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抑制sars病毒基因表達(dá)的小分子干擾核糖核酸的制作方法

文檔序號(hào):1079863閱讀:269來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):抑制sars病毒基因表達(dá)的小分子干擾核糖核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及反義技術(shù)領(lǐng)域,具體的本發(fā)明涉及具有抑制SARS病毒復(fù)制和/或SARS病毒基因表達(dá)的小分子干擾核糖核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
非典型肺炎即嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory SyndromeSARS)的病原體已經(jīng)確認(rèn)為一種冠狀病毒,該病毒是一種正鏈RNA病毒(GENEBANK登錄號(hào)NC_004718),基因組為單鏈RNA,含有Poly(A),總長(zhǎng)接近30kb。病毒表面有約20nm左右棒狀結(jié)構(gòu),呈皇冠狀。該病原體具有很強(qiáng)的感染性和傳染性,病毒在患者體內(nèi)經(jīng)過(guò)早期復(fù)制過(guò)程后,在肺部引發(fā)大規(guī)模炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致肺部組織損傷。
SARS病毒感染所引起的傳染性非典型肺炎嚴(yán)重危害了我國(guó)和世界多國(guó)人民的身體健康,也正在嚴(yán)重干擾我國(guó)經(jīng)濟(jì)的正常開(kāi)展.它已成為當(dāng)前我國(guó)一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)、政治、經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。對(duì)SARS病毒,現(xiàn)無(wú)有效藥物抑制其生長(zhǎng)。小分子核糖核酸(siRNA)是在RNAi(RNA干擾)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。與它有關(guān)的技術(shù)被美國(guó)“Science”評(píng)為2001年度國(guó)際十大科技突破的第二條,2002年度國(guó)際十大科技突破的第一條,2003年被評(píng)為第四條。其作用原理主要是siRNA部分解鏈,與靶mRNA反向互補(bǔ)的片段與靶序列結(jié)合,體內(nèi)的酶系將mRNA切斷。由此可抑制靶基因的表達(dá)。它是一個(gè)被認(rèn)為是最有前途的核酸藥物技術(shù)。
RNA干擾(RNA interference)是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默(gene silencing)。在此過(guò)程中,與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA(mRNA)被降解,從而抑制了該基因的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)在探查基因功能和治療人類(lèi)疾病方面有廣闊的應(yīng)用前景。RNA干擾的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚?,F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)資料提示,RNA干擾過(guò)程主要有2個(gè)步驟(1)長(zhǎng)雙鏈RNA被細(xì)胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶Dicer切成21~23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA,稱(chēng)為小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA);(2)小分子干擾性RNA與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體,稱(chēng)為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC),該復(fù)合體可識(shí)別與小分子干擾性RNA有同源序列的mRNA,并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。小分子干擾性RNA的發(fā)現(xiàn)不僅加深了人們對(duì)RNA干擾機(jī)制的認(rèn)識(shí),同時(shí)突破了一個(gè)用長(zhǎng)雙鏈RNA在哺乳類(lèi)細(xì)胞中抑制基因表達(dá)時(shí)常常遇到的障礙,即非特異性作用。長(zhǎng)于30個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA常常會(huì)激活蛋白激酶而誘發(fā)對(duì)蛋白質(zhì)合成的非特異抑制。小分子干擾RNA一般不會(huì)在哺乳類(lèi)細(xì)胞中誘發(fā)這種非特異性抑制。用人工合成的小分子干擾RNA可特異性地抑制哺乳類(lèi)細(xì)胞中外源性或內(nèi)源性基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明,長(zhǎng)度為21-23個(gè)堿基、3’末端有2個(gè)堿基突出的小分子干擾性RNA活性較高。小分子干擾RNA誘發(fā)的基因抑制具有高度的序列特異性。RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類(lèi)似的防御機(jī)制。那么,通過(guò)RNA干擾治療病毒感染性疾病在理論上完全可行。目前,已有很多研究表明通過(guò)RNA干擾可以抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。但是,這些研究只是停留在實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)細(xì)胞水平及初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平,尚未有將小分子干擾RNA用于人體試驗(yàn)的結(jié)果。將RNA干擾技術(shù)用于臨床治療人類(lèi)疾病還有許多研究工作要做,如何將小分子干擾性RNA安全、有效地導(dǎo)入靶組織或靶細(xì)胞就是一個(gè)必須解決的問(wèn)題。盡管如此,大量的體外實(shí)驗(yàn)研究資料已經(jīng)顯現(xiàn)出該技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用前景和新藥開(kāi)發(fā)中的巨大潛力。
SARS病毒RNA編碼多個(gè)蛋白質(zhì)基因。其中,M蛋白、E蛋白、N蛋白均為SARS病毒所特有,人細(xì)胞中無(wú)替代其功能的其他蛋白質(zhì)存在。如抑制這些蛋白質(zhì)中的任何一個(gè),SARS病毒的生長(zhǎng)周期即不能完成,病毒生長(zhǎng)即受到抑制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一組SARS病毒的小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列及其應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的就是提供一組小分子干擾核糖核酸、其載體、宿主細(xì)胞及其應(yīng)用。
本發(fā)明的第一方面提供了一組SARS病毒的小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列,其特征在于,所述靶序列為SARS病毒M、N、E基因上的連續(xù)19-25個(gè)核酸。
較佳的,所述siRNA靶序列為與SEQ ID NO1-SEQ ID NO26中任意一條序列的連續(xù)18個(gè)核酸序列相同的序列。更佳的,所述的siRNA靶序列為SEQ IDNO1-SEQ ID NO26所示的任意一條序列。
本發(fā)明的第二方面提供了上述siRNA靶序列在篩選抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用。所述抗SARS病毒藥物為治療或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關(guān)疾病的藥物。
本發(fā)明的第三方面提供了一組小分子干擾核糖核酸(siRNA),其特征在于,所述核糖核酸特異性地與與上述SARS病毒位點(diǎn)的mRNA相結(jié)合,且能抑制SARS病毒基因的表達(dá)和/或SARS病毒的復(fù)制。
較佳的,所述核糖核酸為具有19-25對(duì)堿基的雙鏈RNA復(fù)合體,所述雙鏈中至少有18對(duì)堿基互補(bǔ)。
在一優(yōu)選例中,所述的核糖核酸包括一條正義鏈和一條反義鏈,所述反義鏈序列與上述siRNA靶序列有至少18個(gè)堿基互補(bǔ),正義鏈序列與所述反義鏈序列有至少18個(gè)堿基互補(bǔ)。更佳的,所述正義鏈與反義鏈結(jié)合區(qū)域含19、20或21對(duì)堿基互補(bǔ)。
在另一優(yōu)選例中,所述反義鏈序列與SEQ ID NO1到SEQ ID NO29所示的任意一條序列有至少18個(gè)堿基互補(bǔ)。較佳的,所述反義鏈序列為SEQ ID NO30到SEQ ID NO55所示的任意一條序列或與前述序列有連續(xù)18個(gè)堿基相同的序列。
在另一優(yōu)選例中,所述核糖核酸的雙鏈選自(1)反義鏈序列為SEQ ID NOX,正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29),X為30-55中任一自然數(shù);(2)反義鏈序列為SEQ ID NOX,正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29),但與反義鏈5’端配對(duì)的正義鏈上相應(yīng)位置的堿基被替換為不配對(duì)的堿基,X為30-55中任一自然數(shù);(3)反義鏈序列為SEQ ID NO41,正義鏈序列為SEQ ID NO27;(4)反義鏈序列為SEQ ID NO54,正義鏈序列為SEQ ID NO28;(5)反義鏈序列為SEQ ID NO53,正義鏈序列為SEQ ID NO29。
較佳的,所述與反義鏈5’端配對(duì)的正義鏈上相應(yīng)位置的堿基的替換選自(1)C→U;(2)U→C;(3)A→G或I;(4)G→A或I。
在另一優(yōu)選例中,上述核糖核酸的正義鏈和反義鏈的3’端連接有兩個(gè)以上脫氧寡核苷酸的末端。較佳的,所述末端為dTdT、dAdA、dCdC、dGdG或dIdI。更佳的,所述末端為dTdT。
本發(fā)明的第四方面提供了一種載體,其特征在于,所述載體至少包含一條上述核糖核酸。較佳的,所述核糖核酸包括一個(gè)正義鏈區(qū)域和一個(gè)反義鏈區(qū)域,所述反義鏈區(qū)域包含與上述siRNA靶序列互補(bǔ)的序列,正義鏈區(qū)域序列與所述反義鏈區(qū)域序列互補(bǔ)。
在一優(yōu)選例中,所述核糖核酸的雙鏈選自(1)反義鏈序列為SEQ ID NOX,正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29),X為30-55中任一自然數(shù);
(2)反義鏈序列為SEQ ID NOX,正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29),但與反義鏈5’端配對(duì)的正義鏈上相應(yīng)位置的堿基被替換為不配對(duì)的堿基,X為30-55中任一自然數(shù);(3)反義鏈序列為SEQ ID NO41,正義鏈序列為SEQ ID NO27;(4)反義鏈序列為SEQ ID NO54,正義鏈序列為SEQ ID NO28;(5)反義鏈序列為SEQ ID NO53,正義鏈序列為SEQ ID NO29。
本發(fā)明的第五方面提供了一種宿主細(xì)胞,其特征在于,所述宿主細(xì)胞包含上述載體。較佳的,所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更佳的,所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
本發(fā)明的第六方面提供了上述核糖核酸的應(yīng)用,其特征在于上述核糖核酸在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第七方面提供了一種組合物,其特征在于,它包括安全有效量的上述核糖核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。較佳的,所述核糖核酸包含一條正義鏈和一條反義鏈,所述反義鏈為選自SEQ NO30到SEQ NO55所示的任意一條核苷酸序列,正義鏈區(qū)域序列與所述反義鏈區(qū)域序列互補(bǔ)。
本發(fā)明的第八方面提供了上述載體在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第九方面提供了上述宿主細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。較佳的,所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更佳的,所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
如本發(fā)明所用,術(shù)語(yǔ)“小分子干擾核糖核酸”是指包含SEQ ID NO1-SEQID NO55所示序列的siRNA和其類(lèi)似物,也指一系列化學(xué)物質(zhì),這些化學(xué)物質(zhì)具有一系列核苷酸堿基序列,能通過(guò)與SARS病毒的核苷酸堿基氫鍵相互作用識(shí)別SARS病毒序列或其部分序列。
這些RNA類(lèi)似物包括但不限于2’-O-烷基糖修飾、甲基磷酸脂、硫代磷酸酯、二磷酸酯、甲縮醛(formacetal)、3’-硫代甲縮醛(3’-thioformacetal)、砜、氨基磺酸酯和硝基骨架修飾、氨基化合物和其中堿基部分已被修飾的類(lèi)似物。而且,分子的類(lèi)似物可以為多聚物,其中的核糖部分已被其它合適的部分修飾或替換,產(chǎn)生的多聚物包括但不限于嗎琳代類(lèi)似物和肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)及其它類(lèi)似物。這些類(lèi)似物包括上述修飾的不同組合,包含連接基團(tuán)和/或糖或堿基的結(jié)構(gòu)修飾來(lái)改進(jìn)RNaseH介導(dǎo)的SARS病毒RNA的破壞、結(jié)合親和力、核酸酶抗性和/或其特異性。
在本發(fā)明中,術(shù)語(yǔ)“小分子核糖核酸”、“小分子干擾核糖核酸”或“siRNA”“本發(fā)明核糖核酸”可互換使用,它們都指具有抑制SARS病毒表達(dá)的核糖核酸序列,包括正義鏈區(qū)域(SEQ ID NO1到SEQ ID NO29中任一條序列)和反義鏈區(qū)域(SEQ ID NO30到SEQ ID NO55中任一條序列)的核糖核酸(RNA)。
目前,已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明的RNA序列。然后可將該RNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的RNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核糖核酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。所述載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒及其他載體形式。表達(dá)載體中的核糖核酸序列可以可操作地和表達(dá)控制序列連接,還包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn),優(yōu)選的包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記。所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌如大腸桿菌,真菌如酵母,昆蟲(chóng)細(xì)胞如Sf9,動(dòng)物細(xì)胞(尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞)如CHO、COS或人類(lèi)的細(xì)胞等。通過(guò)本文的闡述,適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞的選擇都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
在治療應(yīng)用中,本發(fā)明的核糖核酸能夠根據(jù)不同給藥方式配成制劑,包括口服、局部或局部化給藥。技術(shù)和配方通常在最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa中可以找到?;钚越M分為siRNA,其通常結(jié)合著一種載體如稀釋的賦形劑,包括裝填物、補(bǔ)充劑、接合劑、潤(rùn)濕劑、分解質(zhì)、表面活性劑、可降解的多聚物或潤(rùn)滑劑、依賴(lài)于給藥模式的性質(zhì)和配藥形式。典型的配藥形式包括藥片、藥粉,藥粒和膠囊,液體制劑包括懸浮液、乳化液和溶液。
本發(fā)明的核糖核酸特別適合于口服給藥,這在常規(guī)的藥物傳送條件下需要在將藥暴露于胃酸條件下長(zhǎng)達(dá)4小時(shí),當(dāng)以持續(xù)釋放的形式呈遞時(shí),能夠長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)。將這些siRNA配成以持續(xù)釋放形式的制劑對(duì)于治療非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病非常有利。
還可以通過(guò)跨粘膜或經(jīng)皮方法獲得siRNA系統(tǒng)給藥,或口服復(fù)合物。對(duì)于跨粘膜或經(jīng)皮給藥,適合于穿透屏障的滲透劑可以被用于制劑中。這些滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的,包括,例如用于跨粘膜給藥的膽酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外,去垢劑可以被用來(lái)協(xié)助透過(guò)??缯衬そo藥,例如可以是通過(guò)用鼻腔噴霧,以及適合于吸入或栓劑給藥的制劑。鼻腔噴霧制劑可用于治療和/或預(yù)防非典型肺炎和由SARS病毒引起的疾病。
本發(fā)明的核糖核酸也能夠與適于被試者施用的可藥用載體結(jié)合。合適的藥物載體的例子為各種陽(yáng)離子脂質(zhì)體,包括但不限于N-(1-2,3-二油基氧)丙基-n,n,n-三甲基銨氯(N-(1-2,3-dioleyloxy)ProPyl)-n,n,n-trimethylammonium chloride)(DOTMA)和二油?;字峄掖及?dioleoylphophotidyl ethanolamine)(DOPE)。脂質(zhì)體也是本發(fā)明的siRNA的合適載體。其它合適的載體為包含所要求的siRNA的緩釋凝膠或聚合體。
本發(fā)明的核糖核酸可以通過(guò)任何有效途徑施用給病人,包括肌肉注射、靜脈內(nèi)注射、胸內(nèi)注射、鼻內(nèi)注射、腹膜注射、皮下注射、和口服給藥??诜o藥需要腸衣以保護(hù)所要求的反義分子和其類(lèi)似物在胃腸道中不被降解。siRNA可以與一定量的生理上可接受的載體和稀釋劑混合,例如鹽溶液或其它合適的液體。
任何所施用的特定siRNA的實(shí)際用量依賴(lài)于很多因素,如疾病或感染的類(lèi)型和階段、siRNA對(duì)體內(nèi)其它細(xì)胞的毒性、其被細(xì)胞吸收的速率、施用反義分子的病人的年齡和體重。通過(guò)常規(guī)方法例如逐漸增加siRNA的劑量使其從對(duì)抑制細(xì)胞增殖無(wú)效到有效,可以確定病人的有效量。呈遞給疾病細(xì)胞的濃度范圍從5nM到約5μM都能夠有效抑制基因表達(dá)并表現(xiàn)出可檢測(cè)的表型。較佳的,濃度范圍從10nM到約100nM,如15號(hào)siRNA的較佳濃度為13nM。當(dāng)然,具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素,這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。


圖1.RT-PCR循環(huán)圈數(shù)的確定。
圖2.RT-PCR循環(huán)數(shù)與DNA產(chǎn)量的關(guān)系曲線。
圖3.針對(duì)E基因的siRNA的篩選。
圖4.針對(duì)M基因的siRNA的篩選。
圖5.針對(duì)N基因的siRNA的篩選。
圖6.No.90號(hào)siRNA對(duì)SARS病毒E基因表達(dá)的抑制效果與其劑量的關(guān)系。
圖7.No.15號(hào)siRNA對(duì)SARS病毒M基因表達(dá)的抑制效果與其劑量的關(guān)系。
圖8.No.58號(hào)siRNA對(duì)SARS病毒N基因表達(dá)的抑制效果與其劑量的關(guān)系。
圖9.No.90號(hào)siRNA對(duì)GFP-E融合蛋白表達(dá)的抑制。
圖10.No.15號(hào)siRNA對(duì)GFP-M融合蛋白表達(dá)的抑制。
圖11.No.58號(hào)siRNA對(duì)GFP-N融合蛋白表達(dá)的抑制。
圖12.反義鏈5’端不配對(duì)的siRNA在Vero E6細(xì)胞中對(duì)SARS基因表達(dá)的抑制作用。
圖13.針對(duì)E基因的siRNA靶位點(diǎn)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬14.針對(duì)M基因的siRNA靶位點(diǎn)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬15.針對(duì)N基因的siRNA靶位點(diǎn)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一siRNA靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)對(duì)SARS病毒RNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)模擬。在M、N、E蛋白編碼區(qū)內(nèi)和在負(fù)鏈RNA中選取下列位點(diǎn)

表1(二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖見(jiàn)附圖13、14、15)表1所示靶位點(diǎn)序列與相同編號(hào)的siRNA的正義鏈序列相同,其序列表中的序列號(hào)見(jiàn)最右側(cè)一例。本表格所示序列僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例二.siRNA的合成1.用Bechman Oligo 1000M合成儀(Bechman)合成siRNA的正義鏈和反義鏈(序列見(jiàn)表2,表3)。
2.退火形成siRNA1)將合成的siRNA正義反義鏈溶于焦磷酸二乙脂(DEPC)處理過(guò)的水中。
2)制備退火緩沖液(2x)200mM乙酸鉀,4mM乙酸鎂,60mM Hepes-KOH(pH7.4)。
3)制備20uM的siRNA貯存液2x退火緩沖液 100ulsiRNA正義鏈 Xul(使得終濃度為20uM)siRNA反義鏈 Yul(使得終濃度為20uM)水(DEPC處理) (100-X-Y)ul上述成分混勻,于90℃放置1分鐘,然后于37℃放置1小時(shí)。貯存于-20℃。
實(shí)施例三.siRNA在vero-E6細(xì)胞中抑制M、N、E蛋白表達(dá)的鑒定1.方法(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
a.轉(zhuǎn)染前一天于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔接種0.5×105個(gè)Vero-E6細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)),5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過(guò)夜。至轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔面積的30-50%。
b.M、N、E蛋白表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑,按其操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。具體用量為每孔細(xì)胞加靶基因載體50ng,siRNA用量為0.75ug,Lipofectamine 2000 2ul。
c.6小時(shí)后補(bǔ)加胎牛血清至終濃度為10%。于5%CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)后檢測(cè)。
(2)RT-PCR檢測(cè)a.轉(zhuǎn)染后48小時(shí),除去培養(yǎng)基,用無(wú)菌PBS緩沖液清洗細(xì)胞三次。
b.用Trizol Reagent(GIBCO)抽提細(xì)胞總RNA溶于30ul水(RNase free)中。用無(wú)RNA酶(RNase free)的DNA酶(DNase)于37℃消化30分鐘,然后于60℃處理10分鐘將DNase熱滅活。
c.用One step RNA PCR kit(TaKaRa)對(duì)抽提的總RNA,取5ul為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),以確定siRNA的抑制效果并進(jìn)行篩選。RT-PCR條件如下
50℃,30min;94℃,2min; 72℃,10min反應(yīng)總體積為50ul。
d.RT-PCR循環(huán)數(shù)的確定以M基因?yàn)闃颖?,?4孔板中轉(zhuǎn)入50ng M基因的表達(dá)載體。24小時(shí)后抽總RNA溶于30ul水(RNase free)中。取5ul為模板,如上條件做RT-PCR。分別于20、25、26、27、28、29、32、34個(gè)循環(huán)處取樣20ul進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。由圖2可得,取28個(gè)循環(huán)做RT-PCR能較真實(shí)的反應(yīng)模板量。
(3)siRNA對(duì)基因表達(dá)抑制率的計(jì)算 其中A為加藥組靶mRNA RT-PCR條帶的灰度;A’為加藥組作為RT-PCR對(duì)照的β-actine mRNA RT-PCR條帶的灰度;B為對(duì)照組靶mRNA RT-PCR條帶的灰度;B’為對(duì)照組作為RT-PCR對(duì)照的β-actine mRNA RT-PCR條帶的灰度。
(4)在蛋白水平檢測(cè)siRNA對(duì)SARS病毒基因表達(dá)的抑制作用由于目前尚未有針對(duì)SARS病毒結(jié)構(gòu)及功能蛋白的抗體,因此,構(gòu)建SARS病毒E,M及N蛋白基因與報(bào)告基因-綠色熒光蛋白(GFP)融合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP/E,pEGFP/M,及pEGFP/N(GFP表達(dá)載體pEGFP-N3購(gòu)自Clontech)。將siRNA與此GFP融合蛋白表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞。48小時(shí)后,通過(guò)熒光顯微鏡(Olympus BX-50)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度來(lái)判定蛋白的表達(dá)水平。
(5)針對(duì)E、M、N基因的siRNA的篩選方法。
將siRNA與E、M或N基因表達(dá)載體(pCDNA3.1/E,pCDNA3.1/M或pCDNA3.1/N)共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,48小時(shí)后抽提總RNA做RT-PCR檢測(cè),將RT-PCR產(chǎn)物跑2%的Agarose凝膠電泳。A,B為兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的電泳結(jié)果。C.兩次結(jié)果的凝膠圖象掃描測(cè)出條帶密度數(shù)據(jù),以只轉(zhuǎn)pCDNA3.1/X(X即E、M或N)載體的結(jié)果做參照(抑制效果定為0%)計(jì)算出各種siRNA的抑制強(qiáng)度,取兩次結(jié)果的平均值作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖3、4、5。具體結(jié)果見(jiàn)表2、表3。
2.結(jié)果1).siRNA的篩選I.篩選結(jié)果抑制效率<30%的siRNA

表2抑制效率>30%的siRNA

11的上表面所成的角度(以下稱(chēng)作頭的打開(kāi)角度),θ2是上述凸部12a對(duì)上述切線的傾斜角度,θ3是上述壓紙輥1與上述發(fā)熱元件3的切線、和供記錄的介質(zhì)7、8之中成為位于熱敏頭2的設(shè)置側(cè)的介質(zhì)7、8(在本實(shí)施方式的情況下是墨帶8)的傳送路徑所成的角度,θ’是頭返回角度。這里所謂的頭返回角度θ’是指上述凸部12a的傾斜角度θ2與角度θ1之差,θ1是上述壓紙輥1與上述發(fā)熱元件3的切線和上述基板11的表面所成的角度(參照式3)。
在這里,有關(guān)θ’,如式3所示,示出了成為設(shè)定為3±1(°)的穩(wěn)妥性的根據(jù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
在本實(shí)驗(yàn)中,使用上述L尺寸設(shè)定為1.4mm、密封部件14的頂點(diǎn)距離上述基板11的上表面的高度尺寸H設(shè)定為0.3mm、保溫層12的凸部12a的傾斜角度θ2設(shè)定為7°的熱敏頭2,來(lái)觀察調(diào)整了頭的打開(kāi)角度θ1時(shí)的記錄狀態(tài)。其結(jié)果如下表所示,能得到良好記錄結(jié)果的是頭的打開(kāi)角度θ1為3°的情況和5°的情況。根據(jù)上述結(jié)果,證明了上述式3所示的θ’=3±1(°)成立。
表1


實(shí)驗(yàn)結(jié)果○好△一般×差實(shí)施例六 No.58號(hào)siRNA對(duì)SARS病毒N基因表達(dá)的抑制效果與其劑量的關(guān)系。
方法同實(shí)施例四。圖8顯示13nM的No.58號(hào)siRNA就可達(dá)到50%的抑制效率。
實(shí)施例七 No.90號(hào)siRNA對(duì)GFP-E融合蛋白表達(dá)的抑制。
用30nM No.90號(hào)siRNA與SARS病毒E蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達(dá)載體(pEGFP/E)共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,48小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光的強(qiáng)度。
A.只轉(zhuǎn)pEGFP/E載體(none);B.pEGFP/E與非特異的對(duì)照siRNA共轉(zhuǎn)染(control);C,pEGFP/E與No.90號(hào)siRNA共轉(zhuǎn)染。A,B,C為熒光檢測(cè)結(jié)果;D,E,F(xiàn)分別為同一視野下用明場(chǎng)觀察的細(xì)胞情況。G.分別計(jì)數(shù)每組實(shí)驗(yàn)的四個(gè)視野中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)目及總細(xì)胞數(shù),換算成每500個(gè)總細(xì)胞中帶熒光的細(xì)胞的數(shù)目,取平均值。將control siRNA的抑制效率設(shè)定為0%時(shí),可算得30nM的90號(hào)siRNA抑制效率為88.0%(見(jiàn)圖9)。
實(shí)施例八 No.15號(hào)siRNA對(duì)GFP-M融合蛋白表達(dá)的抑制。
用30nM No.15號(hào)siRNA與SARS病毒M蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達(dá)載體(pEGFP/M)共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,48小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光的強(qiáng)度。
A,只轉(zhuǎn)pEGFP/M載體(none);B,pEGFP/M與非特異的對(duì)照siRNA共轉(zhuǎn)染(control);C,pEGFP/M與No.15號(hào)siRNA共轉(zhuǎn)染。A,B,C為熒光檢測(cè)結(jié)果;D,E,F(xiàn)分別為同一視野下用明場(chǎng)觀察的細(xì)胞情況。G.分別計(jì)數(shù)每組實(shí)驗(yàn)的四個(gè)視野中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)目及總細(xì)胞數(shù),換算成每500個(gè)總細(xì)胞中帶熒光的細(xì)胞的數(shù)目,取平均值。將control siRNA的抑制效率設(shè)定為0%時(shí),可算得30nM的15號(hào)siRNA抑制效率為89.4%(見(jiàn)圖10)。
實(shí)施例九.No.58號(hào)siRNA對(duì)GFP-N融合蛋白表達(dá)的抑制。
用30nM No.58號(hào)siRNA與SARS病毒N蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達(dá)載體(pEGFP/N)共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,48小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光的強(qiáng)度。
A,只轉(zhuǎn)pEGFP/N載體(none);B,pEGFP/N與非特異的對(duì)照siRNA共轉(zhuǎn)染(control);C,pEGFP/M與No.58號(hào)siRNA共轉(zhuǎn)染。A,B,C為熒光檢測(cè)結(jié)果;D,E,F(xiàn)分別為同一視野下用明場(chǎng)觀察的細(xì)胞情況。G.分別計(jì)數(shù)每組實(shí)驗(yàn)的四個(gè)視野中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)目及總細(xì)胞數(shù),換算成每500個(gè)總細(xì)胞中帶熒光的細(xì)胞的數(shù)目,取平均值。將control siRNA的抑制效率設(shè)定為0%時(shí),可算得30nM的58號(hào)siRNA抑制效率為88.8%(見(jiàn)圖11)。
實(shí)施例十 反義鏈5’端不配對(duì)的siRNA在Vero E6細(xì)胞中對(duì)SARS基因表達(dá)的抑制作用1.依據(jù)根據(jù)Dianne S.Schwarz等人最新研究發(fā)現(xiàn),siRNA雙鏈兩端配對(duì)的穩(wěn)定性決定了哪一端更容易先解鏈,從而使該端為5’端的那條鏈更多的進(jìn)入RISC復(fù)合體(一種siRNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體,能特異性的降解靶基因mRNA)。(Cell,Vol 115,199-208,17 October 2003)選出三個(gè)siRNANo.8、No.51、及No.65,將正義鏈3’端最后一個(gè)核苷酸(21位)突變?nèi)缦翹o.8*(正義鏈序列號(hào)為SEQ ID NO27)5’CGU CGC AGC GUG UAG GCA CUA dTdT 3’||| ||| ||| ||| ||| ||| ||о3’dTdT GCA GCG UCG CAC AUC CGU GAC 5’No.51*(正義鏈序列號(hào)為SEQ ID NO28)5’AAC GGU UUA CGU CUA CUC GCA dTdT 3’||| ||| ||| ||| ||| ||| ||о3’dTdT UUG CCA AAU GCA GAU GAG CGC 5’No.65*(正義鏈序列號(hào)為SEQ ID NO29)5’AAC GUA CUG CCA CAA AAC AGC dTdT 3’||| ||| ||| ||| ||| ||| ||о3’dTdT UUG CAU GAC GGU GUU UUG UCA 5’(注突變位點(diǎn)以帶下劃線的粗斜體標(biāo)出,*表示帶突變的siRNA,下同。)用pCDNA3.1/E與No.51 siRNA或No.51*siRNA、pCDNA3.1/M與No.8 siRNA或No.8*siRNA、pCDNA3.1/N與No.65 siRNA或No.65*siRNA分別共轉(zhuǎn)染VeroE6細(xì)胞,以及單轉(zhuǎn)SARS病毒基因表達(dá)載體(none)或其與非特異組siRNA(control)共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,48小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)SARS病毒基因表達(dá)水平。2%agarose電泳,EB染色(A)?;叶葤呙钘l帶深淺,將control組抑制率設(shè)為0%,算出各組siRNA的抑制百分率(B)。
與反義鏈5’端第一個(gè)堿基不配對(duì)的siRNA抑制SARS病毒基因表達(dá)的效果是正常組siRNA的1.5倍,可以按照這種方法將篩選過(guò)程中得到的抑制效果不佳的siRNA重新設(shè)計(jì),應(yīng)能使之能更有效的抑制SARS病毒基因的表達(dá)(見(jiàn)圖12)。
較佳的,與反義鏈5’端第一個(gè)堿基不配對(duì)的siRNA的正義鏈3’端堿基可按如下原則替換,嘧啶(包括C、U)與嘧啶替換,嘌呤(包括G、A)與嘌呤(包括G、A、I(次黃嘌呤))替換。如C與U互換,G替換為A或工。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>抑制SARS病毒基因表達(dá)的小分子干擾核糖核酸<130>XQ041027N<160>55<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>1aaacuauaaa uuaaauacag a 21<210>2<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>2ugcugcuguc uacagaauua a 21<210>3<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>3uugcgaaugg ccggacacuc c 21<210>4<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒
<400>4aacaaagaag gcaucguaug g 21<210>5<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>5ugaggcaucu aaaaagccuc g21<210>6<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>6aagagcuacc cgacgaguuc g 21<210>7<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>7aaggccaaaa cagcgccgac c 21<210>8<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>8uuucguggua uucuugcuag u 21<210>9<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>9uucgauugug ugcguacugc u 21<210>10
<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>10uuaauaguua auagcguacu u 21<210>11<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>11ccagaccgcu cauggaaagu g 21<210>12<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>12cgucgcagcg uguaggcacu g 21<210>13<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>13agcuuaaaca acuccuggaa c 21<210>14<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>14uagcuacuuc guugcuuccu u 21<210>15<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒
<400>15agagaucacu guggcuacau c 21<210>16<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>16uauuguaggc uugauguggc u 21<210>17<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>17uugcugcaua caaccgcuac c 21<210>18<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>18aauacaccca aagaccacau u 21<210>19<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>19aauccuaaua acaaugcugc c 21<210>20<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>20gauaauggac cccaaucaaa c 21<210>21
<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>21aaggaggaac uuagauuccc u 21<210>22<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>22aauaauacug cgucuugguu c 21<210>23<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>23ucaaggaaca acauugccaa a 21<210>24<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>24aacguacugc cacaaaacag u 21<210>25<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>25aacgguuuac gucuacucgc g 21<210>26<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒
<400>26ugaaggaguu ccugaucuuc u 21<210>27<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>27cgucgcagcg uguaggcacu a 21<210>28<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>28aacgguuuac gucuacucgc a 21<210>29<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>29aacguacugc cacaaaacag c 21<210>30<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>30ucuguauuua auuuauaguu u 21<210>31<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>31uuaauucugu agacagcagc a 21<210>32
<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>32ggaguguccg gccauucgca a 21<210>33<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>33ccauacgaug ccuucuuugu u 21<210>34<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>34cgaggcuuuu uagaugccuc a 21<210>35<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>35cgaacucguc ggguagcucu u 21<210>36<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>36ggucggcgcu guuuuggccu u 21<210>37<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒
<400>37acuagcaaga auaccacgaa a 21<210>38<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>38agcaguacgc acacaaucga a 21<210>39<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>39aaguacgcua uuaacuauua a 21<210>40<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>40cacuuuccau gagcggucug g 21<210>41<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>41cagugccuac acgcugcgac g 21<210>42<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>42guuccaggag uuguuuaagc u 21<210>43
<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>43aaggaagcaa cgaaguagcu a 21<210>44<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>44gauguagcca cagugaucuc u 21<210>45<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>45agccacauca agccuacaau a 21<210>46<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>46gguagcgguu guaugcagca a 21<210>47<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>47aauguggucu uuggguguau u 21<210>48<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒
<400>48ggcagcauug uuauuaggau u 21<210>49<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>49guuugauugg gguccauuau c 21<210>50<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>50agggaaucua aguuccuccu u 21<210>51<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>51gaaccaagac gcaguauuau u 21<210>52<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>52uuuggcaaug uuguuccuug a 21<210>53<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>53acuguuuugu ggcaguacgu u 21<210>54
<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>54cgcgaguaga cguaaaccgu u 21<210>55<211>21<212>RNA<213>SARS冠狀病毒<400>55agaagaucag gaacuccuuc a 2權(quán)利要求
1.一組SARS病毒的小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列,其特征在于,所述靶序列為SARS病毒M、N、E基因上的連續(xù)19-25個(gè)核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的siRNA靶序列,其特征在于,所述靶序列為SEQ ID NO1-SEQID NO26中任意一條序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的siRNA靶序列在篩選抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用。
4.一組小分子干擾核糖核酸(siRNA),其特征在于,所述核糖核酸特異性地與權(quán)利要求1所述的SARS病毒位點(diǎn)的mRNA相結(jié)合,且能抑制SARS病毒基因的表達(dá)和/或SARS病毒的復(fù)制。
5.如權(quán)利要求4所述的核糖核酸,其特征在于,所述核糖核酸為具有19-25對(duì)堿基的雙鏈RNA復(fù)合體,所述雙鏈中至少有18個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的核糖核酸,其特征在于,所述核糖核酸包括一條正義鏈和一條反義鏈,所述反義鏈序列與權(quán)利要求2所述siRNA靶序列有至少18個(gè)堿基互補(bǔ),正義鏈序列與所述反義鏈序列有至少18個(gè)堿基互補(bǔ)。
7.如權(quán)利要求6所述的核糖核酸,其特征在于,所述正義鏈與反義鏈結(jié)合區(qū)域含19、20或21對(duì)互補(bǔ)堿基。
8.如權(quán)利要求6所述的核糖核酸,其特征在于,所述反義鏈序列與SEQ ID NO1到SEQ ID NO29所示的任意一條序列有至少18個(gè)堿基互補(bǔ)。
9.如權(quán)利要求4或5所述的核糖核酸,其特征在于,所述核糖核酸的雙鏈選自(1)反義鏈序列為SEQ ID NOX,正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29),X為30-55中任一自然數(shù);(2)反義鏈序列為SEQ ID NOX,正義鏈序列為SEQ ID NO(X-29),但與反義鏈5’端配對(duì)的正義鏈上相應(yīng)位置的堿基被替換為不配對(duì)的堿基,X為30-55中任一自然數(shù);(3)反義鏈序列為SEQ ID No41,正義鏈序列為SEQ ID NO27;(4)反義鏈序列為SEQ ID NO54,正義鏈序列為SEQ ID NO28;(5)反義鏈序列為SEQ ID NO53,正義鏈序列為SEQ ID NO29。
10.如權(quán)利要求9所述的核糖核酸,其特征在于,所述與反義鏈5’端配對(duì)的正義鏈上相應(yīng)位置的堿基的替換選自(1)C→U;(2)U→C;(3)A→G或I;(4)G→A或I。
11.如權(quán)利要求5所述的核糖核酸,其特征在于,所述正義鏈和反義鏈的3’端連接有兩個(gè)以上脫氧寡核苷酸的末端。
12.如權(quán)利要求6所述的核糖核酸,其特征在于,所述正義鏈和反義鏈的3’端連接有兩個(gè)以上脫氧寡核苷酸的末端。
13.一種載體,其特征在于,所述載體至少包含一條權(quán)利要求4所述的核糖核酸。
14.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞,其特征在于,所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含權(quán)利要求10所述的載體。
15.如權(quán)利要求14所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,其特征在于,所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求4所述的核糖核酸的應(yīng)用,其特征在于所述核糖核酸在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及其它相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
17.一種組合物,其特征在于,它包括安全有效量的權(quán)利要求4或5所述的核糖核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物,其特征在于所述的核糖核酸包含一條正義鏈和一條反義鏈,所述反義鏈為選自SEQ NO30到SEQ NO55所示的任意一條核苷酸序列,正義鏈區(qū)域序列與所述反義鏈區(qū)域序列互補(bǔ)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組能夠有效抑制SARS病毒RNA和蛋白表達(dá)的靶序列和小分子干擾核糖核酸(siRNA)、其載體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及其應(yīng)用,所述siRNA可以用于制備治療和/或預(yù)防SARS病毒所引起的非典型肺炎及相關(guān)疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1648249SQ20041001600
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月19日
發(fā)明者金由辛, 史毅, 羅海峰, 李林, 陸長(zhǎng)德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
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