專利名稱：“一管法”乙肝病毒核酸提取與擴(kuò)增-熒光pcr定量技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利屬核酸提取與熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量技術(shù)；該技術(shù)實現(xiàn)了核酸提取與 后續(xù)的PCR擴(kuò)增兩個步驟在同一 PCR管中進(jìn)行，從根本上解決了該類實驗的污染問題并實現(xiàn) 真正的快速和準(zhǔn)確定量。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)外市場正在臨床應(yīng)用的HBV DNA熒光定量PCR技術(shù)主要有以下幾個特點(diǎn)
1. 核酸提取主要有以下幾種，1)多聚糖濃縮沉淀病原，然后加堿性裂解液高溫裂解、 離心獲取核酸；2)堿性裂解液直接與含病原液體混勻，然后高溫裂解、離心獲取核酸；3) 層析柱法如采用層析柱吸附、純化、洗脫獲取核酸；4)磁珠法采用硅粉或聚乙二烯包被 的磁珠吸附、純化、洗脫獲取核酸。
以上提取方法都要經(jīng)過3 8步的換管、離心(負(fù)壓吸引)、移液等步驟方可獲取核酸， 以上過程均存在核酸丟失、污染和疲勞操作等因素帶來的定量誤差或錯誤。
2. 外帶定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品大多由試劑公司隨試劑盒一并提供的DNA純品(重組或克隆 產(chǎn)物)，不與標(biāo)本同時參加核酸提取，直接進(jìn)入PCR擴(kuò)增，部分試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)本同 時核酸提取，但采用的是核酸摻入法而非原病毒顆粒，與標(biāo)本有本質(zhì)不同，無法真實和全程 監(jiān)控標(biāo)本核酸提取和擴(kuò)增過程。
3. 引物和探針均采用單條正向引物、熒光標(biāo)記探針和單條反向引物，構(gòu)成特異性擴(kuò)增 序列，其擴(kuò)增效率和敏感性尚有提升空間。4. PCR工作反應(yīng)液PCR擴(kuò)增緩沖液、引物、探針及Taq DNA聚合酶等所需成分混勻成 PCR工作液，為無色液體，容易導(dǎo)致視覺疲勞帶來的操作誤差。
5. PCR擴(kuò)增溫度條件的設(shè)置采用傳統(tǒng)的40個擴(kuò)增循環(huán)全部進(jìn)行復(fù)性期熒光信號采集 的程序設(shè)置方法，而PCR前10個擴(kuò)增循環(huán)中并無陽性信號，存在信號空測；并且熒光PCR前 幾個循環(huán)存在熒光信號不穩(wěn)的現(xiàn)象，不利于結(jié)果分析。

發(fā)明內(nèi)容
1. 核酸提取采用本發(fā)明人發(fā)明的"微量核酸釋放劑(申請?zhí)?00310116699. X)"提取核 酸。3 pl血清(血漿或全血)標(biāo)本與3 pl藍(lán)色"微量核酸釋放劑"在PCR管內(nèi)混勻，核 酸釋放劑即退色，可清晰判斷加樣的位置，從根本上解決了前處理過程中的加樣錯誤；覆 蓋10 15^1無菌石蠟油，經(jīng)85。C,30s—99。C,7min— 5。C,30s溫處理后，加入PCR工作 液，直接進(jìn)入熒光PCR擴(kuò)增程序，實現(xiàn)檢測標(biāo)本直接進(jìn)入熒光PCR擴(kuò)增管的準(zhǔn)確定量。
2. HBV標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控品收集HBV DNA強(qiáng)陽性混合血清，采用HBV DNA陰性正常人血清去纖 維后對陽性血清依次進(jìn)行100倍稀釋，分別制備出108、 106、 105和103copies/ml的HBV 標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控品，采用衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品血清(國家一級標(biāo)準(zhǔn))，進(jìn)行10X10的實驗內(nèi)和 實驗間重復(fù)，最終確定HBV標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控品的DNA含量，并進(jìn)行保存條件的穩(wěn)定性實驗。 實現(xiàn)原病毒血清質(zhì)控品與標(biāo)本同時進(jìn)行核酸提取與擴(kuò)增的全程監(jiān)控。
3. 采用雙正反向4條引物和正反向2條探針擴(kuò)增技術(shù)在傳統(tǒng)正向引物、正向探針和反向引 物模式基礎(chǔ)上，增加了擴(kuò)增核酸長度一致和TM值相同的臨近反向引物、反向探針和正向 引物的序列設(shè)計技術(shù)，該技術(shù)較單正向序列的探針擴(kuò)增敏感性高10 50倍左右，擴(kuò)增效 率提高80%以上。序列設(shè)計如下正向引物1: NT2109-NT2127, 5， CCT GGG TGG GTA ATA ATT T 3，
反向引物1: NT2234-NT2217, 5， TTC CAA AAG TAA GGC AAG ATA TAT 3'
正向探針1: NT2142-NT2167， 5， FAM-CCA GGG ATC TAG TAG TCA ATT ATG TT—TAMRA 3，
正向引物2: NT2234-NT2215， 5， TTC CAA AAG TAA GGC AAG AT 3，
反向引物2: NT2131-NT2109, 5， CCT GGG TGG GTA ATA ATT TGG AA 3，
反向探針2: NT2200-NT2175, 5' FAM-TAG TTG CCT GAT CTT TAA ACC CAT GT-TAMRA 3，
4. PCR工作液中加入藍(lán)色的"促熒光劑" 在無色的促熒光劑中加入終濃度為0.01 %的石綠，使最終配制的PCR工作液呈淺藍(lán)色，
在PCR擴(kuò)增的預(yù)變性過程退色，使PCR的操作輕松、準(zhǔn)確，不但不影響熒光PCR的檢測， 而且具有穩(wěn)定熒光信號和增強(qiáng)熒光PCR擴(kuò)增效率的重要功能。。
5. 熒光PCR擴(kuò)增溫度設(shè)置
采用兩段變性和復(fù)性溫度梯度的設(shè)定方法，只在后段溫度梯度的復(fù)性期采集熒光信號， 溫度條件如下50。C,2min;94。C2 min, (94°C 5s， 58°C， 40s) X3 cycles — (94°C 5s， 58°C 30s[采集熒光])X37 cycles
由于熒光PCR擴(kuò)增的起始幾個循環(huán)存在熒光信號不穩(wěn)定的情況，并且臨床檢測的標(biāo)本在 起始IO個循環(huán)均無陽性擴(kuò)增，所以本方案在起始3 5個PCR循環(huán)未設(shè)定熒光采集，有助于 熒光曲線的分析及延長儀器熒光通道的使用壽命。
具體實施方式
1.技術(shù)試劑組成
1)微量核酸釋放劑160pl(48T)/320)al(96T)2) PCR反應(yīng)液:1700plXl管(48T) /2管(96T)
3) Taq DNA酶/UNG酶:8(^1 (48T) /160^1 (96T)
4) 促熒光劑60pl (48T) /120pl(96T)
5) 定量質(zhì)控品HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清①(6 9X108copies/ml) / HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清 ②(0. 5 1. 2X107copies/ml) / HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清③(1 3X 105copies/ml) / HBV DNA 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清④(4 9X103copies/ml) /陰性對照/各30(al
2. HBV DNA提取
3 pi微量核酸釋放劑(淺藍(lán)色)加3 pi待檢血清和3 pi血清質(zhì)控品，在管底吹打混 勻2 3下(變成無色)，加30u 1無菌石蠟油，用膠紙封嚴(yán)，進(jìn)行如下溫處理:85C， 30s—99 。C，7min— 5°C, 30s，備用。
3. PCR反應(yīng)液配制與加樣
按以下比例配制和加樣反應(yīng)液32.5ylX (n+4管血清校準(zhǔn)品和1管陰性對照)，每管 加TaqDNA聚合酶/UNG混合酶1. 5 u 1和促熒光劑1 u 1;混勻稍離心后，按35 u 1/T的量直接 加入到HBV DNA提取管中，直接進(jìn)入熒光PCR儀器擴(kuò)增。
4. PCR擴(kuò)增條件
50°C， 2min;94。C2 min， (94°C 5s， 58°C， 40s) X3 cycles — (94°C 5s， 58。C30s[熒光采 集])X37 cycles
5. 結(jié)果判斷
結(jié)合4個定量校準(zhǔn)血清曲線平臺熒光值的3 6%確定熒光檢測閾值。在定量范圍內(nèi)微調(diào) 4點(diǎn)血清校準(zhǔn)品的量，使質(zhì)控曲線的斜率在-3. 33±0. 1為佳；質(zhì)控曲線的相關(guān)系數(shù)在0. 99以上為有效。本試劑盒的有效定量范圍在3.5X102 2.5Xl()9copies/rnl，超出范圍應(yīng)使用陰性 血清進(jìn)行10倍稀釋進(jìn)行復(fù)核；建議對低于500copies/ml的陽性標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核后報告。
權(quán)利要求
1.采用帶有指示和變色功能的“微量核酸釋放劑”，實現(xiàn)在同一管內(nèi)直接進(jìn)行核酸提取與熒光PCR擴(kuò)增微量血清與藍(lán)色微量核酸釋放劑在熒光PCR內(nèi)混勻，藍(lán)色微量核酸釋放劑即變成無色，覆蓋滅菌液體石蠟油經(jīng)“85℃，30s→99℃，7min→5℃，30s”溫處理后，直接加入熒光PCR工作液，即可進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增和分析結(jié)果。操作簡捷、快速、無污染。
2. 該技術(shù)可直接對血清、血漿和全血標(biāo)本中的HBV DNA進(jìn)行熒光PCR檢測。
3. 采用采用衛(wèi)生部HBV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清，制備已知HBV DNA含量的4個梯度"原病毒血清 標(biāo)準(zhǔn)品"，作為熒光PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品與血清(血漿或全血)標(biāo)本同時進(jìn)行核 酸提取和熒光PCR擴(kuò)增，實現(xiàn)從核酸提取到擴(kuò)增的全程監(jiān)控。
4. 采用雙正反向4條引物和正反向2條探針擴(kuò)增技術(shù)，在傳統(tǒng)正向引物、正向探針和反向 引物模式基礎(chǔ)上，增加了擴(kuò)增核酸長度一致和TM值相同的臨近反向引物、反向探針和正 向引物的序列設(shè)計技術(shù)，該技術(shù)較單正向序列的探針擴(kuò)增敏感性高10 50倍左右，擴(kuò)增 效率提高80%以上。
5. 在無色的促熒光劑中加入終濃度為0.01%的石綠，使最終配制的PCR工作液呈淺藍(lán)色， 在PCR擴(kuò)增的預(yù)變性過程退色，使PCR的操作輕松、準(zhǔn)確，不但不影響熒光PCR的檢 領(lǐng)(]，而且具有穩(wěn)定熒光信號和增強(qiáng)熒光PCR擴(kuò)增效率的重要功能。
6. 采用兩段變性和復(fù)性溫度梯度的設(shè)定方法，只在后段溫度梯度的復(fù)性期采集熒光信號， 該方法不但方便熒光曲線的分析，而且延長熒光PCR儀器的使用壽命。
全文摘要
本發(fā)明采用申請人發(fā)明的微量核酸釋放劑，實現(xiàn)在同一管中直接進(jìn)行乙肝病毒核酸提取和熒光擴(kuò)增，從根本上解決了多步驟核酸提取法帶來的核酸丟失和污染問題，并首次適用于全血標(biāo)本的熒光PCR檢測；采用已定量的原病毒血清作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品對標(biāo)本的全程監(jiān)控；采用雙對正反向引物和正反向兩條熒光修飾的探針進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步提升其敏感性和擴(kuò)增效率；引入藍(lán)色的促熒光劑，使配制后的PCR工作液呈淺藍(lán)色，在不影響熒光檢測的同時，具有穩(wěn)定熒光信號、增強(qiáng)擴(kuò)增效率等作用；設(shè)定兩段溫度梯度程序，采用后段熒光采集法，方便分析并提高儀器的使用壽命；以上技術(shù)較傳統(tǒng)方法具有革命性創(chuàng)新。
文檔編號C12Q1/68GK101302560SQ200710097429
公開日2008年11月12日 申請日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日
發(fā)明者(請求不公開姓名) 申請人:王海濱