專利名稱：使用對(duì)照物測(cè)定核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用特異性對(duì)照核酸進(jìn)行靶核酸鑒定的方法，一種使用引物和特異性對(duì)照核酸擴(kuò)增所述靶核酸部分序列的方法以及含有所述對(duì)照核酸的試劑盒。
背景技術(shù)：
核酸的鑒定在分析化學(xué)中已成為一種重要的工具，特別是在保健中。例如，在個(gè)體來源的樣品中存在一定數(shù)量指示疾病或體質(zhì)的核酸的基礎(chǔ)上容易鑒定出感染的疾病和遺傳體質(zhì)。為此，利用核酸，優(yōu)選寡核苷酸，與指示那種疾病或遺傳體質(zhì)的靶核酸序列特異性雜交建立了各種方法。靈敏的技術(shù)如分支DNA方法(美國專利Nos.5,681,702，5,597,909，5,545,730，5,594,117，5,591,584，5,571,670，5,580,731，5,571,670，5,591,584，5,624,802，5,635,352，5,594,118，5,359,100，5,124,246和5,681,697)，或檢測(cè)在生物體中高拷貝數(shù)存在的rRNA靶核酸的方法(Ep0272009)，都可以直接用來檢測(cè)那種生物體來源樣品中的靶核酸。但是有許多靶核酸在生物體中存在的量非常低，以至于不可能從該生物體得到的樣品中直接檢測(cè)。這樣的靶核酸需要在檢測(cè)前擴(kuò)增。適用的擴(kuò)增方法可以是例如LCR(美國專利Nos.5,185,243，5,679,524和5,573,907；EP 0 320 308 B1；WO90/01069；WO89/12696；和WO89/09835)，循環(huán)探針技術(shù)(美國專利Nos.5,011,769，5,403,711，5,660,988，和4,876,187，和PCT公開申請(qǐng)WO95/05480，WO95/1416，和WO95/00667)，侵入物TM技術(shù)(技術(shù)專利Nos.5,846,717；5,614,402；5,719,028；5,541,311；和5,843,669)，Q-Beta復(fù)制酶技術(shù)(美國專利No 4,786,600)，NASBA(美國專利No.5,409,818；EP～0 329 822)，TMA(美國專利Nos.5,399,491，5,888,779，5,705,365，5,710,029)，SDA(美國專利Nos.5,455,166和5,130,238)和PCR(US-A-4,683,202)。
為將核酸檢測(cè)的錯(cuò)誤結(jié)果降至最低，幾個(gè)國家的權(quán)威要求使用對(duì)照核酸。特別是使用擴(kuò)增方法時(shí)，這種對(duì)照核酸是十分重要的，因?yàn)榉磻?yīng)條件可強(qiáng)烈影響擴(kuò)增過程，從而得到錯(cuò)誤的結(jié)果。有時(shí)抑制物質(zhì)也包含在樣品中，其可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。
一般情況下，可以區(qū)別外部對(duì)照和內(nèi)部對(duì)照。外部對(duì)照，如經(jīng)典的陽性和陰性對(duì)照經(jīng)常用于檢測(cè)試驗(yàn)是正確進(jìn)行還是摻入了污染物。內(nèi)部對(duì)照舉例來說可以用于識(shí)別樣品中可能含有的抑制物質(zhì)，或者能在定量測(cè)試中作為定量標(biāo)準(zhǔn)。與通常在獨(dú)立的反應(yīng)室內(nèi)測(cè)定的外部對(duì)照相反，內(nèi)部對(duì)照優(yōu)選與待分析物一起在同一個(gè)反應(yīng)室內(nèi)孵育。所以，對(duì)照或?qū)φ盏臄U(kuò)增產(chǎn)物必須能夠與待分析物或待分析物的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開。當(dāng)使用一種擴(kuò)增方法時(shí)，內(nèi)部對(duì)照核酸基本與靶核酸在相同反應(yīng)條件下共擴(kuò)增。這些條件包括試劑濃度，溫度，抑制劑濃度或酶活性。經(jīng)常使用的對(duì)照序列來源于管家基因(見Chelly等(1990)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem)187；691-698；Mallet等.(1995)臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol)，333201-3208)，但是也使用非天然的序列(Resnard等(1995)臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol)32.1887-1893；Gilliland等(1990)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)872725～2729；Wang等(1989)美國國家科學(xué)院院干Proc.Natl，Acad.Sci.USA)9717-9721)。
內(nèi)部對(duì)照來源的擴(kuò)增核酸與靶核酸來源的擴(kuò)增核酸能夠區(qū)別開，例如通過它們不同的長度或與特殊探針的雜交能力(見Clementi等(1990)PCT方法應(yīng)用(PCRMethods Applic)2191-196；Clementi等(1995)病毒手冊(cè)(Arch.Virol.)1401523-1539)。在任何情況下，內(nèi)部對(duì)照的核苷酸序列與靶核酸序列是部分或全部不同的。因?yàn)楹怂岬男蛄泻烷L度決定它的GC含量，二級(jí)結(jié)構(gòu)和熔解溫度，所以，對(duì)其在雜交反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)中的表現(xiàn)很重要。幾乎在所有情況下，一個(gè)內(nèi)部對(duì)照的不同序列導(dǎo)致該對(duì)照核酸與靶核酸具有不同的表現(xiàn)。與此相反，為正確監(jiān)測(cè)反應(yīng)，一個(gè)理想的內(nèi)部對(duì)照應(yīng)該精確地模仿靶核酸。
擴(kuò)增反應(yīng)中一個(gè)最重要的方面是引物與靶核酸的結(jié)合。所以，使用與靶核酸具有相同引物結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)部對(duì)照(例如見Gilliland等(1990)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87；2725-2729；Wang等(1989)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9717-9721；US5,219,727)。這樣可能引起與引物的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，并且可能降低實(shí)驗(yàn)的靈敏度。
Gilliland等人(1990)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87；2725-2729敘述了與靶核酸具有幾乎相同核苷酸序列的內(nèi)部對(duì)照，但包含一個(gè)新的限制性酶切位點(diǎn)，或含有靶核酸不具備的內(nèi)含子區(qū)序列。由于內(nèi)部對(duì)照與靶核酸非常高的同源性，這兩種核酸及其擴(kuò)增物可以互相雜交。根據(jù)所用檢測(cè)方法，可導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果，特別是在定量實(shí)驗(yàn)中。而且，所述方法需要精細(xì)的技術(shù)，如對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶消化和瓊脂糖凝膠電泳。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種改進(jìn)的鑒定核酸的方法，尤其是避免已知方法中所有或部分的不足。
發(fā)明概述本發(fā)明主要目的是提供與靶核酸的屬性相似的核酸，包括長度，G/C含量，二級(jí)結(jié)構(gòu)和折疊動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，以及更多方面，而該核酸能根據(jù)它們的序列與各自靶核酸輕易地區(qū)分開。為實(shí)現(xiàn)該目的，構(gòu)建一個(gè)序列，其基本上包括所述待測(cè)靶核酸區(qū)域或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)鏈，且其至少部分與靶核酸鏈平行互補(bǔ)或與其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。多數(shù)情況下，對(duì)照核酸序列的一個(gè)或幾個(gè)平行互補(bǔ)部分可從短鏈，例如至少8個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少10個(gè)核苷酸，延伸至待測(cè)靶核酸的全長。本發(fā)明中優(yōu)選的平行互補(bǔ)部分包括探針結(jié)合位點(diǎn)序列。
另一優(yōu)選方面，尤其是待測(cè)靶核酸區(qū)被擴(kuò)增用于鑒定時(shí)，本發(fā)明中對(duì)照核酸也可包括引物結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)與靶核酸區(qū)各自的引物結(jié)合位點(diǎn)平行互補(bǔ)。
這種對(duì)照核酸可用于例如雜交和擴(kuò)增方法中作為內(nèi)部對(duì)照，所以在化學(xué)分析和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中很有用。
本發(fā)明還涉及擴(kuò)增樣品中靶核酸序列的方法，包括步驟擴(kuò)增所述靶核酸區(qū)和已知量的對(duì)照核酸，所述對(duì)照核酸基本上包含所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，從而所述基本上包含所述待擴(kuò)增靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)區(qū)的對(duì)照核酸序列包括至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
涉及擴(kuò)增方法，這種對(duì)照核酸具有額外的優(yōu)點(diǎn)。如果這些核酸的引物結(jié)合位點(diǎn)與靶核酸的引物結(jié)合位點(diǎn)平行互補(bǔ)，那么這些對(duì)照與結(jié)合到靶核酸的引物特性相近，盡管引物結(jié)合位點(diǎn)的序列和對(duì)照核酸的引物區(qū)別于靶核酸的引物。避免了靶核酸與對(duì)照擴(kuò)增引物的競(jìng)爭(zhēng)，提高了實(shí)驗(yàn)的靈敏度和線性范圍。
所述的對(duì)照可以用在任何用于鑒定核酸的雜交和擴(kuò)增方法中。可根據(jù)是否需要一個(gè)反應(yīng)待測(cè)靶核酸特征的對(duì)照，來決定是否使用本發(fā)明的對(duì)照核酸，該對(duì)照可單獨(dú)被檢測(cè)出。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1顯示一例核苷酸序列及其平行互補(bǔ)序列，以及它們形成相似二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力。(QS在定量或定性實(shí)驗(yàn)中所用對(duì)照核酸)圖2顯示使用Mfold 3.0版(copyright 1996 Dr.M.Zuker，M.Zuker，D.H.Mathews & D.H.Turner，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的算法和熱動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Algorithmsand Thermodynamics for RNA Secondary Structure PredictionA Practical Guide)，RNA生物化學(xué)和生物技術(shù)(In RNA Biochemistry and Biotechnology)，J.Barciszewski &B.F.C.Clark編著，NATO ASI系列，Kluwer Academic Publishers，(1999))對(duì)探針ST650(HCV-特異性探針)，ST650pc(與ST650平行互補(bǔ))和ST2535(不相關(guān)序列)進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。
圖3顯示使用Mfold3.0版對(duì)引物ST280(HCV-特異性)，ST280pc(與ST280平行互補(bǔ))，ST778(HCV特異性)和ST778pc(與ST778平行互補(bǔ))進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。
圖4顯示使用Mfold3.0版對(duì)HCV-擴(kuò)增子，QS(pc)HCV-擴(kuò)增子(與HCV-擴(kuò)增子平行互補(bǔ))和QSHCV-擴(kuò)增子(含有一個(gè)拼湊(Scrambled)核苷酸序列，一個(gè)ST2535探針結(jié)合序列，一個(gè)ST280和ST778引物結(jié)合位點(diǎn)的對(duì)照擴(kuò)增子，且與HCV-擴(kuò)增子長度相同)進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。
圖5顯示來源于不同的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)QSHCV-擴(kuò)增物(Seq.ID No.14)和QS(pc)HCV-擴(kuò)增物(Seq.ID No.13)的擴(kuò)增核酸與HCV-1b擴(kuò)增產(chǎn)物比較的退火曲線。
發(fā)明詳述本發(fā)明主要基于以下發(fā)現(xiàn)相較于該第一核酸序列，具有與另一第二核酸序列平行互補(bǔ)序列的第一核酸具有非常相似的雜交屬性，該屬性取決于它的長度，GC含量，Tm和二級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管序列是徹底不同的。這樣的核酸可作為對(duì)照核酸用于靶核酸測(cè)定，因?yàn)閷?duì)照核酸和靶核酸及其擴(kuò)增物具有非常相似的雜交性質(zhì)，但仍可根據(jù)它們不同的序列而分別檢測(cè)出來。
本發(fā)明優(yōu)選的對(duì)照核酸基本上包括待測(cè)靶核酸的區(qū)，特征在于基本包括所述待測(cè)靶核酸的區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的所述對(duì)照核酸的區(qū)包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸，與所述靶核酸或與所述靶核酸的互補(bǔ)鏈基本上平行互補(bǔ)的序列。
本文中所述基本上包含待測(cè)靶核酸的區(qū)是指該對(duì)照核酸的該區(qū)由一個(gè)或多個(gè)部分構(gòu)成，從而每一部分的序列與待測(cè)靶核酸區(qū)的相應(yīng)部分或其互補(bǔ)鏈基本相同或基本平行互補(bǔ)。所以，對(duì)照核酸的這個(gè)區(qū)或者是基本上相同的，或者是平行互補(bǔ)的，或者是部分基本平行互補(bǔ)的，而另一部分與待測(cè)靶核酸的相應(yīng)區(qū)或與靶核酸的互補(bǔ)鏈基本相同。所以，這種對(duì)照核酸區(qū)具有與待測(cè)靶核酸區(qū)或靶核酸的互補(bǔ)鏈基本相同的雜交屬性。如果對(duì)照核酸中結(jié)合過多的基本平行互補(bǔ)和基本相同部分，則可能在二級(jí)結(jié)構(gòu)行為上發(fā)生輕微的改變，但這并不影響GC含量。為保證對(duì)照仍模擬靶核酸的表現(xiàn)，優(yōu)選包含待測(cè)靶核酸序列的對(duì)照核酸序列由少于10，更優(yōu)選少于6個(gè)，基本平行互補(bǔ)或基本相同的部分構(gòu)成。
由于基本相同或相同序列不易區(qū)分，所以，為單獨(dú)鑒定出靶核酸與對(duì)照核酸及其擴(kuò)增物，例如用探針雜交的方法，含有待測(cè)靶核酸區(qū)的對(duì)照核酸區(qū)包含與所述靶核酸序列基本平行互補(bǔ)的至少一個(gè)連續(xù)的至少8個(gè)核苷酸的序列是很重要的，更優(yōu)選至少一個(gè)至少10個(gè)核苷酸的序列。
當(dāng)靶核酸序列的互補(bǔ)鏈的序列在反向閱讀時(shí)，如果第一核酸的序列與第二核酸序列的互補(bǔ)鏈或與其部分的序列相同，則第一核酸的一部分是與第二核酸或其部分平行互補(bǔ)的。對(duì)于天然核酸而言，這表明閱讀是從3’-末端至5’-末端。圖1給出了一個(gè)實(shí)例。核酸序列5’-AGCGCATGCCAGATTACTGGC-3’(Seq.ID No.1)的平行互補(bǔ)序列是5’-TCGCGTACGGTCTAATGACCG-3’(Seq.ID No 2)?；パa(bǔ)鏈的平行互補(bǔ)序列是5’-CGGTCATTAGACCGTACGCGA-3’(Seq.ID No.17)。
本發(fā)明中對(duì)照核酸各部分不必與靶核酸100％相同或100％平行互補(bǔ)，但優(yōu)選與靶核酸100％相同或100％平行互補(bǔ)。如果這些部分是基本相同或基本平行互補(bǔ)就足夠了?；鞠嗤硎緦?duì)照核酸的該部分或這些部分與靶核酸的相應(yīng)部分具有高于80％的同源性，更優(yōu)選高于90％?；酒叫谢パa(bǔ)表示對(duì)照核酸的該部分或這些部分與靶核酸的相應(yīng)部分相比同源性高于80％，更優(yōu)選高于90％平行互補(bǔ)。
為精確測(cè)定同源性和互補(bǔ)性，優(yōu)選使用合適的計(jì)算機(jī)程序，如FastA(Pearson和Lipman)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85；2444-2448(1988)；Wisconsin package(TM)version of FastA，默認(rèn)設(shè)置wordsize 2(p-p)，6(n-n)；不顯示E( )值高于10.0(p-p)，2.0(n-n)的分?jǐn)?shù))。
本發(fā)明對(duì)照核酸還可用于測(cè)定帶有如等位形式的相關(guān)序列的靶核酸雜交和擴(kuò)增反應(yīng)，當(dāng)用于此目的時(shí)，不必為靶核酸的每一個(gè)等位形式合成新的對(duì)照物。
本發(fā)明中用于雜交方法作為純對(duì)照物監(jiān)測(cè)例如一個(gè)探針雜交步驟的對(duì)照核酸基本包括待測(cè)靶核酸的區(qū)，特征在于，所述基本包含所述待測(cè)靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸的區(qū)包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，與所述靶核酸或與所述靶核酸的互補(bǔ)鏈基本平行互補(bǔ)的序列。在這類方法中，最重要的區(qū)是靶核酸上靶特異性探針實(shí)際結(jié)合的區(qū)，該區(qū)實(shí)際是靶核酸要測(cè)定的區(qū)。所以，在多數(shù)情況下，內(nèi)部對(duì)照包含這個(gè)區(qū)即可。如果這個(gè)區(qū)少于15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選少于10個(gè)核苷酸，則優(yōu)選對(duì)照核酸的相應(yīng)區(qū)與靶核酸的探針雜交區(qū)基本平行互補(bǔ)。如果靶核酸的探針雜交區(qū)長于15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長于10個(gè)核苷酸，則對(duì)照核酸的相應(yīng)區(qū)可以完全平行互補(bǔ)于靶核酸的探針雜交區(qū)，或者該區(qū)是部分基本平行互補(bǔ)，而其它部分是基本相同的。在用這種對(duì)照核酸的雜交中使用基本互補(bǔ)，優(yōu)選互補(bǔ)探針，可模擬靶核酸與探針的雜交，但仍可單獨(dú)檢測(cè)出兩種雜交混合物。
一個(gè)擴(kuò)增對(duì)照物可以監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程。例如在典型的PCR方法中可包括引物雜交步驟，引物的延伸，擴(kuò)增效率或/和進(jìn)一步的探針雜交步驟。本發(fā)明中優(yōu)選的擴(kuò)增對(duì)照物可包含基本帶有擴(kuò)增靶核酸區(qū)的區(qū)域的側(cè)翼區(qū)，因?yàn)閷?duì)照物的擴(kuò)增所用優(yōu)選的引物是與根據(jù)對(duì)照物序列的靶核酸擴(kuò)增引物基本平行互補(bǔ)或基本相同，更優(yōu)選平行互補(bǔ)或相同的引物。所以對(duì)照核酸的擴(kuò)增物不包含對(duì)照物的側(cè)翼區(qū)，而只是基本含有擴(kuò)增靶核酸區(qū)的區(qū)，并且這兩種擴(kuò)增物的長度基本相同。
如上所述，基本含有待擴(kuò)增靶核酸區(qū)的對(duì)照核酸區(qū)，可由幾個(gè)部分組成，各部份與靶核酸相應(yīng)部分基本平行互補(bǔ)或基本相同。含有待擴(kuò)增靶核酸區(qū)的對(duì)照核酸優(yōu)選組合在表1中列出。

表1Id＝基本相同，Pc＝基本與靶核酸平行互補(bǔ)本發(fā)明中，只有堿基的序列是重要的，而其骨架不必是天然的糖-磷酸骨架。所以根據(jù)本發(fā)明，使用帶有修飾的骨架或象多肽核酸(WO 92/20702)的非天然骨架核酸作為對(duì)照物也是可能的。當(dāng)使用含有堿基類似物的對(duì)照核酸時(shí)，為盡量相似地模擬靶核酸的雜交表現(xiàn)，應(yīng)注意這些堿基應(yīng)該與靶核酸序列相應(yīng)位置含有的互補(bǔ)天然堿基具有相似的屬性。還應(yīng)注意當(dāng)使用對(duì)照核酸作為擴(kuò)增對(duì)照核酸時(shí)，對(duì)照核酸的性質(zhì)應(yīng)該允許用所用的擴(kuò)增方法擴(kuò)增對(duì)照核酸。
本發(fā)明的對(duì)照核酸可在RNA或DNA編碼鏈或其互補(bǔ)鏈的序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建。對(duì)照物可以是例如化學(xué)合成的，然后在合適的載體如質(zhì)粒，噬菌體核酸內(nèi)克隆，或在細(xì)菌或病毒的基因組內(nèi)克隆，或在構(gòu)建它們時(shí)使用。這樣的對(duì)照核酸可在體外擴(kuò)增或者在含有對(duì)照物核酸序列的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生。這種對(duì)照核酸可直接用于測(cè)試或進(jìn)行包裝，例如作為盔甲R(shí)NA(armored RNA)(美國專利5,677,124)，或包裝到脂質(zhì)體中。
靶核酸是待測(cè)核酸。可以是任何來源的，例如類病毒，病毒，細(xì)菌或細(xì)胞來源。可來源于溶液，例如血液，血清，血漿或尿液，也可來源于懸浮物，可以固定于固體，含細(xì)胞的培養(yǎng)基，細(xì)胞涂片，固定細(xì)胞，組織切片或固定的生物。優(yōu)選來源于溶液的待測(cè)核酸。待測(cè)核酸可進(jìn)一步是例如通過重組，斷裂，擴(kuò)增從靶核酸得到的核酸，和/或RNA形成的cDNA。
靶核酸通常通過各種方法中的一種處理初始樣品得到可使用的形式。這包括例如改變pH值(堿性的)，加熱，循環(huán)變化溫度(凍/熔)，改變生理生長條件，使用去污劑，離液鹽或酶(如蛋白酶或脂酶)，以上方法可單獨(dú)或結(jié)合使用。如果本發(fā)明中對(duì)照核酸在樣品制備步驟之前或之中加入，這些對(duì)照核酸除在后續(xù)的擴(kuò)增和/或雜交步驟中作為對(duì)照物外，還可用作樣品制備過程中的對(duì)照物。為此目的，對(duì)照核酸可根據(jù)靶核酸的性質(zhì)，作為DNA或RNA加入樣品中。還可類似于象靶核酸那樣進(jìn)行包裝，其經(jīng)常包含在附著于蛋白的樣品或其它細(xì)胞或病毒成份中。為更接近地模擬靶核酸，對(duì)照核酸可例如包裝在一個(gè)蛋白外衣中，例如在盔甲R(shí)NA(armored RNA)中。
本發(fā)明對(duì)照核酸例如可用作對(duì)照物，優(yōu)選作為內(nèi)部對(duì)照，用在雜交方法中，例如分支DNA方法，或靶核糖體RNA的測(cè)定中，或也可以用于點(diǎn)陣雜交方法中。
它們還可例如在靶核酸擴(kuò)增方法中作為對(duì)照物，優(yōu)選作為內(nèi)部對(duì)照，例如在TMA，SDA，NASBA，LCR和PCR中。優(yōu)選方法是PCR。原則上，例如指示感染試劑或遺傳體質(zhì)的靶核酸被用作在合適反應(yīng)條件下引物可序列特異性結(jié)合的模板。依據(jù)所用方法，使用聚合酶，引物可用核苷酸單體延長，或與周圍另一個(gè)雜交引物連接。如果這種擴(kuò)增產(chǎn)物本身可直接或間接用作模板，即可指數(shù)地?cái)U(kuò)增靶核酸。同樣已知線性擴(kuò)增方法。擴(kuò)增產(chǎn)物可直接檢測(cè)，如用瓊脂糖凝膠電泳，或者通過與至少一個(gè)序列特異性探針進(jìn)行進(jìn)一步的雜交反應(yīng)。
當(dāng)與核酸模板雜交時(shí)，本發(fā)明的引物是可延長或可修飾的分子，優(yōu)選由酶進(jìn)行延長或修飾，更優(yōu)選被例如原核生物來源的聚合酶延長或修飾。優(yōu)選使用PCR熱穩(wěn)定聚合酶，例如T.aquaticus DNA聚合酶。延伸從單脫氧核苷三磷酸加入單核苷酸單元到所述引物的一個(gè)末端，優(yōu)選3’-OH末端。引物的總長度和堿基序列由擴(kuò)增反應(yīng)所要求的特異性來指示。進(jìn)行PCR優(yōu)選的引物長度是含有從10到40個(gè)，最優(yōu)選15-30個(gè)堿基的亞基，選自單核苷酸和/或核酸類似物單體。通常，這個(gè)長度的引物還可用于其它擴(kuò)增方法。如果擴(kuò)增所用引物不止一種，例如，當(dāng)使用PCR或在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增多個(gè)靶核酸時(shí)，優(yōu)選使用相互之間不能雜交的引物，因?yàn)樗鼈儾缓腥魏伍L于5個(gè)連續(xù)互補(bǔ)堿基的一段序列。
在PCR中，典型地選擇引物的雜交位點(diǎn)，使得在延伸產(chǎn)物的雜交體中在它們的原3’末端之間有至少10個(gè)，但不多于1000個(gè)，優(yōu)選100-500個(gè)核苷酸。
通常，重要的是，引物與靶核酸的結(jié)合足夠強(qiáng)烈，以允許反應(yīng)條件下的擴(kuò)增，但必須注意該引物優(yōu)選僅與靶核酸結(jié)合，而應(yīng)該避免與樣品中可能含有的其它核酸結(jié)合。所以，引物優(yōu)選10-40個(gè)核苷酸長度，更優(yōu)選15-30核苷酸長度。優(yōu)選的引物是寡核苷酸。
探針是測(cè)定靶核酸或擴(kuò)增靶核酸所用的分子。還可用于測(cè)定靶核酸或擴(kuò)增靶核酸的序列。為此目的，可使用具有不同序列的探針。這樣的探針還可用于例如測(cè)定靶核酸的不同等位形式，或測(cè)定靶核酸的種屬特異性。探針優(yōu)選寡核苷酸，但也可以使用其類似物，例如PNA。為允許序列特異性雜交，探針優(yōu)選長于10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選10-40核苷酸長度。為檢測(cè)出靶核酸，擴(kuò)增物和相應(yīng)的探針雜交復(fù)合物，所用的探針或/和引物可以與可直接或間接的被檢測(cè)出，或可將靶核酸，擴(kuò)增物和相應(yīng)的探針雜交復(fù)合物固定到固相上的基團(tuán)偶聯(lián)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，標(biāo)記物是鑒定存在分析物時(shí)可檢測(cè)的或可制成能檢測(cè)的基團(tuán)。公知的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物，如熒光素；電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，如釕復(fù)合物；或可被另一分子實(shí)體識(shí)別的部分，如與被半抗原免疫產(chǎn)生的抗體識(shí)別的半抗原或可固定化的部分，如生物素(固定到鏈親合素包被的固相上，如試管或小珠)。標(biāo)記物例如可與探針或引物結(jié)合，或作為標(biāo)記核苷三磷酸單位能被引入擴(kuò)增核酸中。也可以使用標(biāo)記物，它允許利用其它方法檢測(cè)靶核酸或擴(kuò)增靶核酸，如將標(biāo)記物或標(biāo)記的嵌入劑插入雙鏈DNA。標(biāo)記物還可用于檢測(cè)引物或探針或任何整合了所述引物的產(chǎn)物，來檢測(cè)由所述引物或探針和待測(cè)核酸形成的雜交物，或檢測(cè)摻入了標(biāo)記核苷酸的擴(kuò)增靶核酸。
固相物是在反應(yīng)混合物中基本上不溶的固體，例如小珠，網(wǎng)，試管的內(nèi)表面，微量滴定板或設(shè)備的反應(yīng)室。固相物基本上用于包含反應(yīng)混合物，但當(dāng)要對(duì)其結(jié)合一種可固定化的探針、引物或?qū)φ蘸怂釙r(shí)，固相物表面上可包括能夠識(shí)別并結(jié)合所述探針、引物或?qū)φ蘸怂岬牟糠值脑噭┗虬晃铩?br> 使用異源檢測(cè)方法，如探針雜交進(jìn)行的檢測(cè)，是在擴(kuò)增步驟之后進(jìn)行的。雜交復(fù)合物可在溶液中，或在固定到固相物上之后檢測(cè)出。還已知同源檢測(cè)形式，可不經(jīng)過進(jìn)一步的分離或清洗步驟在反應(yīng)混合物中檢測(cè)出擴(kuò)增核酸。為此目的已知有幾種探針雜交形式，如Taqman(美國專利號(hào)5210015和5487972)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(US 4,996,143)，分子信號(hào)(Beacon)(WO-95/13399，美國專利號(hào)5,119,801和5,312,728)，Sunrise(美國專利號(hào)5,866,336)，Scorpions(PCT/GB98/03521)。這些方法可用于在整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)合成擴(kuò)增物的水平。當(dāng)在反應(yīng)中或鑒定多靶核酸時(shí)，使用內(nèi)部對(duì)照，如本發(fā)明中的內(nèi)部對(duì)照，可將每個(gè)靶核酸和對(duì)照物測(cè)量到的信號(hào)相互區(qū)別開。為此，可使用例如結(jié)合到不同探針或引物的不同標(biāo)記物，就可同時(shí)測(cè)定反應(yīng)混合物中的不同靶核酸和對(duì)照物或來源于這些核酸的擴(kuò)增核酸。
本發(fā)明對(duì)照核酸為核酸，可以是化學(xué)合成，克隆，擴(kuò)增或本領(lǐng)域公知的其它方法分離得到的。優(yōu)選RNA或DNA單體制成的核酸，但也包括天然的或非天然的堿基或糖類似物。由于平行互補(bǔ)部分，對(duì)照核酸與靶核酸序列相比具有不同的序列，多數(shù)情況下，這樣的序列必須通過已知的方法合成至少一次，如亞磷酰胺技術(shù)。為生產(chǎn)更長的本發(fā)明中的核酸，可合成短的，約40-120堿基長度的寡核苷酸，該核苷酸以交錯(cuò)方式使需要的對(duì)照核酸的兩條鏈重疊。這些寡核苷酸經(jīng)過雜交及其后的連接步驟后，該核酸例如可克隆到一個(gè)載體中，或者按照這里的描述直接使用?？寺〉暮怂峥梢赃M(jìn)行擴(kuò)增，例如在細(xì)菌中，并且使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular CloningALaboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，2001,ISBN 0879695765)分離。如果核酸是RNA，可使用載體在體外轉(zhuǎn)錄合成，載體包含一個(gè)合適的啟動(dòng)子序列，如T7噬菌體啟動(dòng)子序列。核酸可以裸核酸的形式使用，也可包裝成顆粒，例如作為盔甲R(shí)NA(US5,677,124)，或者包裝到類病毒，病毒，細(xì)菌或細(xì)胞生物體中。
這種核酸例如用于控制核酸雜交和擴(kuò)增反應(yīng)?？捎糜谧R(shí)別由樣品中存在的抑制劑引起的假陰性結(jié)果，或者在定量實(shí)驗(yàn)中作為標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照可在不同容器中(外部對(duì)照)的平行反應(yīng)中處理，或在相同的反應(yīng)容器中(內(nèi)部對(duì)照)和靶核酸一樣共處理，后一種情況是優(yōu)選的。
對(duì)照構(gòu)建體中基本平行互補(bǔ)的部分可包括一個(gè)或多個(gè)探針結(jié)合位點(diǎn)或/和一個(gè)或多個(gè)引物結(jié)合位或/和一個(gè)或多個(gè)引物/探針側(cè)翼區(qū)，多數(shù)情況是包括相應(yīng)靶核酸的整個(gè)序列。
這即是說本發(fā)明的對(duì)照核酸的處理過程中，可以使用引物或/和探針，該引物或/和探針與處理靶核酸中所用的引物或/和探針是基本平行互補(bǔ)的，優(yōu)選平行互補(bǔ)的。相應(yīng)的引物和探針具有相同的GC含量和雜交屬性，其主要反映探針和引物雜交效率和擴(kuò)增效率，但與這些反應(yīng)成分沒有競(jìng)爭(zhēng)，因?yàn)榕c對(duì)照核酸結(jié)合的引物或/和探針不能與靶核酸結(jié)合，反之亦然。如果樣品中靶核酸的含量很小，這種競(jìng)爭(zhēng)可能最終導(dǎo)致沒有靶核酸的擴(kuò)增物或只結(jié)合少量的探針。所以，使用平行互補(bǔ)引物和探針可提高靈敏度和實(shí)驗(yàn)的線性范圍。盡管應(yīng)注意到在靶核酸和對(duì)照核酸的擴(kuò)增中使用相同的引物有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)一套引物就已足夠，靶特異性引物的直接對(duì)照是可能的。
在定性實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的對(duì)照核酸可用于鑒別假陰性結(jié)果，優(yōu)選被用作內(nèi)部對(duì)照。因?yàn)樗珊芙咏啬M靶核酸的能力，以同樣的方式受抑制劑的作用。由于系統(tǒng)反應(yīng)對(duì)抑制物質(zhì)的產(chǎn)生非常敏感，特別是當(dāng)反應(yīng)中加入低濃度對(duì)照核酸的情況下。這種對(duì)照核酸還可用作標(biāo)準(zhǔn)物，優(yōu)選作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物，例如作為標(biāo)準(zhǔn)化平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方法。
在定量實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的對(duì)照核酸可用作定量標(biāo)準(zhǔn)鑒定樣品中含有的靶核酸的起始水平。已知量的標(biāo)準(zhǔn)核酸與靶核酸在基本相同的反應(yīng)條件下共擴(kuò)增，優(yōu)選作為內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)。擴(kuò)增之后，或者在同源檢測(cè)情況下，擴(kuò)增反應(yīng)期間，測(cè)定擴(kuò)增靶核酸的數(shù)量和擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)核酸的量。使用這種方法，已知反應(yīng)中起始標(biāo)準(zhǔn)核酸的數(shù)量，就可計(jì)算擴(kuò)增前就存在于樣品中的靶核酸的起始數(shù)量。本領(lǐng)域已知幾種方法用于定量實(shí)驗(yàn)，包括例如使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)曲線，外部標(biāo)準(zhǔn)曲線和Payan模型(例如見Haberhausen等，臨床微生物雜志(Journal of ClinicalMicrobiology)，Vol 36，628-633頁)。應(yīng)注意不必測(cè)量合成擴(kuò)增物的絕對(duì)量。為達(dá)到大多數(shù)目的，相對(duì)量就足夠，可由例如擴(kuò)增物與標(biāo)記探針之間的雜交以及測(cè)定雜交復(fù)合物的信號(hào)強(qiáng)度來測(cè)定。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中使用本發(fā)明的對(duì)照核酸，在美國專利號(hào)4,683,195；4,683,202和4,965,188,Saiki等人，科學(xué)(Science)2301350-1354；mullis等，1986，冷泉港定量生物學(xué)研討會(huì)(ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.)51263-273；和Mullis和Faloona，1987，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)155335-350中都已描述。
可在反應(yīng)的某些階段加入對(duì)照核酸。通常樣品，如血液，血清，痰或組織樣品中的核酸至少是經(jīng)本領(lǐng)域公知樣品制備方法部分提純的。所用的特殊方法不是本發(fā)明中的關(guān)鍵部分。對(duì)照核酸可在樣品制備之前加入，使對(duì)照核酸與樣品中含有的靶核酸共處理，這樣除可監(jiān)測(cè)后續(xù)的擴(kuò)增或/和探針雜交步驟之外，還可監(jiān)測(cè)樣品制備步驟。
二者擇一地，對(duì)照核酸也可在樣品制備后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合物，以監(jiān)測(cè)靶核酸和對(duì)照核酸的共擴(kuò)增，但是也可在擴(kuò)增后加入，在探針雜交步驟中加入，來監(jiān)測(cè)雜交步驟。
優(yōu)選地，用于擴(kuò)增對(duì)照核酸的引物是與靶核酸擴(kuò)增所用引物基本相同或基本平行互補(bǔ)的。由于這種特異性的對(duì)照引物具有與各靶特異性引物基本相同的熔解溫度，與其它多擴(kuò)增反應(yīng)相比，更易于找到一個(gè)合適的溫度循環(huán)條件來適合靶核酸和對(duì)照核酸的擴(kuò)增。如果用探針鑒定對(duì)照核酸或擴(kuò)增對(duì)照核酸，探針與靶核酸或擴(kuò)增靶核酸鑒定所用探針相比基本平行互補(bǔ)，同樣也易于找到合適的溫度循環(huán)條件。
當(dāng)使用PCR擴(kuò)增靶核酸和對(duì)照核酸時(shí)，反應(yīng)混合物除靶核酸外，一般還含有對(duì)照核酸，特異性引物和任選的同源檢測(cè)探針，以及進(jìn)一步的反應(yīng)成分，如合適的緩沖液(如Tricine)，二價(jià)陽離子如Mg2+或Mn2+，一種聚合酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定聚合酶，以及四種脫氧核苷(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)。擴(kuò)增反應(yīng)可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的熱循環(huán)儀進(jìn)行，如PE 9600(或ABI Prism 7700)(Perkin Elmer Corp.)使用溫度循環(huán)方案，進(jìn)行雙鏈核酸的變性，引物與靶核酸和對(duì)照之間的序列特異性雜交，以及聚合酶催化的引物延長。為合成足夠量的擴(kuò)增核酸進(jìn)行測(cè)定，這個(gè)溫度循環(huán)可以根據(jù)需要不斷反復(fù)。通常進(jìn)行30-40個(gè)循環(huán)。
如果擴(kuò)增核酸是在擴(kuò)增后由探針雜交鑒定，擴(kuò)增的核酸被堿或加熱變性，中和(如果必要的話)，加入探針，在合適的條件下(溫度和化學(xué)環(huán)境)，探針與擴(kuò)增核酸雜交。這種條件可由實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行一些比較實(shí)驗(yàn)而容易確定。特異性雜交復(fù)合物可使用標(biāo)記物和其它所述檢測(cè)方法檢測(cè)出來。
同源鑒定形式中，在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中檢測(cè)擴(kuò)增核酸，優(yōu)選在擴(kuò)增反應(yīng)期間檢測(cè)。如果擴(kuò)增的核酸是通過特異性探針鑒定的，則探針應(yīng)在開始擴(kuò)增反應(yīng)之前加入到擴(kuò)增反應(yīng)中。此外，這種測(cè)定形式還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在擴(kuò)增后，通常不需要打開試管，減小了污染風(fēng)險(xiǎn)。在擴(kuò)增反應(yīng)中，探針與擴(kuò)增核酸的雜交可使用不同方法監(jiān)測(cè)。最常見的是，用熒光標(biāo)記物標(biāo)記探針，如果將合適的檢測(cè)儀裝配到熱循環(huán)儀上(即ABI Prism 7700，Perkin Elmer)，則可在反應(yīng)進(jìn)行期間檢測(cè)出來。為僅僅檢測(cè)出已雜交的或者與特異性擴(kuò)增核酸雜交的探針，已建立了本文提及的幾種形式。使用TaqMan形式，雜交的探針用聚合酶部分消化，從探針的5’末端切去第一個(gè)淬火的標(biāo)記物，就可以測(cè)量出探針上第二個(gè)標(biāo)記物，優(yōu)選熒光標(biāo)記物，所發(fā)出的信號(hào)。這個(gè)熒光信號(hào)用作反應(yīng)中合成的特異性擴(kuò)增核酸量的量度。由于對(duì)照核酸的特異性探針優(yōu)選具有另一熒光標(biāo)記物，比對(duì)靶核酸特異性的探針發(fā)出的光多具備另一波長，這兩種探針的信號(hào)可在相同的反應(yīng)試管中分別測(cè)量出。兩種信號(hào)可用于計(jì)算，如計(jì)算樣品中存在的靶核酸的起始量。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選目的是用于定量測(cè)量靶核酸的方法，包括如下步驟a)擴(kuò)增所述靶核酸的區(qū)和已知量的對(duì)照核酸，所述對(duì)照核酸基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，從而所述基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸區(qū)，包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
b)檢測(cè)指示從所述對(duì)照核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)，檢測(cè)指示從所述靶核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)c)利用所述已知量的對(duì)照核酸，步驟b中指示從所述測(cè)定的對(duì)照核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)，和步驟b中指示從所述測(cè)定的靶核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)，來計(jì)算所述靶核酸的量。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是在反應(yīng)中用于擴(kuò)增靶核酸區(qū)的一種對(duì)照核酸，所述對(duì)照核酸基本包含所述待擴(kuò)增靶核酸的區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，從而所述基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸區(qū)，包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是一種包含靶核酸和對(duì)照核酸的組合物，該組合物存在于雜交或擴(kuò)增反應(yīng)混合物中，目的是檢測(cè)靶核酸區(qū)，從而所述對(duì)照核酸基本包括所述待測(cè)靶核酸區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，其特征在于所述基本包括所述待測(cè)靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸區(qū)包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是一種用于擴(kuò)增靶核酸的試劑盒，包括指導(dǎo)手冊(cè)，至少一個(gè)至少含有對(duì)照核酸的容器，其中所述對(duì)照核酸基本包括待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，其特征在于所述基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸的區(qū)包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。進(jìn)一步優(yōu)選的試劑盒除包括指導(dǎo)手冊(cè)和對(duì)照核酸外，還包括其它反應(yīng)成分如靶特異性或?qū)φ仗禺愋蕴结?，靶特異性或?qū)φ仗禺愋砸铮磻?yīng)緩沖液，核苷三磷酸或酶，如聚合酶。這些成分可包裝在這樣一種試劑盒的第一容器內(nèi)，但是也可包裝在一個(gè)或多個(gè)另外的容器內(nèi)。還優(yōu)選用于用雜交方法檢測(cè)靶核酸的試劑盒，包括指導(dǎo)手冊(cè)，至少一種本發(fā)明的對(duì)照核酸。
本發(fā)明的另一目的是使用對(duì)照核酸，在擴(kuò)增靶核酸區(qū)的反應(yīng)中作為對(duì)照物，或在鑒定靶核酸區(qū)的雜交反應(yīng)中作為對(duì)照物，從而所述對(duì)照核酸基本包括待擴(kuò)增或待雜交靶核酸的區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，其特征在于所述基本包括所述待擴(kuò)增或待雜交靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸區(qū)包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
本發(fā)明由以下實(shí)施例具體說明實(shí)施例實(shí)施例1設(shè)計(jì)一個(gè)探針序列，與HCV靶探針序列平行互補(bǔ)為在Taqman實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)HCV核酸，可使用下述與HCV-擴(kuò)增子(Seq.ID No，10)結(jié)合的探針ST650(Seq.ID No 3)5’(Cy5-)CGG TGT ACT CAC CG(FAMs)TTC CGCAGA CCA CTA TGG C-PO4-3’Cy5使用烷基磷脂-接頭(Pharmacia Biotech Cy5-N-乙基-亞磷酰胺)Fams，帶有五次甲基-二-靛炭花青苷寡核苷酸衍生物；使用2-(氨基-環(huán)己基-)丙-1，3-二醇-接頭(Biogenex CX-FAM-亞磷酰胺)，帶有6-羧基-熒光素的寡核苷酸衍生物。
本申請(qǐng)中包括的所有HCV特異性序列都衍生自I型HCV基因組(NCBI，GenbankAccession No.AF054249或AJ000009)。
最好的情況是內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)的探針精確模擬靶探針，但又能跟靶探針區(qū)別開。靶探針的平行互補(bǔ)序列，稱為ST650pc(Seq.ID No.5)，可用作這樣一種內(nèi)部對(duì)照探針。ST650pc與靶探針具有相同的GC含量，GC/AT序列，長度，二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以，也具有相同的熔點(diǎn)。進(jìn)一步地，由于G和A可分別被C和T代替，并且反之亦然，就可與靶探針區(qū)別開，ST2535(Seq.ID No.4)包含與HCV不相關(guān)的序列，例如與HCV序列不基本相同或基本平行互補(bǔ)。包含ST2535結(jié)合序列的內(nèi)部對(duì)照可與探針ST2535共同使用，作為靶核酸鑒定反應(yīng)的對(duì)照。含有與靶核酸序列不相關(guān)序列的探針和對(duì)照物經(jīng)常在本領(lǐng)域使用。相反，所述ST650pc(Seq.ID No.5)具有極好的模擬靶探針的潛力。ST650pc(Seq.ID No.5)探針可與所有的內(nèi)部對(duì)照或包含ST650pc結(jié)合序列的定量標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建物共同使用。
ST2535(Seq.ID No.4)；5’(Cy5～)TGG ACT CAG TCC T(HEXs)T GGT CAT CTC ACC TTC T-PO4 3’HEXs使用2-(氨基-環(huán)己基)-丙-1，3-二醇-接頭(Biogenex CX-HEX-亞磷酰胺)，帶有六氯-6-羧基-熒光素的寡核苷酸衍生物ST650pc(Seq.ID No.5)5’(CY5-)GCCACATGAGTGGC(HEXs)AAGGCGTCTGGTGATACCG-PO43’使用Mfold 3.0版軟件(copyright 15 1996 Dr.M.Zuker，M.Zuker，D.H.Mathews & D.H.Turner，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的算法和熱動(dòng)力學(xué)(AlgoridimsandThermodynamics for RNA Secondary Structure PredictionA Practical Guide)，RNA生物化學(xué)和生物技術(shù)(In RNA Biochemistry and Biotechnology)，J.Barciszewsri &B.F.C.Clark，編著，NATO ASI系列，Kluwer Academic Publishers，(1999))預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖2所示，預(yù)測(cè)出的靶探針與平行互補(bǔ)探針之間二級(jí)結(jié)構(gòu)相同。
實(shí)施例2設(shè)計(jì)引物序列，與HCV靶引物序列平行互補(bǔ)，比較靶引物和平行互補(bǔ)引物形成的可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)為擴(kuò)增HCV核酸，使用下列引物ST280(Seq ID No 6).
5’GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA3’ST778(Seq ID No 7)5’GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT ACC ACA A3’這些擴(kuò)增引物的平行互補(bǔ)序列是ST280 pc(Seq ID No 8)5’CGT CTT TCG CAG ATC GGT ACC TCAAT3’ST778pc(Seq ID No 9)5’CGT TCG TGG GAT AGT CCG TCA TGG TGT T3’這些設(shè)計(jì)的內(nèi)部引物用于擴(kuò)增內(nèi)部對(duì)照。由于靶序列和內(nèi)部對(duì)照使用不同擴(kuò)增引物，內(nèi)部對(duì)照的擴(kuò)增是非競(jìng)爭(zhēng)性的。但是，設(shè)計(jì)的平行互補(bǔ)引物與靶引物結(jié)構(gòu)十分接近，涉及GC含量，GC/AT序列，長度，二級(jí)結(jié)構(gòu)和因之的熔點(diǎn)。ST280 pc和ST778 pc可用作所有內(nèi)部對(duì)照的擴(kuò)增引物和非競(jìng)爭(zhēng)性的，定量的，帶有合適引物結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建物。
使用Mfold 3.0版軟件預(yù)測(cè)靶引物和平行互補(bǔ)引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)是相同的(見圖3)。
實(shí)施例3非競(jìng)爭(zhēng)性定性和定量HCV核酸檢驗(yàn)中，與HCV序列平行互補(bǔ)的內(nèi)部對(duì)照的構(gòu)建克隆雙鏈DNA片段，使用60-120b長度的重疊寡核苷酸，其中寡核苷酸與包含高度保守5’-UTR區(qū)的I型HCV基因組的5’一片段平行互補(bǔ)。合成的克隆片段具有943bp長度，克隆到一個(gè)RNA表達(dá)載體(AMBION，Austin，USA)中的BglIIHindIII位點(diǎn)。表達(dá)產(chǎn)生包含包括MS-2外被蛋白的基因，MS-2包裝信號(hào)和5’HCV片段的平行互補(bǔ)序列的RNA的盔甲R(shí)NA顆粒。這種RNA可與靶核酸區(qū)別開，但由于平行互補(bǔ)性，GC含量和G或C和A或T核苷酸的序列與相應(yīng)的HCV片段相同，這些性質(zhì)主要影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)。該構(gòu)建物被共擴(kuò)增，并且與HCV靶核酸(Seq.ID No 10)一起在相同的反應(yīng)中，分別使用實(shí)施例2和1中提及的引物和探針，以非競(jìng)爭(zhēng)性方式，檢測(cè)出來。
QS(pc)HCV(Seq.ID No 10)的克隆BglII/HindIII片段的序列SEQ New943 bp；組成203A；287C；282G；171T；0其它百分比22％A；30％C；30％G；18％T； 0％其它分子量(kDa)單鏈DNA；291.24雙鏈DNA581.5起始BglII1AGATCTCCGC TGTGAGGTGG TATCTAGTGA GGGGACACTCCTTGATGACA GAAGTGCGTC61 TTTCGCAGAT CGGTACCGCAATCATACTCA CAGCACGTCGGAGGTCCTGG GGGGGAGGGC121 CCTCTCGGTA TCACCAGACG CCTTGGCCAC TCATGTGGCCTTAACGGTCC TGCTGGCCCA181 GGAAAGAACC TAGTTGGGCG AGTTACGGACCTCTAAACCC GCACGGGGGC GCTCTGACGA241 TCGGCTCATC ACAACCCAGC GCTTTCCGGA ACACCATGACGGACTATCCC ACGAACGCTC301 ACGGGGCCCT CCAGAGCATC TGGCACGTGG TACTCGTGCTTAGGATTTGG AGTTTCTTTT361 TGGTTTGCAT TGTGGTTGGC GGCAGGTGTC CTGCAGTTCAAGGGCCCGCC ACCAGTCTAG421 CAACCACCTC AAATGGACAA CGGCGCGTCC CCGGGGTCCAACCCACACGC GCGCGAGTCC481 TTCTGAAGGC TCGCCAGCGT TGGAGCACCT TCCGCTGTTGGATAGGGGTT CCGAGCGGGCT541 GGGCTCCCGT CCCGGACCCG AGTCGGGCCC ATGGGAACCGGGGAGATACC GTTACTCCCG601 TACCCCACCC GTCCTACCGA GGACAGTGGG GCACCAAGAGCCGGATCAAC CCCGGGGAGT661 CTGGGGGCCG CATCCAGCGC ATTAAACCCA TTCCAGTAGCTATGGGAATG TACGCCGAAG721 CGGCTGGAGT ACCCCATGTA AGGCGAGCAG CCGCGGGGAGATCCCCCGCG GCGGTCCCGG781 GACCGCGTAC CGCAGGCCCA AGACCTCCTG CCGCACTTGATACGTTGTCC CTTAAACGGG641 CCAACGAGAA AGAGATAGAA GGAGAACCCA AACGACAGAACAAACTGGTA GGGTCGAAGG901 CGAATACTTC ACGCGTAAAC ATGAGGATTA CCCATGTAAG CTTHindIII粗體印刷當(dāng)使用引物ST280pc和ST778pc擴(kuò)增時(shí)的擴(kuò)增子(Seq.ID No12)。
實(shí)施例4比較單鏈HCV靶核酸擴(kuò)增子與單鏈內(nèi)部對(duì)照復(fù)制子和拼湊的內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增子QSHCV(Seq ID No 13)形成的可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
拼湊的對(duì)照核酸(Seq ID No 13)具有一個(gè)ST280和ST778引物結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)ST2535探針結(jié)合位點(diǎn)，并與HCV靶核酸擴(kuò)增子具有相同的長度和相同的GC含量。用Mfold3.0版進(jìn)行空間折疊，見圖4。
HCV和平行互補(bǔ)QS(pc)HCV擴(kuò)增子具有形成相似二級(jí)結(jié)構(gòu)的潛力。區(qū)別于本領(lǐng)域的拼湊內(nèi)部對(duì)照(QSHCV)擴(kuò)增子(Seq ID No 13)形成的結(jié)構(gòu)。由于QS(pc)HCV擴(kuò)增子(Seq ID No 12)是HCV靶擴(kuò)增子的非常接近的模擬物，QS(pc)HCV(Seq.ID No 11)是比對(duì)照靶擴(kuò)增子更好的選擇。
實(shí)施例5克隆內(nèi)部對(duì)照，用于帶有天然引物結(jié)合位點(diǎn)的HCV(ICSJ62OHCV)的競(jìng)爭(zhēng)性，定量和定性核酸檢測(cè)根據(jù)實(shí)施例3，克隆合成的375bpDNA片段，該片段除具有引物結(jié)合位點(diǎn)外，還與I型HCV5’UTR平行互補(bǔ)。引物結(jié)合位點(diǎn)與靶序列相同，以引起靶序列和對(duì)照序列之間的競(jìng)爭(zhēng)性PCR。兩種引物之間的序列是平行互補(bǔ)的，以達(dá)到模擬靶序列的目的。由于引物之間GC含量，長度和G/C及A/T的序列與靶序列相同，該構(gòu)建體與靶擴(kuò)增子非常接近。該構(gòu)建物被共擴(kuò)增，并且與HCV靶物一起在相同的反應(yīng)中，使用實(shí)施例1中提及的靶擴(kuò)增引物和平行互補(bǔ)探針，以競(jìng)爭(zhēng)方式，檢測(cè)出來。
ICSJ620HCV(Seq.ID No 14)SEQ New375bp；組成76A；104C；117G；78T；0其它百分比20％A；28％C；31％G；21％T；0％其它分子量(kDa)單鏈DNA116.05雙鏈DNA 231.2起始BglII1AGATCTCGGT CGGGGGACTA CCCCCGCTGT GAGGTGGTACTTAGTGAGGG GACACTCCTT61 GATGACAGAA GTGGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTACATACTCACAG CACGTCGGAG121 GTCCTGGGGG GGAGGGCCCT CTCGGTATCACCAGACGCCT TGGCCACTCA TGTGGCCTTA181 ACGGTCCTGC TGGCCCAGGA AAGAACCTAGTTTGGGCGAG TTACGGACCT CTAAACCCGC241 ACGGGGGCGC TCTGACGATC GGCTCATCACAACCCAGCGC TTTCCGGTTG TGGTACTGCC301 TGATAGGGTG CTTGCCTCGA GGGGCCCTCC AGAGCATCTGGCACGTGGAA ACATGAGGAT361 TACCCATGTAAGCTTHindIII粗體印刷使用引物ST280和ST778擴(kuò)增時(shí)的擴(kuò)增子(Seq.ID No 15)實(shí)施例6比較HCV1b野生型，QSHCV和QS(pc)HCV的退火曲線擴(kuò)增HCV1b野生型，QSHCV和QS(pc)HCV相關(guān)片段，然后擴(kuò)增產(chǎn)物用于退火實(shí)驗(yàn)，使用SybrGreen作為嵌入劑，得到擴(kuò)增子的折疊動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
1000 IUHCV-1b RNA，QSHCV或QS(pc)HCV在可比較的濃度(IU；國際單位，WHO-標(biāo)準(zhǔn))5％DMSO5.64％ 甘油50mM Tricine(pH＝8.3)100mM KOAc(pH＝7.5)300μM dNTP(A，C，G)50μM dTTP500μM dUTPpmol NTQ21-46-A(Aptamer，Sequence；CGA TCA TCT GAGAAC ATT CTT AGC GTT TTG TTC TTG TGT ATGATC G-PO4)40UZO5聚合酶10UUNG.(尿嘧啶-N-糖基化酶)3mMMn(Ac)212μl Sybr-Green(1∶300稀釋度from Molecular Probes，LeidenNetherlands；在DMSO中10000x濃縮)ad 100μl 水DEPC-處理的引物HCV-1b和QSHCV的擴(kuò)增引物15pmol ST28040pmol ST778QS(pc)HCV擴(kuò)增引物15pmol ST280pc40pmol ST778pc聚合酶ZO5如美國專利號(hào)5,455,170和美國專利號(hào)5,674,738所述。擴(kuò)增循環(huán)(50℃ 240s59℃ 1800s)1x(95℃ 15s
58℃25s)5x(91℃ 15s58℃25s)55x退火曲線0.5℃ 步驟從90℃起始，冷卻到70℃每個(gè)步驟20s用ABI Prism 7700(Perkin Elmer Corp.)完成擴(kuò)增和退火曲線(通過Sybr-Green插入檢測(cè))比較退火曲線(見圖5)實(shí)驗(yàn)參考是HCV-1b擴(kuò)增子的退火曲線。本領(lǐng)域使用的內(nèi)部對(duì)照構(gòu)建物QSHCV顯示高于熔點(diǎn)溫度的退火曲線，而平行互補(bǔ)對(duì)照序列QS(pc)HCV的退火曲線與HCV-1b擴(kuò)增子的退火曲線吻合得很好。
序列表<110>F.Hoffmann-La Roche AG<120>使用對(duì)照物測(cè)定核酸的方法<130>18981<140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明例證原則的人工序列<400>1agcgcatgcc agattactgg c 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明例證原則的人工序列<400>2tcgcgtacgg tctaatgacc g 21<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ST650 HCV特異性探針序列<220><221>N區(qū)<222>(15)<223>n代表無堿基接頭((2-氨基-環(huán)己基-)丙-1，3-二醇)<400>3cggtgtactc accgnttccg cagaccacta tggc 34<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ST2535探針序列<220><221>N區(qū)<222>(15)<223>n代表無堿基接頭((2-氨基-環(huán)己基-)丙-1，3-二醇)<400>4tggactcagt cctntggtca tctcaccttc t 31<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ST650pc探針序列(平行互補(bǔ)于ST650)<220><221>N區(qū)<222>(15)<223>n代表無堿基接頭((2-氨基-環(huán)己基-)丙-1，3-二醇)<400>5gccacatgag tggcnaaggc gtctggtgat accg 34<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ST280 HCV特異性引物序列<400>6gcagaaagcg tctagccatg gcgtta26<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ST778 HCV特異性引物序列<400>7gcaagcaccc tatcaggcag taccacaa 28<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ST280pc引物平行互補(bǔ)于ST280<400>8cgtctttcgc agatcggtac ctcaat26<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ST778pc引物平行互補(bǔ)于ST778<400>9cgttcgtggg atagtccgtc atggtgtt 28<210>10<211>241<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明使用引物ST280和ST778擴(kuò)增I型HCV得到的DNA序列<400>10gcagaaagcg tctagccatg gcgttagtat gagtgtcgtg cagcctccag gaccccccct 60cccgggagag ccatagtggt ctgcggaacc ggtgagtaca ccggaattgc caggacgacc 120gggtcctttc ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcgagac 180tgctagccga gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg 240c 241<210>11<211>943<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明平行互補(bǔ)于I型HCV基因組的QS(pc)HCV<400>11agatctccgc tgtgaggtgg tatctagtga ggggacactc cttgatgaca gaagtgcgtc 60tttcgcagat cggtaccgca atcatactca cagcacgtcg gaggtcctgg gggggagggc 120cctctcggta tcaccagacg ccttggccac tcatgtggcc ttaacggtcc tgctggccca 180ggaaagaacc tagttgggcg agttacggac ctctaaaccc gcacgggggc gctctgacga 240tcggctcatc acaacccagc gctttccgga acaccatgac ggactatccc acgaacgctc 300acggggccct ccagagcatc tggcacgtgg tactcgtgct taggatttgg agtttctttt 360tggtttgcat tgtggttggc ggcaggtgtc ctgcagttca agggcccgcc accagtctag 420caaccacctc aaatggacaa cggcgcgtcc ccggggtcca acccacacgc gcgcgagtcc 480ttctgaaggc tcgccagcgt tggagcacct tccgctgttg gataggggtt ccgagcggct 540gggctcccgt cccggacccg agtcgggccc atgggaaccg gggagatacc gttactcccg 600taccccaccc gtcctaccga ggacagtggg gcaccaagag ccggatcaac cccggggagt 660ctgggggccg catccagcgc attaaaccca ttccagtagc tatgggaatg tacgccgaag 720cggctggagt accccatgta aggcgagcag ccgcggggag atcccccgcg gcggtcccgg 780gaccgcgtac cgcaggccca agacctcctg ccgcacttga tacgttgtcc cttaaacggg 840ccaacgagaa agagatagaa ggagaaccca aacgacagaa caaactggta gggtcgaagg 900cgaatacttc acgcgtaaac atgaggatta cccatgtaag ctt943<210>12<211>241<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明使用引物ST280pc和ST778pc從QS(pc)HCV衍生的擴(kuò)增子<400>12cgtctttcgc agatcggtac cgcaatcata ctcacagcac gtcggaggtc ctggggggga 60gggccctctc ggtatcacca gacgccttgg ccactcatgt ggccttaacg gtcctgctgg 120cccaggaaag aacctagttg ggcgagttac ggacctctaa acccgcacgg gggcgctctg 180acgatcggct catcacaacc cagcgctttc cggaacacca tgacggacta tcccacgaac 240g 241<210>13<211>241<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明使用引物ST280和ST778從QSHCV(具有ST280，ST778和ST2535結(jié)合位點(diǎn)的HCV擴(kuò)增對(duì)照)衍生的擴(kuò)增子序列<400>13gcagaaagcg tctagccatg gcgttagtat agtggcgtga gagcagccct tgcctcgccc 60accgcgcgtc tagaaggtga gatgaccaga ggactgagtc caatgcatgc tggctccgag 120atgctccgca aacttgccgt caacgtgact gcgtacggcg ggcgtgcccg cctggctgtg 180tatgagctgg tgaccgtgat ctggctggag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg 240c 241<210>14<211>375<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明ICSJ620HCV(具有ST280和ST778結(jié)合位點(diǎn)和平行互補(bǔ)于HCV的內(nèi)部區(qū)的HCV特異性擴(kuò)增對(duì)照)<400>14agatctcggt cgggggacta cccccgctgt gaggtggtac ttagtgaggg gacactcctt 60gatgacagaa gtggcagaaa gcgtctagcc atggcgttac atactcacag cacgtcggag 120gtcctggggg ggagggccct ctcggtatca ccagacgcct tggccactca tgtggcctta 180acggtcctgc tggcccagga aagaacctag tttgggcgag ttacggacct ctaaacccgc 240acgggggcgc tctgacgatc ggctcatcac aacccagcgc tttccggttg tggtactgcc 300tgatagggtg cttgcctcga ggggccctcc agagcatctg gcacgtggaa acatgaggat 360tacccatgta agctt 375<210>15<211>242<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明使用ST280和ST778作為引物從ICSJ620HCV(HCV特異性擴(kuò)增對(duì)照)衍生的擴(kuò)增子<400>15gcagaaagcg tctagccatg gcgttacata ctcacagcac gtcggaggtc ctggggggga 60gggccctctc ggtatcacca gacgccttgg ccactcatgt ggccttaacg gtcctgctgg 120cccaggaaag aacctagttt gggcgagtta cggacctcta aacccgcacg ggggcgctct 180gacgatcggc tcatcacaac ccagcgcttt ccggttgtgg tactgcctga tagggtgctt 240gc 242<210>16<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明NTQ21-46-A<400>16cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg 46<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明例證原則的人工序列<400>17cggtcattag accgtacgcg a2權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增樣品中靶核酸區(qū)的方法，包括以下步驟擴(kuò)增已知量的對(duì)照核酸和所述靶核酸，基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸的區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列的所述對(duì)照核酸特征在于基本包含所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸區(qū)含有至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸區(qū)或所述靶核酸序列區(qū)的互補(bǔ)鏈的序列。
2.一種定量測(cè)定靶核酸區(qū)的方法，包括以下步驟a)擴(kuò)增所述靶核酸區(qū)和已知量的對(duì)照核酸，所述對(duì)照核酸基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)，或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，b)檢測(cè)指示從所述對(duì)照核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)，檢測(cè)指示從所述靶核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)，c)利用已知量的所述對(duì)照核酸，步驟b中檢測(cè)得到的指示從所述對(duì)照核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)，和步驟b中檢測(cè)得到的指示從所述靶核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的信號(hào)，來計(jì)算所述靶核酸的量，特征在于所述基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸序列區(qū)包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中利用PCR擴(kuò)增所述靶核酸和所述對(duì)照核酸。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增產(chǎn)物是同源檢測(cè)的。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述靶核酸和所述對(duì)照核酸在同一反應(yīng)容器內(nèi)擴(kuò)增。
6.擴(kuò)增靶核酸區(qū)反應(yīng)中的對(duì)照核酸，其中所述對(duì)照核酸基本包含所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，特征在于所述基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸區(qū)，包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
7.權(quán)利要求6的對(duì)照核酸，其中所述對(duì)照核酸的至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)序列平行互補(bǔ)于所述靶核酸的引物結(jié)合位點(diǎn)，或平行互補(bǔ)于所述靶核酸的互補(bǔ)鏈。
8.權(quán)利要求6的對(duì)照核酸，其中所述對(duì)照核酸的至少一個(gè)探針結(jié)合位點(diǎn)序列平行互補(bǔ)于所述靶核酸的探針結(jié)合位點(diǎn)，或平行互補(bǔ)于所述靶核酸探針結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)鏈。
9.含有權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的靶核酸和對(duì)照核酸的組合物。
10.權(quán)利要求9的組合物，進(jìn)一步含有用于擴(kuò)增所述靶核酸的引物和用于擴(kuò)增所述對(duì)照核酸的引物。
11.擴(kuò)增靶核酸的試劑盒，包含指導(dǎo)手冊(cè)和至少一個(gè)容器，該容器內(nèi)含有至少一種權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的對(duì)照核酸。
12.在擴(kuò)增靶核酸反應(yīng)中，一種核酸作為對(duì)照物的用途，其中所述對(duì)照核酸基本包含所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列，特征在于所述基本包括所述待擴(kuò)增靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的對(duì)照核酸區(qū)，包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
13.在測(cè)定所述靶核酸的雜交反應(yīng)中，一種核酸作為對(duì)照物的用途，其中所述對(duì)照核酸基本包含所述待測(cè)靶核酸的區(qū)或所述靶核酸區(qū)的互補(bǔ)序列特征在于所述基本包括所述待靶核酸區(qū)或所述靶核酸互補(bǔ)序列的核酸序列區(qū)包含至少一個(gè)連續(xù)的，至少8個(gè)核苷酸的，基本平行互補(bǔ)于所述靶核酸或所述靶核酸互補(bǔ)鏈的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用特異性對(duì)照核酸測(cè)定靶核酸的方法,一種利用引物和特異性對(duì)照物擴(kuò)增所述靶核酸的部分序列的方法,一種含有所述對(duì)照物的試劑盒。這些對(duì)照核酸的序列至少部分平行互補(bǔ)于靶核酸的序列。這些對(duì)照物在雜交和擴(kuò)增方法中具有與靶核酸類似的性質(zhì),但根據(jù)它們不同的序列可很清楚地與靶核酸區(qū)分開。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1386865SQ0211921
公開日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2002年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月2日
發(fā)明者S·耶格 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司