癌癥病理演變前期GPR116基因mRNA水平的原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與癌癥病理演變前期mRNA表達改 變（病理演變過程中）的相關(guān)檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)已達到312萬，死亡 人數(shù)近260萬，患者超過700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800多萬， 患者約有8400多萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本 越來越高，按癌癥患者的年治療費用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達地區(qū)可能遠遠高出20 萬)，700多萬患者，每年的花費是1. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有1萬 億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥 診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點是提前做到預(yù)防性篩查，在瘤塊沒有出現(xiàn)之前篩查 GPR116基因的mRNA表達量，對表達量降低者，及時介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療，做到基 因水平癌癥的治未病。
[0003] 2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了抗癌大戰(zhàn)中是失 敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是：1.腫瘤細胞 異質(zhì)性(多態(tài)性）；2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計思路不完善(動物模型設(shè)計不科學(xué)） 等。同時，該報告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。
[0004] 本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的 早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技術(shù)）指標(biāo)來診斷癌癥，都是腫瘤 形成后診斷，前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋 放、或腫瘤的標(biāo)記物。傳統(tǒng)臨床觀念認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這 一概念值得認(rèn)真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募毎麑W(xué)角度 來分析，1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數(shù)遠不止 2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相 當(dāng)長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變 過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或器官 生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位 克隆生長，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時，同時發(fā) 現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實這時已經(jīng)是晚期診斷和晚期治療，這是導(dǎo)致癌 癥死亡率不降的真正原因。
[0005]隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，為 了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥，已取得長足進步。至今，我們已有可能 在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物（mRNA水平或microRNA)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌 變前期或癌細胞形成(單克隆）前，就可以做到早期預(yù)測和篩查。
[0006] 研究人員通過對AdhesionGPCR家族進行表達和功能篩查，確定了GPR116是一 個新型的乳腺癌轉(zhuǎn)移調(diào)控因子。他們發(fā)現(xiàn)在高度轉(zhuǎn)移性的（MDA-MB-231)乳腺癌細胞中下 調(diào)GPR116可以抑制細胞遷移和侵襲。與之相反，在轉(zhuǎn)移性較差的（MCF-7andHs578T)細 胞中異位表達GPR116則可促進細胞侵襲。此外，研究人員在兩個乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移小鼠模型 中均證實下調(diào)GPR116可以抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。進一步的機制研究證實，GPR116以一種RhoA 和Racl依賴性方式調(diào)節(jié)了板狀偽足和肌動蛋白應(yīng)力纖維形成。在分子水平上，GPR116通 過Gaq-p63Rh〇GEF-Rh〇A/Racl信號通路調(diào)控了細胞運動和形態(tài)。研究人員利用人類乳腺 癌患者的樣本進一步證實了GPR116在乳腺癌中的生物學(xué)意義，在這些樣本中GPR116的表 達與乳腺腫瘤的進程、復(fù)發(fā)和預(yù)后顯著相關(guān)。這些研究結(jié)果證實了GPR116對于乳腺癌轉(zhuǎn)移 至關(guān)重要，表明了GPR116是一個潛在的預(yù)后標(biāo)記物及對抗轉(zhuǎn)移性人類乳腺癌的藥物靶點。
[0007] 大量的研究證實GPR116基因在乳腺癌癌變前期表達上調(diào)，GPR116基因有原癌基 因和激發(fā)乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移作用，它的表達增高導(dǎo)致細胞癌變。實驗研究進一步發(fā)現(xiàn)，抑制 GPR116的表達則可使藥物誘發(fā)的小鼠乳腺癌細胞發(fā)生率明顯降低。
[0008] 本發(fā)明選擇多組臨床標(biāo)本(癌癥病人、高危人群、正常對照）采用核酸原位雜交技 術(shù)和免疫組化方法對GPR116基因mRNA乳腺癌的早期預(yù)警進行檢測分析。本發(fā)明人在研究 中發(fā)現(xiàn)GPR116基因mRNA在乳腺癌患者、癌癥高危人群、正常對照人有明顯的表達量變化， 將GPR116基因mRNA作為乳腺癌變病理變化前期篩查指標(biāo)，有非常重要的臨床診斷意義。作 于乳腺癌變前期篩查、及癌癥治療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)警也有非常重要的臨床意義。
[0009] 發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床 診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)有治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治未 病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明 人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的RNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了創(chuàng) 新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組 織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)癌前變的RNA水平，與癌癥早期基因病理生理學(xué) 演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)(疾病基因)，將臨床上腫瘤形成后診治模式提 高到腫瘤的預(yù)防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預(yù)防癌癥。
[0010] 目前，GPR116基因表達譜檢測方法用Northern雜交、基因芯片、實時熒光定量PCR 和Solexa測序等分析技術(shù)，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，而檢測mRNA比 DNA分析更科學(xué)（DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是DNA功能的體現(xiàn))，比蛋白分析 更可靠(發(fā)明人在采用雙標(biāo)記技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)mRNA與蛋白轉(zhuǎn)錄和表達時空上，有時候不同 步)。根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料采用原位雜交技術(shù)和組化免疫方法檢測GPR116基因mRNA水平 表達量的檢測技術(shù)及試劑盒未見報道。
[0011] 本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計了（乳腺癌患者、高危人群、正常對照）不 同數(shù)據(jù)例組，用原位雜交技術(shù)進行檢測，結(jié)果表明以上乳腺癌病人GPR116基因mRNA都高表 達，高危人群有不同程度表達10-25%，正常對照都是零表達。表明GPR116基因mRNA是乳 腺癌變前期篩查的重要標(biāo)志物。
[0012] 原位雜交技術(shù)（insituhybridization)是將分子生物學(xué)與細胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈（即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進行探測，從而在細 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
[0013] 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（雖不明確 該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo) 記，以利于以后的檢測。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的 同位素標(biāo)記物有 3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但 是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素 標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其 靈敏的。
[0014] 根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和 顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針（RNA)和檢測的靶RNA是采用堿基互 補（雜交互補）的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結(jié)果沒 有影響。
[0015]鑒于目前臨床上癌變前期的診斷(影像醫(yī)學(xué)和生化指標(biāo)物都是腫瘤形成后的診 斷）是晚期診斷，治療也是晚期治療，也是導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想 完善目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達到預(yù)防性診治，將目 前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技術(shù)，做了創(chuàng)新 性的技術(shù)突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平 真正早期篩查的技術(shù)，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。
[0016]綜上所述，本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交 檢測探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于乳腺癌病理演變前期篩查及治 療后轉(zhuǎn)移早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的 雜交探針分別具有序列表SEQIDN0:AY140958,核苷酸序列長度是3903bp，⑶S序列是 1. . . 3903bp，探針全長480bp取自CDS中一段，所述的雜交探針序列如SEQIDNO. 1所示。
[0018] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯 色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
[0019] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。
[0020] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。
[0021] 本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。
[0022] 本發(fā)明的乳腺癌病理演變前期GPR116基因mRNA篩查試劑盒應(yīng)用價值在于，對乳 腺癌病理演變前期篩查，及癌變后或治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴散發(fā)生預(yù)警，進一步配合臨床治 療。
[0023] 本發(fā)明還提供一種GPR116原位雜交的檢測方法，包括以下步驟： (1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2) 檢測所述雜交復(fù)合體。
[0024] 本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為： 核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
[0025] 本發(fā)明所述的檢測