蛋白酪氨酸激酶fyn癌基因在防治腸道病毒71型感染中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗腸道病毒71型感染的新靶點及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬人腸 道A類病毒，是導(dǎo)致手足口?。℉and-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。目 前，手足口病在世界多個地區(qū)暴發(fā)并流行，尤其是亞太地區(qū)。在我國，自2008年幾大省市 暴發(fā)手足口病疫情以來，該病的感染人數(shù)和死亡率一直居高不下，每年報告發(fā)病數(shù)超過100 萬例，死亡數(shù)近1000例。手足口病主要發(fā)病人群為5歲以下嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，手、 足、臀部以及口腔粘膜等部位出現(xiàn)皰疹等癥狀；少數(shù)患兒可發(fā)展為重癥患者，出現(xiàn)中樞神 經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS)病變，包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎、腦脊髓炎以 及神經(jīng)源性肺水腫等，嚴(yán)重威脅著嬰幼兒的生命健康[Solomon T，Lewthwaite P，Perera D, Cardosa MJ, McMinn P, Ooi MH. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71. Lancet Infect Dis.2010Nov;10(ll) :778-90.]。手足口病特別是重癥病 例多由腸道病毒71型（EV71)感染所致。然而，目前關(guān)于EV71引起手足口病的治療尚無特 異高效的抗病毒藥物，臨床上仍以對癥治療為主，在預(yù)防方面也無有效疫苗問世。
[0003] EV71感染具有嗜神經(jīng)性，易造成嚴(yán)重的CNS疾病及其并發(fā)癥，這也是導(dǎo)致手足口 病患者發(fā)展為重癥甚至死亡的主要原因。其中，腦干是最易被EV71感染的部位[Tee，K. K. , et al. Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin, population dynamics, natural selection,and seasonal periodicity of the VPlgene. J Virol, 2010. 84(7) :p. 3339-50.]，研究證實在EV71重癥患者的腦干神經(jīng)元等部位均能夠 檢測到EV71基因及抗原的存在，證明EV71能進(jìn)入CNS。EV71經(jīng)血液循環(huán)感染CNS需要穿越 血腦屏障，然而病毒如何穿過血腦屏障侵入CNS的機(jī)制還不清楚。血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB)是位于循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間一道主要的屏障，它限制著不同物質(zhì)在 兩個部位之間的自由運(yùn)輸，對維持CNS的體內(nèi)平衡以及保護(hù)CNS免受外界病原微生物的侵 襲中起著至關(guān)重要的作用[Dyrna F，Hanske S, Krueger M，Bechmann I. The blood-brain barrier. J Neuroimmune Pharmacol. 2013 ;8 (4) : 763-73.]。血腦屏障是由無窗孔的腦微 血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、細(xì)胞基膜和周細(xì)胞共同組成的一個 細(xì)胞復(fù)合體。在這個細(xì)胞復(fù)合體中，最主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs)及其緊密連接，其嚴(yán)整性的丟失被認(rèn)為是病毒 感染致腦組織損傷的一個重要原因。因此，探明EV71感染BMECs的機(jī)制并以此尋找新的 抗病毒靶點，對于保護(hù)血腦屏障的功能，以及防治EV71所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染至關(guān)重 要。
[0004] 在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，一系列廣泛的宿主細(xì)胞信號通路會被激活。這 些信號通路可以為病毒所利用，從而實現(xiàn)病毒自身有效的入侵、復(fù)制、釋放等生命過 程。隨著研究的深入，這些被病毒利用的信號激酶分子已成為抗病毒治療的重要靶 標(biāo)。研究表明，EV71感染需利用多條信號通路及其調(diào)控系統(tǒng)，如在感染早期與受體作 用后，通過激活Rho家族分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架系統(tǒng)，促進(jìn)病毒侵入（Hussain KMl，Leong KL，Ng MM, Chu JJ. The essential role of clathrin-mediated endocytosis in the infectious entry of human enterovirus 71. J Biol Chem. 2011 ；286 (1):309-21.)； 激活PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路，促進(jìn)病毒進(jìn)一步增殖并引發(fā)炎癥反應(yīng)；通過刺 激細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(cyclin dependent kinase 5，Cdk5)途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡等(Tung WH, Hsieh HL，Yang CM. Enterovirus 71induces C0X-2expression via MAPKs，NF-kappaB，and AP-lin SK-N-SH cells:Role of PGE(2)in viral replication. Cell Signal.2010,22(2):234-46.)。然而，目前關(guān)于EV71感染BMECs所引發(fā)的信號通路 及所利用的信號調(diào)節(jié)分子仍不清楚。
[0005] 蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK)及其調(diào)節(jié)分子是重要的 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能，同時也被證實參與調(diào)節(jié)多種病毒對 宿主細(xì)胞的感染過程（Pelkmans L，F(xiàn)ava E，Grabner H，Hannus M，et al. Genome-wide analysis of human kinases in clathrin-and caveolae/raft-mediated endocytosis. Nature. 2005, 436 (7047) : 78-86.)。如受體酪氨酸激酶銜接蛋白Grb2主要調(diào)節(jié)下游 信號ERK通路以及PI3K/Akt通路，參與調(diào)節(jié)了鼠白血病病毒MLV的感染過程（Chen Z,Kolokoltsov AA，Wang J，et al.GRB2interaction with the ecotropic murine leukemia virus receptor，mCAT-1，controls virus entry and is stimulated by virus binding. J Virol. 2012, 86(3) : 1421-32.)。銜接相關(guān)蛋白復(fù)合物 API (adaptor-related protein complex 1)能夠偶聯(lián)酪氨酸激酶信號，調(diào)節(jié)內(nèi)吞以及高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)功能。促細(xì)胞 分裂原磷酸化蛋白DAB (mitogen-responsive phosphoprotein)能夠與受體酪氨酸激酶銜 接蛋白Grb2作用后調(diào)節(jié)Ras信號通路。CBL泛素連接酶能夠與多種酪氨酸磷酸化分子作 用介導(dǎo)了蛋白的泛素化降解。Ezrin蛋白可通過酪氨酸激酶信號調(diào)節(jié)細(xì)胞微管系統(tǒng)，繼而 調(diào)節(jié)了細(xì)胞黏附與迀徙等生理過程；Ezrin蛋白也被證實參與了丙型肝炎病毒感染肝細(xì)胞 的過程（Bukong TN，Kodys K，Szabo G. Human ezrin-moesin-radixin proteins modulate hepatitis C virus infection. Hepatology. 2013,58(5):1569-79.)〇
[0006] 蛋白酪氨酸激酶 FYN 癌基因 （FYN proto-oncogene，Src family tyrosine kinase)屬于非受體型Src家族酪氨酸激酶分子（GeneAccession :NM_153048)，廣泛表達(dá) 于各種組織細(xì)胞中，尤其是在腦組織中高表達(dá)。FYN參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能以及細(xì)胞 癌變的過程。研究發(fā)現(xiàn)FYN也參與了多種病毒的感染過程，如柯薩奇病毒在感染宿主細(xì) 胞時需激活 FYN 來完成有效入侵（Coyne CB，Bergelson JM. Virus-induced Abl and FYN kinase signals permit coxsackievirus entry through epithelial tight junctions. Cell. 2006, 124(1): 119-31.)。
[0007] 胚胎 FYN 相關(guān)底物 EFS (Embryonal FYN-associated substrate)為酪氨酸 激酶FYN的相關(guān)銜接蛋白（GeneAccession :NM_005864)它能夠結(jié)合Src家族酪氨酸 激酶的SH3結(jié)構(gòu)域從而介導(dǎo)了一系列的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Donl in LT，Roman CA，Adlam M，et al.Defective thymocyte maturation by transgenic expression of a truncated form of the T lymphocyte adapter molecule and FYN substrate, Sin.J Immunol. 2002, 169(12) :6900-9.)。該基因具體的功能研究相對較少，在病毒感染過程中的 作用未見報道。
[0008] 目前還沒有任何關(guān)于FYN以及EFS分子在EV71感染HBMEC中作用的研究報道，對 于FYN以及EFS分子進(jìn)行深入研究不僅能夠提升對EV71感染與致病機(jī)制的認(rèn)識，也可以為 預(yù)防與治療EV71感染提供新的思路與靶點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗腸道病毒71型感染的新靶點。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供FYN的新用途，特別是在抗腸道病毒71型感染中的應(yīng) 用。
[0011] 本發(fā)明的第三目的在于提供干擾FYN分子表達(dá)的siRNA。
[0012] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：
[0013] 本發(fā)明，以人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC)作為靶細(xì)胞，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)靶 細(xì)胞宿主蛋白的表達(dá)，來尋找可有效抑制EV71感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC)的宿主 因子，從而保護(hù)血腦屏障的功能。本實驗選擇了一組宿主細(xì)胞酪氨酸激酶及其調(diào)節(jié)分子 來進(jìn)行篩選，這些分子在宿主細(xì)胞的酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，它 們往往也是在病毒感染過程中易被病毒"劫持"并利用的分子。這些分子包括：銜接蛋白 API (AP1M2)、2型DAB蛋白（DAB2)、CBL泛素連接酶（CBL、CBLB、CBLC)、蛋白酪氨酸激酶FYN 癌基因（FYN)、Ezrin蛋白（VIL2)、ERC1 (ELKS)、胚胎FYN相關(guān)底物EFS (EFS)、酪氨酸激酶銜 接蛋白Grb2(GRB2)。通過檢索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用現(xiàn)有的網(wǎng)絡(luò)資 源及常用軟件對這些基因進(jìn)行生物學(xué)分析，選擇編碼區(qū)作為siRNA設(shè)計的靶序列，然后設(shè) 計siRNA，通過下調(diào)這些分子，來觀察對EV71感染的影響。
[0014] 我們發(fā)現(xiàn)FYN以及EFS分子在EV71感染HBMEC中發(fā)揮著重要的作用，下調(diào)FYN或 EFS分子的表達(dá)，能明顯抑制E