專利名稱：一種病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法包括基于血清學(xué)對(duì)病原體抗體的檢測(cè)，和分子檢測(cè)方法、如對(duì)病原體核酸的檢測(cè)。通過酶聯(lián)免疫方法對(duì)病原體抗體的檢測(cè)有一定優(yōu)點(diǎn)，如特異性好，重復(fù)性高等，但是該方法不能用于診斷活動(dòng)性的與慢性的感染。自核酸檢測(cè)方法建立后，該缺點(diǎn)得到了解決，核酸檢則方法是直接對(duì)病原體的核糖核酸或脫氧核糖核酸的檢測(cè)，無論是在定性或者定量方法都有一定的優(yōu)勢(shì)。盡管核酸檢則方法具有高靈敏度、高特異性的優(yōu)點(diǎn)， 但是它們需時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高，而且需要特殊的儀器用需要專業(yè)的培訓(xùn)。因此，人們?nèi)匀恍枰獙ふ铱焖?、靈敏、低成本、操作簡(jiǎn)易的檢測(cè)工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的病原體檢測(cè)方法中存在的不足，提供一種病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡，該檢測(cè)卡結(jié)合了多重檢測(cè)病原體的核酸等溫鏈置換方法和納米膠體金技術(shù)，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的操作技術(shù)負(fù)責(zé)、耗時(shí)長(zhǎng)、需要特殊儀器等缺陷。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明結(jié)合膠體金標(biāo)記核酸的技術(shù)，核酸等溫鏈置換技術(shù)，多重檢測(cè)病原體核酸，通過待檢測(cè)模板誘導(dǎo)的核酸等溫鏈置換方法形成大量的用于檢測(cè)的帶標(biāo)志的雙鏈混合物，通過在硝酸纖維素膜上包被不同的檢測(cè)用核酸，鏈霉親和素，分別形成檢測(cè)線和質(zhì)控線，最終得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明所述病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡涉及的等溫鏈置換核酸檢測(cè)方法包括具有通過核酸比對(duì)后合成的特異性發(fā)夾結(jié)構(gòu)，特異性發(fā)夾結(jié)構(gòu)為5’端巰基標(biāo)志，3’端生物素標(biāo)志，5’端巰基標(biāo)志用于與膠體金偶聯(lián)，3’端生物素標(biāo)志用于檢測(cè)時(shí)于質(zhì)控線的鏈霉親和素結(jié)合，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)可與待檢病原體核酸互補(bǔ)配對(duì)，配對(duì)后打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)。當(dāng)待檢測(cè)病原體核酸存在時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被打開，通過等溫鏈置換方法形成帶標(biāo)簽的雙鏈混合物 (見圖1)。因待檢測(cè)病原體核酸在檢測(cè)過程中未被擴(kuò)增，所以本試紙條具有防止實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增物交叉污染，防止假陽性的優(yōu)點(diǎn)。具體地，一種病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡，從左到右依次為固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；該膠體金檢測(cè)卡標(biāo)記有可以識(shí)別待檢病原體核酸特定序列的分子探針的納米金顆粒；所述分子探針為一段可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，其5’端與3’端互補(bǔ)配對(duì)形成徑結(jié)構(gòu)，突起的環(huán)識(shí)別待檢病原體核酸特定序列，5’端標(biāo)記了巰基，還含有延伸引物，3’端標(biāo)記了生物素；所述納米金顆粒的粒徑為25 40nm。作為一種優(yōu)選方案，所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜、吸水紙之間的相鄰部分彼此重疊廣5mm。作為一種優(yōu)選方案，所述硝酸纖維素膜同時(shí)包被有檢測(cè)線用核苷酸序列、一條質(zhì)控線用鏈霉親和素。作為一種優(yōu)選方案，所述質(zhì)控線和檢測(cè)線相距3mm。本發(fā)明所述病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡在檢測(cè)線上包被了四條用于檢測(cè)乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒、梅毒等病原體核酸的核酸序列，質(zhì)控線包被有鏈霉親和素；在檢測(cè)卡加樣的一端固定有經(jīng)特殊樣品墊處理液處理的樣品墊。經(jīng)收集、處理后的病人血液樣品先用于核酸抽提，然后與膠體金顆粒標(biāo)志的發(fā)夾結(jié)構(gòu)混合物混合，在酶的作用下進(jìn)行核酸等溫鏈置換反應(yīng)，形成用于檢測(cè)卡檢測(cè)用的帶標(biāo)簽的雙鏈混合物。雙鏈混合液依靠毛細(xì)管作用在檢測(cè)卡的纖維素膜上向檢測(cè)線方向側(cè)向?qū)游?，?dāng)病人樣品中存在病原體核酸時(shí)， 帶標(biāo)簽的雙鏈混合物在運(yùn)行至檢測(cè)線時(shí)，與檢測(cè)線上出現(xiàn)一條紅色色帶，結(jié)果為陽性。如果樣品中沒有病原體核酸時(shí)，在檢測(cè)區(qū)便沒有紅色線條出現(xiàn)，結(jié)果為陰性。質(zhì)控線在檢測(cè)樣品時(shí)均應(yīng)出現(xiàn)紅色色帶，質(zhì)控線的出現(xiàn)表示檢測(cè)試紙條工作正常。本發(fā)明所述多重檢測(cè)乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒、梅毒等核酸的病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡為特異性在硝酸纖維素膜上包被不同的檢測(cè)用核酸和鏈霉親和素。本發(fā)明所述病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡主要應(yīng)用了多重檢測(cè)病原體核酸的等溫鏈置換方法，該方法主要為一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)為5’端巰基標(biāo)志，3’端生物素標(biāo)志，5’端巰基標(biāo)志用于與膠體金偶聯(lián)，3’端生物素標(biāo)志用于檢測(cè)時(shí)于質(zhì)控線的鏈霉親和素結(jié)合，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)可與待檢測(cè)?；パa(bǔ)配對(duì)，配對(duì)后打開徑環(huán)結(jié)構(gòu)，在帶標(biāo)志的引物， DNIPs，Klen0W聚合酶作用下作等溫鏈置換反應(yīng)，后形成大量的用于檢測(cè)的帶標(biāo)志的雙鏈混合物。本發(fā)明所述病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡可以用于多重檢測(cè)乙肝病毒核酸、丙肝病毒核酸、人免疫缺陷病毒核酸和梅毒核酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明快速、簡(jiǎn)單、不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易變，適合基層檢測(cè)， 對(duì)多重檢測(cè)乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒、梅毒等核酸、對(duì)輸血前，輸血后的檢測(cè)起到重要的作用；
因本發(fā)明在檢測(cè)過程中沒有擴(kuò)增病原體核酸，所以可以有效防治實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增交叉污染，防治假陽性。


圖1為顯示試紙條整體結(jié)構(gòu)示意圖2為顯示試紙條檢測(cè)樣品效果圖，其中^為無冊(cè)￥，!1(^，!11￥3 的檢測(cè)結(jié)果(陰性)， B為含有HBV，HCV，HIV, TP的檢測(cè)結(jié)果(陽性)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。本發(fā)明所述應(yīng)用多重檢測(cè)病原體核酸的等溫鏈置換技術(shù)制得
1、乙肝病毒檢測(cè)用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列如SEQ ID NO: 1所示，延伸引物如SEQ ID NO: 2所示， 檢測(cè)用T線對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
丙肝病毒檢測(cè)用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列如SEQ ID N0:4所示，延伸引物如SEQ ID N0:5所示，檢測(cè)用T線對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。人免疫缺陷病毒檢測(cè)用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列如SEQ ID N0:7示，延伸引物如SEQ ID NO:8 示，檢測(cè)用T線對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如SEQ ID N0:9示。梅毒病毒檢測(cè)用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列如SEQ ID NO: 10延伸引物如SEQ ID NO: 11檢測(cè)用 T線對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。2、等溫鏈置換體系 待檢測(cè)模板 Iul 發(fā)夾結(jié)構(gòu)2ul 引物(IOuM) Iul Klenow 酶 0. 5ul dNTPs(IOmM) 0. 5ul buffer (IOX) 2. 5ul ddH20 17. 5ul
42 °C 30min
2、所述病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡的制備 1.納米金(膠體金)的制備
在500ML的圓底燒瓶中加入IOOml 0. 01%的HAuCL4溶液，磁力攪拌加熱至沸騰；然后向上述溶液中加入anl 1%枸櫞酸鈉，溶液變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，停止加熱繼續(xù)攪拌15min ；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度值鑒定。2.膠體金試紙條的組裝
將標(biāo)志有檢測(cè)用T線，質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸水紙、結(jié)玻璃纖維、樣品墊依次固定于PVC板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經(jīng)切割成寬4mm后即得到本發(fā)明所述的免疫層析膠體金檢測(cè)卡。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
(1) C線(質(zhì)控線)出現(xiàn)紅色的線證明膠體金試紙條有效。(2) T線(檢測(cè)線)出現(xiàn)紅色的線與否，是陽性陰性判別的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
(1)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陽性；
(2)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陰性； (2) C線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明納米生物傳感器失效(圖2)。
權(quán)利要求
1.一種病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡，其特征在于所述檢測(cè)卡從左到右依次為固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；該病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡標(biāo)記有可以識(shí)別待檢病原體核酸序列的分子探針的納米金顆粒；所述分子探針為一段可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，其5’端與3’端互補(bǔ)配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，突起的環(huán)識(shí)別待檢病原體核酸特定序列，5’端標(biāo)記了巰基，還含有延伸引物，3’端標(biāo)記了生物素；所述納米金顆粒的粒徑為25 40nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡，其特征在于所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜、吸水紙之間的相鄰部分彼此重疊廣5mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡，其特征在于所述硝酸纖維素膜同時(shí)包被有檢測(cè)線用核苷酸序列、一條質(zhì)控線用鏈霉親和素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡，其特征在于所述質(zhì)控線和檢測(cè)線相距3mm。
5.權(quán)利要求廣4中任意一條權(quán)利要求所述病原體核酸的等溫鏈多重檢測(cè)卡在多重檢測(cè)乙肝病毒核酸、丙肝病毒核酸、人免疫缺陷病毒核酸和梅毒核酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種病原體核酸的等溫鏈置換多重檢測(cè)卡。本發(fā)明所述病原體核酸的等溫鏈置換多重檢測(cè)卡利用了核酸等溫鏈置換方法與膠體金檢測(cè)技術(shù)制備得到的檢測(cè)卡，可以多重檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA、丙型肝炎病毒RNA、人免疫缺陷病毒RNA、梅毒蒼白螺旋體DNA。本發(fā)明病原體核酸的等溫鏈置換多重檢測(cè)卡是一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的檢測(cè)卡，因待檢病原體核酸在檢測(cè)過程中未被擴(kuò)增，所以該檢測(cè)卡具有防止實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增物交叉污染、防止假陽性的優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)、檢驗(yàn)檢疫、傳染病控制、生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的病原體核酸檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102230032SQ20111017506
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者何秀華, 方志遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:廣州弗賽生物科技有限公司