方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或 其它器官組織細胞標本。更優(yōu)選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自乳腺 癌患者、高危人群、健康正常人群。
[0026] 本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以GPR116基 因mRNA為檢測對象，合成探針是GPR116基因雜交互補序列，檢測的底物是人體血液標本白 細胞或組織細胞的GPR116基因mRNA的表達量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供GPR116 基因mRNA的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上mRNA的表達 量，正常人GPR116零表達，細胞不顯色；高危人群低表達，少量細胞染色；癌癥病人高表達， 細胞大量染色。
[0027] 本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括： 1) .將待測標本放入反應槽中； 2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液； 3) .儀器自動棄去液體，自動后固定； 4) .儀器自動棄去液體，自動預雜交（42°C); 5) .儀器自動棄去液體，自動清洗； 6) .儀器自動棄去液體，自動雜交（42°C); 7) .儀器自動棄去液體，自動清洗； 8) .儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫）； 9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色； 10) .取出封片鏡檢。
[0028] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是：以GPR116基因mRNA合成的核酸探針用地高 辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克 服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的RNA的表達量。
[0029] 本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細胞中的 GPR116基因mRNA表達量，用來確定乳腺癌病理演變前期的mRNA變化量，預警癌癥是否發(fā)生 及癌癥患者治療后是否復發(fā)、轉(zhuǎn)移的預測。因為GPR116基因mRNA在正常人零表達，GPR116 基因類似于原癌基因有致癌作用和促癌細胞轉(zhuǎn)移作用，如果表達量增高說明乳腺癌已經(jīng)發(fā) 生或癌癥發(fā)生風險高，臨床上及早介入早期調(diào)控和治療，抑制GPR116基因的表達，保持抑 癌基因與致癌基因生理平衡，預防癌癥發(fā)生。
[0030] 一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
[0031] 本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測癌癥病理演變過程中GPR116基因mRNA表達量 的變化，預警乳腺癌癥發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌癥標志 物，以及影像醫(yī)學檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在mRNA水平檢測GPR116基因的異常表 達，在影像醫(yī)學檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶復發(fā)之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之前，亦未形 成腫瘤之前，能及早做到GPR116基因表達異常的信息采集，給臨床乳腺癌患者一個真正的 早期預警，這樣才有可能實施癌癥的早期篩查、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底 根治癌癥惡疾。
[0032] 此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測 方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明GPR116基因mRNA原位雜交實施例圖； 圖2是本發(fā)明實施例中癌癥病人GPR116基因mRNA表達圖片； 圖3是本發(fā)明實施例中高危人群GPR116基因mRNA表達圖片； 圖4是本發(fā)明實施例中正常人GPR116基因mRNA表達圖片。
[0034]
【具體實施方式】： 下面結(jié)合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應該理解，下面的實施例用于說明而非 限定本
【發(fā)明內(nèi)容】
，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。
[0035] 實施例1 按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以GPR116基因mRNA設 計的雜交探針、標記物、說明書，其中： 本實施例的探針標記物選用地高辛。
[0036] 試劑盒雜交液組成： 消化液1〇〇UL/管1管/盒無色透明液體 保護液100UL/管1管/盒無色透明液體 預雜交液1300yL/管2管/盒無色透明液體 正義雜交液10uL/管1管/盒無色透明液體 反義雜交液10uL/管1管/盒無色透明液體 封閉液1000uL/管1管/盒無色透明液體 堿性磷酸酶抗體1uL/管 1管/盒無色透明液體 顯色劑A175yL/管1管/盒黃色液體 顯色劑B320yL/管1管/盒無色透明液體 緩沖液I90mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體 緩沖液II80mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體 緩沖液III20mL/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體 緩沖液IV90mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體 固定液90mL/瓶1瓶/盒無色透明液體 陽性對照標本6片/盒。
[0037] 配制試劑使用濃度 1) .將10X緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成1X緩沖液I; 2) .將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2X緩沖液II; 按1:100稀釋成0. 2X緩沖液II;按1:200稀釋成0. 1X緩沖液II; 3) .將10X緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液III; 4) . 10X緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV(取1#，2#，3#各10mL，加水 至100mL既可）。
[0038] 實施例2 應用核酸原位雜交檢測方法對各組血液標本GPR116基因mRNA表達量的實施過程： 1) .取待測標本兩張； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加IX緩沖液I99. 9ml，即為使用濃度）50 ml，37°C水浴預熱10min，放進16張玻片，37°C處理12min,再用IX緩沖液I洗5min; 3) ?用0? 2%的保護液（保護液lml加1X緩沖液I，99ml即為使用濃度）洗10min， 三蒸水洗5min(以上過程都在玻璃缸進行)，取出玻片，讓其自然干燥； 4) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預雜交液25iiL/片（加在有細胞的地方)，蓋上蓋玻片， 蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min， 取出，自然干燥； 6) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25iiL/片，另一張加反義雜交液25iiL/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h; 7) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)： 在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min; 在42°C恒溫水浴箱中用0.IX緩沖液II洗兩次，每次15min; 8) .用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0. 5%封閉液（lml封閉液加5ml1X緩沖液III) 100UL/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。（此步驟不需加蓋玻片）； 10) .取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥； 11) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加X-AP抗體（取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入1. 8ml 1X緩沖液III) 100UL/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min，時間不能過長，否則會產(chǎn)生假 陽性(此步驟不需加蓋玻片）； 12) .取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min; 13) .用IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑（顯色劑A73. 3iiL，顯色劑B157. 5iiL加到 30mL1X緩沖液IV中，混勻），室溫避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1X緩沖液I混勻）封片鏡檢。
[0039] 本發(fā)明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下 觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的RNA的表達量。
[0040] 癌癥病人20名，高危人群20名，正常對照組20名。抽所有待檢人的外周血3-5毫 升(分離白細胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有癌癥患者GPR116基因mRNA零表達，細胞無染 色；高危人群表達稍降低，小數(shù)染色；正常對照組GPR116基因mRNA高表達，細胞大量染色， 具體結(jié)果見圖2、圖3、圖4。
【主權(quán)項】
1. 一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針序 列如SEQIDNO. 1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質(zhì)、化學發(fā)光 或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6. -種GPR116基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物 中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和 (2) 檢測所述雜交復合體。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件 為：核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選是人體外周血液白細胞 標本。 9. GPR116基因在制備檢測癌癥病理演變前期原位雜交試劑盒中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物,還公開了使用本試劑盒原位雜交檢測與癌變前期病理演變有密切相關(guān)的GPR116基因mRNA表達變化的方法，包括以下步驟：（1）在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和（2）檢測所述雜交復合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在RNA水平上檢測GPR116基因的表達量，比影像醫(yī)學和現(xiàn)有的臨床生化檢測指標更早期，能實現(xiàn)真正的癌變前期RNA水平篩查，同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應用。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104711327
【申請?zhí)枴緾N201310669555
【發(fā)明人】張云福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖
【申請人】芮屈生物技術(shù)（上海）有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2013年12月11日