. ID. N0.8所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，通過 連接SEQ. ID.NO. 6、SEQ. ID. N0.7或SEQ. ID. N0.8所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒的多克 隆位點(diǎn)內(nèi)。7. 如權(quán)利要求6所述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體組合物，其特征 在于：所述PGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒與pGL3-U6-roi質(zhì)粒的質(zhì)量比為（1~3): (1~2);所述 PGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒采用pGL3-U6-HPV16-P sg與pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg聯(lián)用，pGL3-U6-HPV16-P sg與pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg的質(zhì)量比 為（1 ~2): (1 ~2);或者，所述pGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒采用pGL3-U6-HBV16-P sg與pGL3-U6-HPV-E6 sg以及pGL3-U6-HPV16-E7 sg聯(lián)用，pGL3-U6-HPV16-P sg:pGL3-U6-HPV-E6 sg: PGL3-U6-HPV16-E7 sg的質(zhì)量比為（1~2): (1~2): (1~2)。8. 如權(quán)利要求4或6所述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體組合物，其 特征在于:所述組合物還包括用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒，所述用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì) 粒:PGL3-U6-HPV16 sg質(zhì)粒:pGL3-U6-PDl質(zhì)粒的質(zhì)量比為（1~4): (1~3): (1~2)，所述用 于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒:pGL3-U6-PDl質(zhì)粒的質(zhì)量比（1~2): (1~2)。9. 如權(quán)利要求1或2所述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的sgRNA在制備用于抗HPV16 +人宮頸癌高危型人乳頭瘤病毒藥物或者治療人宮頸癌藥物中的應(yīng)用。10. 如權(quán)利要求4、6或8所述聯(lián)合免疫基因抑制高危型HPV表達(dá)的基因敲除載體組合物 在制備用于抗HPV16+人宮頸癌高危型人乳頭瘤病毒藥物或者治療人宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105821040SQ201610134003
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年3月9日
【發(fā)明人】甄帥, 李旭, 趙樂, 羅文娟
【申請(qǐng)人】李旭