專利名稱：編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的核酸分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核酸分子、含有這些核酸分子的載體和宿主，也涉及產(chǎn)生果糖基轉(zhuǎn)移酶和在多種宿主生物中或在體外產(chǎn)生菊淀粉型聚果糖的方法。還涉及由所述核酸分子所編碼能用以產(chǎn)生菊淀粉型聚果糖的果糖基轉(zhuǎn)移酶。
水溶性、線性聚合物能做多種應(yīng)用，如用作去污劑、懸浮劑時增加水系統(tǒng)的粘度，或加速沉降和絡(luò)合，以及結(jié)合水。
以糖類為基礎(chǔ)的聚合物，象果糖基多糖，由于它們可以生物降解因而是特別有用的起始材料。
除了在工業(yè)生產(chǎn)和制造中用作可再生的原材料外，人們對果糖聚合物作為食品添加劑如甜味劑等很感興趣。對于不同應(yīng)用，需要不同鏈長的聚合物。對于食品業(yè)，人們優(yōu)選的是短的或中等鏈長的聚合物，而對于象生產(chǎn)表面活化劑這樣的技術(shù)性應(yīng)用，需要有高聚合度(DP)的聚合物。
已報道過在植物中由源于細菌表達的果糖基轉(zhuǎn)移酶而產(chǎn)生果聚糖或由源于植物所表達的果糖基轉(zhuǎn)移酶而產(chǎn)生中等鏈長的聚果糖的多種方法。如專利申請PCT/US89/02729介紹了在轉(zhuǎn)基因植物中，特別是在其果實里，生成糖類聚合物，特別是葡聚糖或聚果糖的可能性。為了繁育如此改造的植物，有人建議使用源于微生物，特別是產(chǎn)果聚糖氣桿菌(Aerobacten levanicum)，唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶，或來自腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的葡聚糖蔗糖酶。無論是產(chǎn)生活性酶還是產(chǎn)生果聚糖或葡聚糖或制作轉(zhuǎn)基因植物等都未見報導(dǎo)。
專利申請PCT/EP93/02110介紹了一種制作轉(zhuǎn)基因植物的方法，它表達來自革蘭氏陰性菌解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)的果聚糖蔗糖酶的lsc基因。該植物產(chǎn)生大分子量、高度支化的果聚糖。
專利申請PCT/NL93/00279介紹了用含有枯草芽孢桿菌sacB基因的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物的方法，這種植物產(chǎn)生一種支化果聚糖。在PCT/US89/0279、PCT/EP93/02110和PCT/NL93/00279中所用的細菌果糖基轉(zhuǎn)移酶合成一種β-2,6連接的果糖聚合物一果聚糖，有許多β-2,1分支。但是，由于有許多分支，果聚糖要用于技術(shù)加工相當(dāng)不利，因此它用于技術(shù)加工的起始材料與呈β-2,1連接的菊淀粉相比需求很少。目前，在合成菊淀粉時涉及到其基因產(chǎn)物的細菌基因只知道一個，即來自變異鏈球菌(Streptococcus mutans)的ftf基因。PCT/NL93/00279介紹了用所述基團轉(zhuǎn)化的植物，它合成大分子量的菊淀粉，但產(chǎn)量低，以致無經(jīng)濟價值。PCT/EP97/02195也介紹了一種用來自變異鏈球菌的ftf基因制作轉(zhuǎn)基因并生產(chǎn)菊淀粉的植物的方法。象PCT/NL93/00279所介紹的一樣，大分子量的菊淀粉產(chǎn)量也較低。雖然如果預(yù)先對該基因進行基因工程改造，再在植物中作基因表達是可能的，但從轉(zhuǎn)基因植物中能得到的菊淀粉產(chǎn)率低，以致這種轉(zhuǎn)基因植物無經(jīng)濟價值。此外，PCT/NL/96/00012公開了編碼糖類聚合物合成酶的DNA序列以及用其制備轉(zhuǎn)基因植物。該序列源于Helianthustuberosus。根據(jù)PCT/NL96/00012，可用所公開的序列改變矮牽牛和馬鈴薯及Helianthus tuberosus本身的果聚糖。在轉(zhuǎn)基因植物中，上述序列編碼的蔗糖依賴性蔗糖果糖基轉(zhuǎn)移酶(SST)或果聚糖果糖基轉(zhuǎn)移酶的表達可產(chǎn)生菊淀粉。但是，其平均聚合度為DP=6到10。這種聚合度的菊淀粉不能認為是長鏈的。PCT/NL96/00012介紹的方法不能產(chǎn)生大分子量的菊淀粉。
最近，Rehm等人(細菌學(xué)雜志(J.Bacteriology)180(1998)，1305-1310)報道通過引入來自臭曲霉(Aspergillus foetidus)的SST基因，在酵母菌中產(chǎn)生寡聚糖。但是，所得到產(chǎn)物的聚合度只有DP=3。
DE19708774.4涉及使用具有果糖基聚合酶活性的酶來生產(chǎn)1-蔗果三糖和nystose，在轉(zhuǎn)基因植物中可產(chǎn)生三糖和四糖。產(chǎn)量高并在馬鈴薯細胞內(nèi)與蔗糖量相當(dāng)。但未講到有較長鏈菊淀粉的產(chǎn)生。
在許多文獻中還討論了用真菌來合成聚果糖，如Barthomeuf和Pourrat(生物技術(shù)通訊(Biotechnology Letters)17(1995),911-916)介紹了皺褶青霉(Penicillium rugulosum)具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶制品，它有多種酶特性，因此，表示它不是一種純果糖基轉(zhuǎn)移酶。果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的DNA序列還不知道。Cairns等人(新植物學(xué)家(New phytologist)129(1995),299-308)介紹了一種在Monographella nivalis培養(yǎng)液中，由蔗糖暫時合成三糖、四糖和五糖。起作用的酶活性看來主要是水解性的，因為隨著此酶對底物消耗的增加，聚果糖又被降解。由于不知道DNA序列，就無法依靠與呋喃果糖苷酶(轉(zhuǎn)化酶)的同源性作參照來判斷是存在本意的果糖基轉(zhuǎn)移酶或是轉(zhuǎn)化酶。
已顯示真菌聚多曲霉(Aspergillus sysdowi)IAM2544能產(chǎn)生菊淀粉型聚果糖。如Harada等人(Nishinari和Doi(編)，F(xiàn)oodHydrocolloidsStructures,Properties and Functions,Plenum,New York(1994),77-82)介紹了用聚多曲霉分生孢子來合成菊淀粉。在25升20％蔗糖溶液中培養(yǎng)1259分生孢子，通過HPLC(高壓液相)純化產(chǎn)生的產(chǎn)品。但是，這種方法不能用于大規(guī)模生產(chǎn)菊淀粉。Maramatsu等人(Agric.Biol.Chem.52(1988),1303-1304)介紹了用相同真菌株(聚多曲霉IAM2544)的菌絲生產(chǎn)果寡糖的方法，聚合度是3到13。這一方法涉及的酶是非純化的或只部分純化的。相應(yīng)基因的氨基酸序列或DNA序列還不知道，也沒有給出或僅不完全地給出純化這種蛋白蛋的方法。
因此，本發(fā)明要解決的問題是提供能用于產(chǎn)生菊淀粉型聚果糖的遺傳工程化生物的核酸分子和方法。這個問題通過提供在權(quán)利要求中定義的實施方案得以解決。
本發(fā)明涉及編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子，其選自下組(a)編碼含有SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；
(b)含有SEQ ID NO.1中所示編碼區(qū)核苷酸序列的核酸分子或相應(yīng)的核糖核苷酸序列；(c)同(a)或(b)中所示核酸分子的互補鏈雜交的核酸分子；(d)核苷酸序列因遺傳密碼簡并而不同于(c)中所示核酸分子序列的核酸分子；以及與其互補的核酸分子。
在Seq ID No.1中描述的序列編碼來自聚多曲霉的蔗糖依賴性果聚糖果糖基轉(zhuǎn)移酶，它能導(dǎo)致在植物細胞中合成菊淀粉型長鏈聚果糖。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用上述序列在宿主生物，特別是在轉(zhuǎn)基因植物、細菌或真菌中有可能產(chǎn)生高產(chǎn)量長鏈菊淀粉型聚果糖。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，詳細描述了從聚多曲霉中純化這種酶的方法。把酶純化到同質(zhì)性以便能測定其氨基酸序列。根據(jù)得到的氨基酸序列信息，決定用以PCR反應(yīng)的引物，借助這些引物擴增基因片段，這些片段用以篩選cDNA文庫。把幾個與PCR產(chǎn)物序列同源的cDNA分子分離出來并加以比較，得到的絕大多數(shù)cDNA分子都有相同大小的插入片段。在酵母菌或馬鈴薯中，這些DNA序列有功能性表達證實了這些cDNA分子的完整性。
在實施例中介紹了酶的純化、PCR引物設(shè)計、cDNA分子的鑒定以及異源性表達。Seq ID No.1和2分別描述了分離出來的DNA序列和由它推測出來的氨基酸序列。本發(fā)明中的DNA序列是第一個編碼真菌蔗糖-依賴性果聚糖果糖基轉(zhuǎn)移酶的。該DNA序列和它所編碼的蛋白質(zhì)序列很不同于編碼已知的果糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列。例如，它和來自Aspergillus naeslundii levj菌的果糖基轉(zhuǎn)移酶的一致性，在蛋白質(zhì)和DNA水平上分別只有22.6％和39％，而和來自黑曲霉(Aspergillusniger)的轉(zhuǎn)化酶(invertase)基因在蛋白質(zhì)和DNA水平上的一致性分別是64和60.6，由所述基因所編碼的蛋白質(zhì)有完全不同的酶活性。這表示這種核酸分子和由其編碼的果糖基轉(zhuǎn)移酶都是至今所沒有公開過的。
在本發(fā)明的內(nèi)容里，果糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)理解為能催化(斷裂)果糖單位之間β-2,1-糖苷鍵和/或β-2,6-糖苷鍵連接的蛋白質(zhì)。要轉(zhuǎn)移的果糖殘基源于蔗糖。
本發(fā)明的蔗糖依賴性果聚糖果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)可描述如下n(G-F)→G-Fn+(n-1)G在這個圖式中，G是葡萄糖、F是果糖，G-F是蔗糖。即酶是將來自蔗糖的果糖殘基轉(zhuǎn)移到多聚果聚糖上，后者從蔗糖分子開始，由β-2,1-糖苷鍵形成，這時也可能出現(xiàn)β-2,6糖苷鍵。
由本發(fā)明的核酸分子編碼的具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，可導(dǎo)致合成多聚果糖，特別在植物細胞里可合成菊淀粉型多聚果糖(以下均稱為菊淀粉)。
在本發(fā)明的內(nèi)容里，多聚果糖應(yīng)理解為聚合度DP≥4，優(yōu)選DP≥6，特別優(yōu)選DP≥8的多聚果聚糖?！熬盏矸坌投嗑酃恰被颉熬盏矸邸敝搁L鏈果聚糖聚合物，其分子主要是β-2,1-糖苷鍵連接的，任選地也有β-2,6分支。“長鏈”一詞意味著聚合度大于20，優(yōu)選大于50，更優(yōu)選大于100，最優(yōu)選大于200。果糖基聚合物可能帶有一個末端葡萄糖殘基，它是通過葡萄糖上的C-1羥基基團和果糖殘基的C-2羥基基團連接的。在這種情況下，果糖聚合物中就含有一個分子的蔗糖。
為在體外用此酶來合成多聚果聚糖時，能得到一個寡聚物(DP=4到10)。
由本發(fā)明的核酸分子所編碼的酶，由于其催化反應(yīng)可能與已知的果糖基轉(zhuǎn)移酶有很大不同，如，已知的植物SST催化以下反應(yīng)G-F+G-F→G-F-F+G但是植物的果聚糖依賴性果聚糖果糖基轉(zhuǎn)移酶催化以下反應(yīng)G-Fn+G-Fm→F-Fn+1+G-Fn-1這是完全可逆反應(yīng)。
由枯草芽孢桿菌sacB基因編碼的細菌果糖基轉(zhuǎn)移酶也催化如下類型的反應(yīng)nG-F→G-Fn+(n-1)G
但是，這些酶都產(chǎn)生果聚糖，即帶有β-2,1分支的β-2,6-糖苷鍵連接的多聚果聚糖。
而由變異鏈球菌ftf基因所編碼的蛋白質(zhì)(FTF)可誘導(dǎo)合成分子量為幾百萬道爾頓的菊淀粉。但是，ftf基因或所編碼的蛋白質(zhì)沒有表現(xiàn)出與SEQ ID No.1中描述的核酸分子有明顯同源性(僅為37.3％)或與SEQ ID No.2中描述的氨基酸序列有明顯的同源性(僅為22.6％)。
在本發(fā)明的內(nèi)容里，“雜交”一詞意味著在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選象Sambrook等人介紹的嚴緊條件下進行雜交(見“分子克隆實驗手冊”，紐約，冷泉港，第二版，1989(Molecular cloning,A LaboratoryManual,2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Press.ColdSpring Harbor.NY.))。嚴緊雜交條件的一個例子是在含有50％甲酰胺，5×SSC,5×Deahardt’s溶液，40mM磷酸鈉(pH6.8),0.5％(wt/vol.)BSA(牛血清白蛋白)，1％(wt/vol.)SDS,0.1mg/ml鯡魚精子DNA中，于42℃進行雜交，隨后用0.5×SSC/0.5％SDS溶液在60℃下洗雜交濾膜。
非嚴緊常規(guī)雜交條件的一個例子是上述提到的條件，只是50％甲酰胺改為30％并隨后在56℃下用2×SSC/0.5％SDS洗濾膜。例如可以從基因組或cDNA文庫中分離出與本發(fā)明的分子雜交的核酸分子，cDNA文庫優(yōu)選是從真菌制備的。用本發(fā)明的分子或其片段或其反向互補片段，例如通過標(biāo)準(zhǔn)方法雜交，可以鑒定出或分離出這種核酸分子(如見Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndedition(1989)Cold Spring Habor Laboratory Press.ColdSpring Harbor,NY)。核酸分子可用作雜交探針，它表現(xiàn)出與SEQ IDNo.1中描述的核苷酸序列完全相同或基本相同，或與其部分片段是完全相同或基本相同。用作雜交探針的片段也可以是人工合成的片段，可通過常規(guī)合成技術(shù)得到，而且其序列與本發(fā)明的核酸分子序列基本是一致的。
與本發(fā)明的核酸分子雜交的分子也包括上述已介紹的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)之核酸分子的片段、衍生物及等位基因變體?！捌巍睉?yīng)理解為是那種長度足以能編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的核酸分子部分。本發(fā)明中“衍生物”一詞是指這些分子的序列在一個或幾個位點上與上述核酸分子不同但與其表現(xiàn)出高度同源性。同源性是指序列一致性至少有40％，特別是至少有60％，優(yōu)選至少有80％，甚至更優(yōu)選有大于90％。由這些核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)優(yōu)選與SEQ ID No.2中列出的氨基酸序列至少有60％的一致性，優(yōu)選至少70％，特別是至少80％，特別優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的一致性。上述核酸分子的衍生化可通過例如缺失、置換、插入和/或重組來獲得。本發(fā)明的核酸分子可以是真菌來源序列的其他衍生物。可能要對序列衍生化以利于其在某些宿主細胞中表達。
同上述分子同源并代表所述分子衍生物的核酸分子是這些分子的規(guī)則變異體，其體現(xiàn)發(fā)揮相同生物學(xué)功能的改變。這些變異體可以是自然發(fā)生的，如從其他菌種或生物體來的，也可以是通過突變作用來的。突變作用可以是自然發(fā)生的或是由特異誘變引入的。而且，它們也可以是合成產(chǎn)生的序列。等位基因變體既可以是自然發(fā)生的，也可以是通過合成或通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的。
由本發(fā)明的核酸分子的各種變體所編碼的蛋白質(zhì)具有某些共同的特性，諸如酶活性、分子量、免疫學(xué)反應(yīng)或構(gòu)象或物理特性如在凝膠電泳中的電泳遷移率、層析行為、沉降系數(shù)、溶解度、光譜學(xué)特征、穩(wěn)定性、最適pH或溫度。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼具有真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶，特別優(yōu)選來自曲霉屬，最優(yōu)選來自聚多曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶特性的多肽。
本發(fā)明的核酸分子可以是DNA或RNA分子，DNA分子的例子有基因組DNA或cDNA分子。本發(fā)明核酸分子可以從天然來源如從真菌，特別從曲霉屬，優(yōu)選從聚多曲霉分離到或根據(jù)已知的方法合成。通過分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)把各種突變引進本發(fā)明的核酸分子中也是可能的(見Sambrook等Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。這種插入可導(dǎo)致合成潛在改變生物學(xué)特性的蛋白質(zhì)。一種方法就是造成缺失突變體，其中核酸分子是通過編碼DNA序列的5＇末端或3＇末端被漸進缺失造成的，這導(dǎo)致合成相應(yīng)截短了的蛋白質(zhì)。另一種方法是特異性產(chǎn)生酶，因加有信號肽序列，它被定位在各種部位。為了將本發(fā)明的蛋白質(zhì)定位在胞液中，SEQ IDNo.2中表示的序列上不必加入信號序列。
另一方面，在一些位置上也可以造成點突變，如能影響酶活性或調(diào)節(jié)酶活性的氨基酸序列的改變。例如，用這種方法，可以得到K■值改變了的突變體，或不再受變構(gòu)調(diào)節(jié)機制的調(diào)節(jié)或細胞內(nèi)常發(fā)生的共價修飾影響的突變體。
而且，也可以得到底物或產(chǎn)物特異性改變的突變體。此外，還可以得到溫度-活性特征改變的突變體。
對于在原核細胞中進行遺傳操作，可把本發(fā)明的核酸分子或其片段整合到允許通過DNA序列重組造成突變或序列改變的質(zhì)粒上。利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等Molecular Cloning A Laboratory Manual,2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbar,NY)可以進行堿基交換或加上天然或合成的序列。為了連接DNA片段，可把適配子或接頭連到片段上。而且，可使用能能提供適宜的內(nèi)切酶位點或去掉不必要的DNA或內(nèi)切酶位點的操作方法。在體外誘變時，無論是插入、缺失或是置換，可能都是有用的。也可使用“引物修補”，內(nèi)切酶切割或連接。對于分析，常利用序列分析、內(nèi)切酶圖譜分析或進一步作生化-分子生物學(xué)分析。
此外，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸分子的載體，優(yōu)選的是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和其他遺傳工程通用的載體。
優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子是可操作連到本發(fā)明的帶有調(diào)控元件的載體上，所述元件允許可翻譯的RNA在原核和/或真核細胞中進行轉(zhuǎn)錄和合成(蛋白)。
例如，本發(fā)明的載體含有以下元件
1．一個保證下游編碼區(qū)在宿主生物細胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子和任選的增強子元件。
2．一個同啟動子融和的編碼區(qū)，它至少含有一個多肽翻譯的開放讀碼框架。本發(fā)明中，編碼區(qū)就是本發(fā)明的核酸分子。
3．與編碼區(qū)融和的任選附加序列，例如為基因在某種宿主生物中成功表達所需要的轉(zhuǎn)錄終止信號或影響基因產(chǎn)物的亞細胞定位的信號序列或誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的信號序列。
這樣的載體可能含有附加基因，諸如允許在適宜的宿主細胞中和適宜的條件下對其進行篩選的標(biāo)志基因。
本發(fā)明核酸分子的表達包括其轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mRNA。允許核酸分子在原核和真核細胞中表達的調(diào)控元件都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的。例如，適于本發(fā)明核酸分子在原核細胞中表達的可能調(diào)控元件，包括PL、Lac、trp或大腸桿菌tac啟動子。特別優(yōu)選使用LacZ啟動子，它在大腸桿菌中可被IPTG誘導(dǎo)。允許在真核宿主細胞中表達的調(diào)控元件例子是酵母的AOXl和GALl，或CMV,SV40,RSV啟動子，CMV增強子，SV40增強子或哺乳動物細胞或其他動物細胞中的珠蛋白內(nèi)含子。為了在酵母中表達，優(yōu)選使用啤酒酵母的乙醇脫氫酶基因啟動子，它在酵母中具有高度活性。更多的適宜載體系統(tǒng)在現(xiàn)有技術(shù)中已有介紹，例如見Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.，和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology(1989),GreenPublishing Associates和Wiley interscience,NY。
本發(fā)明的核酸分子在植物細胞中表達所需的調(diào)控元件，原則上可以是任何在植物細胞中有活性的啟動子、增強子、終止子等?？蛇x擇啟動子使得發(fā)生組成性表達，或在某一組織、在植物發(fā)育的某一時間點上或在由外部環(huán)境決定的時間點上發(fā)生表達。啟動子相對于植物可以是同源性的或是異源性的。
組成型表達的適宜啟動子有組成型表達的花椰菜花葉病毒的35SRNA啟動子(見US5,352,605)和遍在蛋白啟動子(見US5,614,399)，用于馬鈴薯塊莖特異性表達的patatin基因啟動子B33(Rocha-Sosa,EMBO J.8(1989),23-29)，或保證只在光合作用的組織中表達的啟動子如ST-LSl啟動子(Stockhaus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987),7943-7947；Stockhaus.EMBO J.8(1989),2445-2451),Ca/b啟動子(見US5,656,496,US5,639,952,Bansal,Proc.Natl.Acad.Sci,USA89(1992),3654-3658)和Rubisco SSU啟動子(見US5,034,322,US4,962,028)。但是，也可使用只在由外部環(huán)境所決定的某一時間點上才有活性的啟動子(見W093/07279)。允許簡單誘導(dǎo)的熱激蛋白啟動子可能具有特殊意義。諸如象蠶豆(Vicia faba)的USP啟動子的種子特異性啟動子也可使用，它能在蠶豆和其他植物中進行種子特異性表達(Fiedler.Plant Mol.Biol.22(1993),669-679；Bumlein,Mol.Gen.Genet.225(1991),459-467)。而且，也可以使用諸如在WO91/01373中介紹過的果實特異性啟動子。為了在成熟期西紅柿果實中表達，西紅柿多聚半乳糖苷酶啟動子順式調(diào)控元件是適宜的，其在果皮內(nèi)外層中都是有活性的(Nicholass等，Plant Mol.Biol.28(1995),423-435；Montgomery等，Plant Cell5(1993),1049-1062)。Van Haaren等人介紹了西紅柿另外一種果實特異性啟動子(Plant Mol.Biol.21(1993),625-640)。
此外，還可使用胚乳特異性表達啟動子，如谷蛋白啟動子(Leisy,Plant Mol.Biol.14(1990),41-50；Zheng,Plant J.4(1993),357-366)，小麥HMG啟動子，USP啟動子，云扁豆蛋白啟動子或玉米的玉米醇溶蛋白基因的啟動子(Pedersen,Cell29(1982),1015-1026；Quattrocchio,Plant Mol.Biol.15(1990),81-93)或玉米的shrunken 1-啟動子(sh-1)(Werr,EMBO J.4(1985),1373-1380)。
本發(fā)明的核酸分子在植物有些部位表達特別有利，這些部位蔗糖含量高或貯存蔗糖。這些器官是象甜菜根或甘蔗莖和甜高梁莖。因此特別優(yōu)選那些能在這些器官中介導(dǎo)表達的啟動子，如馬鈴薯(Solanumtuberosum)patatin啟動子B33。為了在甘蔗莖中特異性表達，可使用與第一個內(nèi)含子結(jié)合的遍在蛋白啟動子。
本發(fā)明的載體也可能具有附加的功能單元，它能實現(xiàn)宿主生物中載體的穩(wěn)定化，如細菌的復(fù)制起點，用于酵母菌中穩(wěn)定化和自主復(fù)制所需的2-micro-DNA。而且，可能還含有農(nóng)桿菌T-DNA“左邊界”和“右邊界”序列，它允許植物基因組中的穩(wěn)定整合。而且可能還有一個終止序列，它是用于準(zhǔn)確終止轉(zhuǎn)錄或把poly A尾巴加到轉(zhuǎn)錄本上，據(jù)說它具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本的功能。文獻中已介紹過這種元件(如Gielen,EMBO J.8(1989),23-39)并可自由交換。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的載體含有的核酸分子包括一個對于所編碼酶的分泌具有功能的信號序列區(qū)。這種序列是已知的。能使蛋白質(zhì)定位到液泡中的信號肽的實例有酵母羧肽酶Y(CPY)的信號肽。Valls等人介紹過相應(yīng)基因(Cell48,887-899)。植物信號序列例如有大麥外源凝集素基因的信號序列(Raikhel和Lerne.Dev.Genet.12(1991),255-269)或菜豆成熟植物血球凝集素N-末端區(qū)43個氨基酸序列(Tague等，Plant Cell2(1990),533-546)。C-末端信號肽的實例有幾丁質(zhì)酶的信號序列(Neuhaus等，Plant J.5(1994),45-54)。
優(yōu)選的信號序列例如有馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ基因的信號序列。但是，也可使用會導(dǎo)致多肽在選定的宿主中分泌的任何其他信號序列。分泌出來的果糖基轉(zhuǎn)移酶可從培養(yǎng)液中得到并常用于體外合成。
在特選的實施方案中，載體上的核酸分子含有一個編碼在植物細胞胞液中定位的信號序列的功能區(qū)，優(yōu)選的是馬鈴薯patatin基因的信號序列(Sonnewald,Plant.J.1(1998),95-106)。這能使果糖基轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物如甜草或馬鈴薯的液胞中進行亞細胞定位，并在液泡中累積菊淀粉型的高分子量聚果糖。而且，已有人如Matusoaka(Journal of Experimental Botany 50(1999),165-174),Chrispeels(Cell68(1992),613-616),Matsuoka(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991),834-838),Bednarek(Plant Cell3(1991),1195-1206),Nakamura(Plant Phys,101(1993),1-5)介紹過液泡定位的信號序列。
在本發(fā)明的另一個實施方案，載體上的核酸分子包含一個編碼在植物細胞中質(zhì)體定位的信號序列功能區(qū)。
例如，作為信號序列，可以使用菠菜的鐵氧還蛋白NADP(+)-氧化還原酶(FNR)的信號序列，它含有5＇端非翻譯區(qū)以及菠菜質(zhì)體蛋白鐵氧還蛋白NADP(+)-氧化還原酶(FNR)cDNA的側(cè)翼轉(zhuǎn)運肽序列(核苷酸-171到+165；Jansen,Current Genetics13(1988),517-522)。
而且，也可以使用玉米蠟樣蛋白(Waxy protein)的轉(zhuǎn)運肽加上成熟蠟樣蛋白的前34個氨基酸作為信號序列(Klsgen.Mol.Gen.Genet.217(1989),155-161)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用的是不帶成熟蠟樣蛋白前34個氨基酸的蠟樣蛋白轉(zhuǎn)運肽。
在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及質(zhì)粒pSK-asl,p112-asl,pA7-asl,p35-asl,p35-S3-asl，這些質(zhì)粒的構(gòu)建在實施例中(

圖1-5中)描述。
本發(fā)明的核酸分子和表達載體允許在多種宿主生物，特別是在植物、真菌和細菌中生產(chǎn)菊淀粉型多聚果糖。也可以在宿主生物體之外用這種編碼酶生產(chǎn)菊淀粉型多聚果糖。即特別可以在任何宿主細胞中用本發(fā)明的核酸分子去生產(chǎn)由它們編碼的蛋白并從這些宿主細胞和/或培養(yǎng)液里得到這種蛋白，并把它用于體外合成菊淀粉。
例如，對于啤酒酵母的轉(zhuǎn)化可以使用含有本發(fā)明的核酸分子和乙醇脫氫酶啟動子的構(gòu)建體。因為酵母不能利用蔗糖，應(yīng)使用由于轉(zhuǎn)導(dǎo)了異源性DNA序列而表達蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的細胞。有人介紹過這種細胞的制作，如Riesmeier等(EMBO J.11(1992),4705-4713)。用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母形成菊淀粉型長鏈聚果糖。因為聚多曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶沒有信號肽,所以無法分泌。因此長鏈聚果糖產(chǎn)生在酵母細胞中，可直接用含有這種聚果糖的酵母細胞作為食品添加劑。如果要在培養(yǎng)液里發(fā)酵獲得多聚果糖，可以把一個信號序列融合到本發(fā)明的核酸分子上以便分泌。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明涉及暫時或穩(wěn)定含有本發(fā)明的核酸分子或載體的宿主細胞或這種細胞的衍生體?！八拗骷毎币辉~涉及體外能攝取重組DNA并任選地能合成由本發(fā)明核酸分子所編碼的蛋白的生物體。宿主細胞可以是源于原核的，也可以是來自真核的?！霸恕奔毎苡帽景l(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并有利地允許果糖基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白表達的所有細菌。原核宿主細胞包括革蘭氏陰性、陽性菌，象大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，粘質(zhì)沙雷氏菌和枯草芽孢桿菌。“真核”細胞包括昆蟲細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞及人類細胞。優(yōu)選的真菌細胞是如能發(fā)酵或可被用以發(fā)酵的細胞，特別是酵母，特別優(yōu)選的是啤酒酵母，裂殖酵母，克魯維酵母，畢赤酵母等。優(yōu)選這樣的真菌細胞是來自曲霉屬的細胞，特別優(yōu)選來自黑曲霉種的細胞。特感興趣的是，在這些細胞里，本發(fā)明的果糖基轉(zhuǎn)移酶和一個分泌信號序列如patatin基因或臭曲霉1-SST基因的信號序列一起表達(Rehm等J.Bac.180(1998),1305-1319)，能把果糖基轉(zhuǎn)移酶分泌到培養(yǎng)液里。使用低或無分泌型轉(zhuǎn)化酶活性的細胞是有利的，本身沒有轉(zhuǎn)化酶活性的真菌有如木霉T.reesei。有人介紹過β-呋喃果糖苷酶(來自黑曲霉的轉(zhuǎn)化酶)的表達方法，如Bergès等(Curr.Genet.24(1993),53-59)。本發(fā)明編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白的核酸分子或相應(yīng)載體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。生產(chǎn)融合的可操作連接基因和其在適宜宿主細胞中表達的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的并有人介紹過，如Sambrook或Ausubel，見上述文獻。優(yōu)選的宿主是大腸桿菌、真菌，特別是酵母，以及植物細胞。
本發(fā)明的細胞優(yōu)選的特征在于，其中導(dǎo)入的核酸分子相對于轉(zhuǎn)化細胞是異源性的，即在這些細胞里，它不是天然存在的，或是定位在一個與自然界存在的相應(yīng)序列不同的基因組位點上。
當(dāng)在植物里表達本發(fā)明的核酸分子時，合成蛋白定位在植物細胞任何區(qū)室通常是可能的。為了讓它定位在特定的區(qū)室，可以把本發(fā)明的核酸分子連接到能保證定位到理想?yún)^(qū)室去的DNA序列上，見上面的介紹。這種序列是已知的(見Braun,EMBO J.11(1992),3219-3227；Wolter,Proc.Natl.Acad.Sci；USA.85(1988),846-850；Sonnewald,Plant J.1(1991),95-1061；Rochasosa EMBO.J.8(1989),23-29)。
本發(fā)明的宿主包括用本發(fā)明一種或幾種核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞、植物組織和植物，以及源于由這種方法所轉(zhuǎn)化細胞的轉(zhuǎn)基因植物細胞。這種細胞含有一種或幾種核酸分子，其優(yōu)選和允許在植物細胞里轉(zhuǎn)錄的調(diào)控DNA元件、特別是啟動子連接。這種細胞不同于天然存在的植物細胞，它們至少含有一種本發(fā)明的核酸分子，后者在這些細胞里不是天然存在的，或該分子是定位在細胞基因組的一個非天然定位位點上，即定位在不同的基因組位點上。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及在其胞液中含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物細胞。在此實施方案中，使用SEQ ID No.2中表示的序列，沒有另外的信號序列。
在另外一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及在其質(zhì)體中含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物細胞。為使本發(fā)明的蛋白質(zhì)發(fā)生質(zhì)體定位，可用上述方法修飾本發(fā)明的核酸分子和/或載體。
因為液泡通常能貯存大量的蔗糖，蔗糖作為本發(fā)明蛋白質(zhì)的底物，這個部位完全適于繁殖這樣的植物細胞，其由于本發(fā)明蛋白的活性在液泡中產(chǎn)生多聚果糖。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明因而涉及液泡中含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物細胞。
上面已經(jīng)闡明了必須如何構(gòu)建本發(fā)明的核酸分子和/或載體以調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白質(zhì)在液泡中定位。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可用轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物組織再生整個植物。可由本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細胞通過再生得到的植物也是本發(fā)明的一個主題。本發(fā)明另一個主題就是含有上述轉(zhuǎn)基因植物細胞的植物。本發(fā)明的植物通?？梢允侨魏我环N植物，優(yōu)選是單子葉植物或雙子葉植物。優(yōu)選源于有農(nóng)業(yè)用途之植物的植物細胞，即由人類為提供糧食或技術(shù)加工目的、特別是工業(yè)目的所栽培的植物。本發(fā)明優(yōu)選涉及產(chǎn)生纖維的植物(如亞麻、大麻、棉花)，貯油植物(如油菜、向日葵、大豆)，貯糖植物(如甜菜、甘蔗、甜高梁、香蕉)和貯蛋白植物(如豆科植物)。
在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及飼料植物(如飼料或料草、苜蓿草、三葉草等)，蔬菜(如甜瓜、西紅柿、香蕉、菊苣、韭蔥、蘆筍、胡蘿卜)或貯淀粉植物(小麥、大麥、燕麥、黑麥、馬鈴薯、玉米、水稻、豌豆、木薯、綠豆)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及來自含蔗糖植物的植物細胞(如甜菜、馬鈴薯、水稻、小麥、甘蔗等)。特別優(yōu)選甜菜、菊苣、水稻、玉米、馬鈴薯、甘蔗和小麥。本發(fā)明還涉及本發(fā)明植物的繁殖材料和收獲產(chǎn)物如果實、種子、塊莖、根狀莖、幼苗、枝條、愈傷組織、細胞培養(yǎng)物等等。
本發(fā)明還涉及對制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中包括(a)通過引入本發(fā)明的核酸分子和/或載體遺傳修飾植物細胞，(b)由該細胞再生植物，并任選地(c)再從(b)的植物繁殖植物。
在本發(fā)明的內(nèi)容里，“遺傳修飾”是指由于引入本發(fā)明核酸分子而改變了植物細胞的遺傳信息并因本發(fā)明核酸分子的存在或表達導(dǎo)致表型改變。優(yōu)選表型改變是指細胞中可檢測的一個或幾個功能的改變，如本發(fā)明遺傳修飾的植物表現(xiàn)出本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性或果糖基轉(zhuǎn)移酶總活性提高。
植物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法按步驟(b)來再生。根據(jù)本發(fā)明方法步驟(c)的進一步植物繁殖，可以是例如無性繁殖如用插枝、塊莖或愈傷組織培養(yǎng)和整株植物的再生)或有性繁殖。優(yōu)選在一控制的條件下進行有性繁殖，即選擇具有特異性狀的植物進行雜交育種并繁殖。
本發(fā)明涉及可由本發(fā)明的方法獲得的植物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明植物的繁殖材料以及由本發(fā)明方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物?！胺敝巢牧稀卑ㄟm用于經(jīng)無性或有性繁殖途徑產(chǎn)生后代的那些植物部分，對天性繁殖，象果實、種子、幼苗、原生質(zhì)體、細胞培養(yǎng)物特。優(yōu)選的繁殖材料是塊莖和種子。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明植物的可收獲的植物部分，如果實、葉子、貯藏根、根、花、芽、籽苗或莖，優(yōu)選種子或塊莖。
在另外一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及動物和/或人類的食料，其含有本發(fā)明的可收獲的植物部分，優(yōu)選種子或塊莖。
優(yōu)選本發(fā)明的植物部分消耗后對人類和/或動物健康有利，這是與那些沒有用本發(fā)明方法進行遺傳修飾的相應(yīng)植物部分相比較而言的。本發(fā)明的動物和/或人類食料的情況與此相同。對于人類，本發(fā)明食料的消耗可導(dǎo)致例如改善腸道菌群組成，特別是增加腸道內(nèi)雙歧桿菌含量，據(jù)推測此菌有利于人類健康(Izzo,Trends in Food Science＆Techno1ogy9(1998),255-257)。這些有利的作用優(yōu)選是預(yù)防性作用或支持食料利用的作用。
本發(fā)明另外的主題是產(chǎn)生宿主細胞的方法，其中用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化適宜宿主細胞。各種所考慮宿主細胞的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其中將本發(fā)明的宿主細胞在足以使本發(fā)明的核酸分子表達的條件下培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)物中分離出果糖基轉(zhuǎn)移酶，即從細胞和/或可能存在的培養(yǎng)基。在上述方法中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞例如在發(fā)酵罐中培養(yǎng)直到達到最適細胞濃度。在有可誘導(dǎo)的啟動子的情況下，由本發(fā)明核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)，只在發(fā)酵步驟結(jié)束時才被誘導(dǎo)表達。然后，以這種方法表達的蛋白質(zhì)可按常規(guī)方法從培養(yǎng)基、細胞裂解物或細胞膜提取部分中純化出來。已經(jīng)表達的蛋白質(zhì)，如微生物方法表達的，可通過制備型層析法或免疫學(xué)純化方法如使用可識別由本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的單克隆抗體或多克隆抗體分離和純化出來。在這一點上應(yīng)提一下的是，具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性并由本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白質(zhì)可以額外含有功能性氨基酸序列，如蛋白質(zhì)尾標(biāo)物(GST、GFP、Flag、LA多肽，His-tag)，它們可能源于異源性蛋白或人工合成產(chǎn)生的。
而且，本發(fā)明還涉及具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，即由本發(fā)明核酸分子編碼的果糖基轉(zhuǎn)移酶或由本發(fā)明的方法可獲得的果糖基轉(zhuǎn)移酶?？蓛?yōu)選使用本發(fā)明的果糖基轉(zhuǎn)移酶去生產(chǎn)菊淀粉型聚果糖，也可以用它們制備能用以檢測和/或純化果糖基轉(zhuǎn)移酶的抗體。
本發(fā)明另一個主題是與本發(fā)明核酸分子或片段特異性雜交的核酸分子，優(yōu)選的是至少具有10個，特別是15個，特別優(yōu)選至少50個核苷酸的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸例如可用作PCR反應(yīng)的引物，分子雜交的探針或其他。
本發(fā)明另一個主題是生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，其中本發(fā)明的宿主細胞或含有它們的宿主生物在允許本發(fā)明果糖基轉(zhuǎn)移酶表達并合成聚果糖的條件下培養(yǎng)。
通過提供本發(fā)明的核酸分子，使得通過基因工程方法在生物體中生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖成為可能，至今為止，用常規(guī)方法這是不可能的。例如可以在諸如細菌，真菌或植物細胞里表達本發(fā)明的核酸分子以便增加相應(yīng)果糖基轉(zhuǎn)移酶活性或把它導(dǎo)入到正常情況下不能表達上述酶的細胞里。由于表達或額外表達本發(fā)明的至少一種核分子，本發(fā)明的宿主細胞就能合成聚果糖，特別是菊淀粉型聚果糖。因此，本發(fā)明另一個主題是可從本發(fā)明的宿主細胞以及可從植物的繁殖材料、可從植物及其收獲的產(chǎn)物中獲得的聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖。
本發(fā)明特別涉及生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允許果糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生和蔗糖或等價底物反應(yīng)生成菊淀粉型聚果糖的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細胞或含有這種細胞的宿主，任選蔗糖從細胞外加入；(b)從培養(yǎng)的宿主細胞、宿主或從培養(yǎng)基中獲取如此產(chǎn)生的聚果糖。
宿主細胞優(yōu)選是植物細胞，宿主優(yōu)選是植物。從植物里獲取聚果糖、特別是菊淀粉型的聚果糖的方法已有介紹，如Vogel(Inulin andInulin-containing Crops,Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam,A.Fuchs(Ed)(1993),65-75))。
本發(fā)明另一個主題是體外產(chǎn)生聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允許向聚果糖轉(zhuǎn)化的條件下將蔗糖或等價底物與本發(fā)明果糖基轉(zhuǎn)移酶接觸；以及(b)獲取用如此產(chǎn)生的聚果糖。
與蔗糖等價的底物為，例如由宿主細胞或一個或幾個其他酶轉(zhuǎn)化成蔗糖的底物，它也可以是那些能替換用作本發(fā)明的果糖基轉(zhuǎn)移酶底物的二糖或寡聚糖，一個例子是三糖棉子糖。但是，也可使用衍生化的蔗糖。優(yōu)選由上述方法得到的菊淀粉是長鏈菊淀粉，優(yōu)選聚合度DP大于20，優(yōu)選大于50，特別是大于100，特別優(yōu)選聚合度大于200。
本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，包括從上述一種本發(fā)明的植物/植物細胞和/或從這種植物某些部分提取聚果糖的步驟。優(yōu)選這種方法也包括在提取聚果糖之前先收獲栽培的植物和/或其部分的步驟，特別優(yōu)選在收獲前栽培本發(fā)明植物的步驟。從植物或植物某些部分中提取聚果糖的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的并已有介紹，如Gibson(International Sugar Journal 96(1994),381-387),Vogel(Stud.Plant Sci.3(1993),Inulinand Inulin-Containing Crops,65-75)。
本發(fā)明還涉及聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖，它可從本發(fā)明的宿主細胞中或根據(jù)上述本發(fā)明的方法獲得。這種聚果糖可優(yōu)選用以生產(chǎn)表面活性劑，用以增加水系統(tǒng)的粘度，作為去污劑，作為懸浮劑，用于加速沉降劑和絡(luò)合或者用于結(jié)合水。
而且，本發(fā)明的合成聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的宿主細胞可被用作食品添加劑。這種應(yīng)用是有好處的，因為果聚糖對健康有利(Roberfroid等，J.of Nutrition128(1998),11-19；Kleesen等，Am.J.Clin.Nutr.65(1997),1397-1402)。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，其特征在于真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶或表達真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的宿主生物用于生產(chǎn)聚果糖。優(yōu)選使用本發(fā)明的果糖基轉(zhuǎn)移酶或本發(fā)明的宿主細胞。本發(fā)明首次顯示用這種真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菊淀粉型聚果糖是可能的。
最后，本發(fā)明涉及真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖中的應(yīng)用。
已列舉了這樣和那樣的實施方案，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并包含在本發(fā)明說明書和實施例中。關(guān)于上述方法、培養(yǎng)基和應(yīng)用的進一步文獻可從現(xiàn)有技術(shù)中獲得，如從公共圖書館、使用電子媒介等。為這一目的，公共數(shù)據(jù)庫，象“Medline”是有用的，它可以利用互聯(lián)網(wǎng)獲得，如在以下的網(wǎng)址上http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其它數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)址本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的，并能在互聯(lián)網(wǎng)上找到，如在網(wǎng)址http//www.1ycos.com上。在Berks,TIBTECH12(1994),352-364上提供了有關(guān)生物技術(shù)專利或?qū)＠暾埖馁Y源和信息縱覽。
圖1表示用于轉(zhuǎn)化細菌的質(zhì)粒pSK-asl的結(jié)構(gòu)。
圖2表示用于轉(zhuǎn)化酵母細胞的質(zhì)粒p112-asl的結(jié)構(gòu)。
圖3表示用于轉(zhuǎn)化植物細胞的質(zhì)粒pA7-asl的結(jié)構(gòu)。
圖4表示用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒p35-asl的結(jié)構(gòu)。
圖5表示用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒p35-s3-asl的結(jié)構(gòu)。
圖6表示用pSK-asl轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的薄層層析分析結(jié)果。第一道表示用無pBluescript SK插入片段的載體的對照實驗結(jié)果。第二道表示用質(zhì)粒pasl的實驗結(jié)果，其中asl編碼區(qū)不在lacZ基因的讀碼框里(第2道)。在這種情況下，asl編碼區(qū)不能與β-半乳糖苷酶融合翻譯，而從內(nèi)源性起始密碼子開始進行，效率低。第3道到第6道表示pSK-asl多種轉(zhuǎn)化子的實驗結(jié)果。當(dāng)細菌長到OD600達0.4時，開始用100mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，誘導(dǎo)兩小時后，收集細胞，并在50mM磷酸鈉(pH6.0)中裂解。把蛋白提取物與600mM蔗糖在37℃下保溫12小時。作為薄層層析的標(biāo)準(zhǔn)品，第7-9道分別上樣品為1-蔗果三糖(7)，蔗糖(8)和果糖(9)。
圖7表示含有質(zhì)粒p112-asl(第2道)或p112-aslL(第3道)的轉(zhuǎn)化酵母細胞的薄層層析分析結(jié)果。載體p112-aslL含有菠菜蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的5＇前導(dǎo)序列。第1道表示未轉(zhuǎn)化的酵母細胞的對照實驗結(jié)果。從酵母的蛋白提取物中檢測到了果糖基轉(zhuǎn)移酶活性。作為標(biāo)準(zhǔn)品，第4道上是果糖，第5道是1-蔗果三糖、nystose和果糖-nystose混合物，第6道是蔗糖。
圖8表示含有pA7-asl質(zhì)粒的植物細胞的薄層層析分析結(jié)果。第1道表示用不帶有插入片段pA7的載體的轉(zhuǎn)化分析結(jié)果(50μg)；第2道-5道表示用pAT-asl載體轉(zhuǎn)化的分析結(jié)果(第2道上樣10μg，第3道20μg，第4、5道50μg)。作為標(biāo)準(zhǔn)品，第6道上為1-蔗果三糖、nystose和果糖-nystose的混合物，第7道為蔗糖，第8道為果糖。
對每次實驗，均用500,000個原生質(zhì)體。在轉(zhuǎn)化后，原生質(zhì)體于25℃保溫2天，然后在50mM磷酸鈉(pH6.0)中得到蛋白提取物，它與500mM蔗糖在28℃保溫20小時。取4μl10倍稀釋的混合物上樣。
圖9表示用35-asl轉(zhuǎn)化的植物的薄層層析分析結(jié)果。隨機選擇12株植物，每次在200μl水中提取20mg葉子材料，取4μl提取物上樣。作為標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)道上為果糖，S道上為蔗糖，St道上為1-蔗果三糖、nystose和果糖-nystose的混合物。
圖10表示用35-s3asl轉(zhuǎn)化的植物的薄層層析分析結(jié)果。隨機選擇12株植物，在200μl水中每次提取20mg葉子材料，取4μl提取物上樣。作為標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)道上為果糖，S道上為蔗糖，St道上是1-蔗糖果三糖、nystose和果糖-nystose的混合物。
圖11表示從富含果糖基轉(zhuǎn)移酶的聚多曲霉中提取的蛋白質(zhì)，經(jīng)過“400-0mM硫酸銨”從苯基葡聚糖柱(phenyl superose column)洗脫下來的樣品(E道)。在標(biāo)有“M”的道中分離了分子量標(biāo)志。標(biāo)志蛋白分子量以KD(千道爾頓)表示在右邊。
以下實施例用以說明本發(fā)明實施例1從聚多曲霉中純化afl-SST在含有2％麥芽提取物、0.5％蛋白胨和2％蔗糖的培養(yǎng)基上接種聚多曲霉IAM2544。培養(yǎng)基通過加入2％瓊脂固化。孢子被鋪在平板上并在25℃保持直到平板完全干燥。從平板上收集分生孢子，再溶解在50mM磷酸鈉(pH6.0)中。用三通道法氏壓力器(French Pressure Cell)來裂解分生孢子。
為純化，把勻漿物吸附到Sepharose Q柱上，用0-1000mM氯化鉀線性梯度洗脫結(jié)合的蛋白。在500～700mM氯化鉀之間得到具有蔗糖水解活性的部分，把這些部分洗脫液合并并對磷酸鈉緩沖液(pH6.0)透析。為了富集蛋白，把它再吸附到Sepharose Q上(床體積為2ml)，用10ml體積洗脫。把洗脫液調(diào)到2M硫酸銨濃度，并吸附到phenylsuperose上，用2M硫酸銨洗滌后，用帶有2M～0M硫酸銨線性梯度的100mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗脫。在400～0mM的硫酸鈉洗脫梯度中得到有活性的部分。把得到的蛋白混合物作SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表示在圖11中。Muramatsu和Nakakuki介紹了用聚多曲霉的菌絲體相似地富集蔗糖水解活性(Biosci Biotech Biochem59(1995),208-212)。該純化沒有得到對測序適用的同質(zhì)性蛋白。
為了鑒定果糖基轉(zhuǎn)移酶，使用了半變性的聚丙烯酰胺凝膠，把10μg在phenyl superose柱上用0.1％SDS、10％甘油、50mMTris pH6.8洗脫下來的蛋白樣品上樣。電泳后，把凝膠放在50mM磷酸鈉(pH6.0)，1％Triton×100中再緩沖三次10分鐘，然后再在50mM磷酸鈉pH6.0，1％Triton×100,500mM蔗糖中孵育30分鐘，然后把凝膠在0.1％(w/v)2,3,5-氯化三苯基四唑鎓(TTC),0.5MNaOH中煮沸。由此TTC和還原型糖一起形成紅色甲染料。在圖11中標(biāo)記出來的蛋白帶就是由于這種蛋白有蔗糖水解活性而產(chǎn)生的斑點，因此，它就可被鑒定為聚多曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶。從制備膠里分出這種蛋白帶，并從膠中洗脫出這種蛋白用以測序。由于該蛋白N-末端是封閉的，用內(nèi)肽酶LysC和AspN進行酶解，通過HPLC純化多肽，并按Edmann方法進行測序，得到以下序列LysCVLPSTSQASEK(SEQ ID No.3)AspNDDPLVTYR (SEQ ID No.4)DPYVFQNHEV (SEQ ID No.5)為了克隆這個基因，在噬菌體λZapⅡ中構(gòu)建了eDNA文庫(Stragene,Heidelberg)。因為從分子孢子中制備RNA是不可能的，所以就按Logemann等人的方法從菌絲體中來制備RNA(Anal.Biochem.163(1987),16-20)，通過polyA吊鉤系統(tǒng)(polyA TractSystem)得到polyA+-RNA(Promega,Medison.USA)。按照操作手冊說明合成cDNA并在λZapⅡ噬菌體中進行克隆(Stratagene,Heidelberg)。根據(jù)蛋白的序列，設(shè)計了下列引物引物asp19下游5＇-GAYGAYYTNGTNACNTAYMG (SEQ ID No.6)引物asp19上游5＇-CKRTANGTNACNARRTCRTC (SEQ ID No.7)引物asp31-下游5＇-GTNTTYCARAAYCAYGARG (SEQ ID No.8)引物asp31上游5＇-TGRTTYTGRAANACRTANGG (SEQ ID No.9)引物lysl上游5＇-GCYTGNSWNGTNSWNGG (SEQ ID No.10)在用完整的cDNA文庫作底物和asp19下游/asp31上游引物組合的PCR反應(yīng)中(退火溫度為40℃)，得到一個約為350bp的DNA片段，放射標(biāo)記后用以篩選cDNA文庫(Megaprime Kit,BoehringerMannheim,Mannheim)。體內(nèi)切除后，以pBluescript質(zhì)粒來擴增得到的克隆。內(nèi)切酶酶解后，對cDNA插入片段進行比較，并對克隆的插入片段完全測序，其序列表示在SEQ ID No.1中，由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列表示在SEQ ID No.2中。
實施例2
為轉(zhuǎn)化各種原核和真核宿主細胞而構(gòu)建含有真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)的重組子。
為了用真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化各種宿主細胞，根據(jù)分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方法制備了許多不同的重組子(Sambrook等，1989,ColdSpring Harbor Laboratory Press)，這些重組子表示在圖1-5中，其制備方法分述如下pSK-asl是pasl的衍化子，pasl是在體內(nèi)切割后從聚多曲霉eDNA文庫的一個λZapⅡ克隆中得到的。pasl含有作為EeoR Ⅰ/XhoⅠ片段的cDNA。pSK-asl由pasl而來，是通過BamHⅠ和SmaⅠ酶切，再填平BamHⅠ的粘性末端，再連到載體上而得到。通過去掉4個核苷酸，asl的編碼區(qū)就被接入到LacZ基因的讀碼框中(圖1)。
p112-asl是克隆在p112A1NE載體上的(見Riesmeier等，EMBOJ.11(1992)4705-4713)，先用BamHⅠ酶切，填平粘末端，然后再用NotⅠ酶切，從pasl中得到asl片段(先用Asp718酶切，填平后再用NotⅠ酶切)(圖2)。
pA7-asl是從pA7而來的，通過把pasl編碼區(qū)(Smal/Asp718酶切片段，填平粘末端)克隆到載體已填平的Asp718和SmaⅠ酶切位點的上得到的。通過HindⅢ酶切來證實片段的正確方向，酶切可產(chǎn)生大約1900bp的片段。pA7是pUC18的衍化子，在EcoRⅠ和Asp718之間含有花椰菜花葉病毒的35S RNA啟動子(CaMV528bp；nt6909-7437,Franck等，Cell 21(1980),285-294)，在SphⅠ和HindⅢ之間還含有根癌農(nóng)桿菌章魚氨酸合成酶基因的終止子(Gielen等，EMBO J.3(1984),835-846)(圖3)。
p35-asl是從pBinAR來的，通過把pasl用Asp718/Notl酶切、填平得到的asl片段連到已用Smal酶切的載體上而得到。pBinAR是pBin19的衍化子(Bevan,Nucl.Acids Res.12(1984),8711),在EcoRⅠ和Asp718之間含有花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(CaMY,528bp；nt6909-7347,Franck等，同上)，在SphⅠ和HindⅢ之間還含有根癌農(nóng)桿菌章魚氨酸合成酶基因的終止子(Gielen等，同上)(圖4)。
p35-s3-asl是兩步克隆出來的。第一步，把來自pasl的BamHⅠ/Asp718片段(粘末端用T4聚合酶填平)克隆到pS3載體上(它已用BamHⅠ酶切并填平了)，因此，就得到pS3-asl重組子。載體pS3含有patatin基因B33的PCR擴增片段(Posahl等，Mo1.Gen.Genet.203(1986),214-220)，后者含有725-1400個核苷酸。這個PCR片段在725核苷酸位置上裝上了一個Asp718酶切位點(GGTACC)，在1400位置上裝上ATGG序列，結(jié)合1399和1400位核苷酸就產(chǎn)生了一個NcoⅠ酶切位點。把這個PCR片段插到Asp718和SmaⅠ內(nèi)切酶位點之間。從pS3-asl制備SacⅠ(填平)/XbaⅠ片段，它含有融合S3-asl片段。把這一片段克隆到pBinAR上的SmaⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶位點之間(圖5)。
用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主。根據(jù)Hanahan(J.Mol.Biol.166(1983),557-580)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，根據(jù)Dohmen等人的方法轉(zhuǎn)化啤酒酵母(Yeast7(1991),691-692)，根據(jù)Damm和Willmitzer的方法，在煙草原生質(zhì)體中進行臨時性表達(Mol.Gen.Genet,213(1989),15-20)，根據(jù)Dietze等人的方法對馬鈴薯進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(Potrykus,I and G.Spangenberg(Ed.),Gene trasfer to plants,xxii+361(1995),24-29；Springer-Verlag；Berlin,Germang；New York,New York,USA.ISBN3-540-58406-4)。
實施例3表達真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因宿主細胞或生物體的果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性分析。
菊淀粉的體內(nèi)合成表達真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因宿主細胞或生物體培養(yǎng)在含2％蔗糖(植物組織除外)的培養(yǎng)基上。在以大腸桿菌K12作宿主生物體的情況下，把編碼大腸桿菌蔗糖通透酶的功能性cscB基因作為重組子引入到pACYC184載體上。在啤酒酵母的情況下，把菠菜的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因引入到p112AINE載體上(Riesmeie等，EMBO J.11(1992),4705-4713)。細胞在有蔗糖存在情況下至少培養(yǎng)24小時，然后收集細胞，用50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗滌后破碎。
表達真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的植物栽培在土壤中。4周后采集葉子和其他組織標(biāo)本，并在1ml水/g鮮重中在不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮存在下提取，通過離心去掉細胞碎片。
每次在預(yù)鑄DC膠片的硅膠上上樣4μl提取物(Schleicher和Schüll,Dassel,Germany)并在丙酮/水(87∶13)中展開兩次。用尿素-磷酸試劑進行果糖殘基檢測試驗(Rber等，Planta199(1992),528-536)。
菊淀粉的體外合成在50mM磷酸鈉(pH6.0)、50μMPMSF、lmMDTT、10％(v/v)乙二醇溶液中破碎表達真菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的細胞，把細胞提取物在50mM磷酸鈉(pH6.0)、500mM蔗糖、50μMPMSF、lmMDTT、0.02％(w/w)NaN3、10％(v/v)乙二醇溶液中，于25℃保溫12小時。用水10倍稀釋混合物，然后在預(yù)鑄的硅膠DC膜上上樣4μl(Schleicher和Schüll,Dassel,Germany)并在丙酮/水(87∶13)中展開兩次。用尿素-磷酸試劑進行果糖殘基的檢測試驗(Rber等，同上)每個分析的結(jié)果分別表示在圖6到10中。這些圖是孵育混合物或細胞勻漿進行薄層層析后用含果糖的糖類染色的硅膠凝膠膜的顯影結(jié)果。利用在丙酮/水(87∶13)中進行薄層層析，單糖、寡糖和多聚物就可根據(jù)大小分開。果糖比蔗糖遷移的更遠，依次蔗糖比蔗果三糖遷移的更遠等等。聚合度(DP)大于7的寡聚糖或更大的糖類未能分開，仍保留在上樣原點上。
在圖6中可以看到，用不帶插入片段的載體pBluescript轉(zhuǎn)化的大腸桿菌克隆株，不能轉(zhuǎn)化蔗糖(第1道)，而用pasl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的克隆株合成了三糖-蔗果三糖。用質(zhì)粒pSK-asl轉(zhuǎn)化的克隆株也能合成較大分子量的寡聚糖(第3～6道)。同時，果糖殘基轉(zhuǎn)移到水里，因此形成果糖。上面提到的轉(zhuǎn)化是由來自聚多曲霉的SFT所催化的。圖7表示用質(zhì)粒112-asl所轉(zhuǎn)化酵母的蛋白提取物可以合成果聚糖。這些酵母中的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性高于用質(zhì)粒112-aslL轉(zhuǎn)化的酵母菌。由于在實驗有效的時間內(nèi)能得到果糖基轉(zhuǎn)移酶活性數(shù)量較少，所以后者只能合成三糖。合成的果聚糖分子大小取決于反應(yīng)時間和果糖基轉(zhuǎn)移酶活性。圖8證實，在給定的反應(yīng)時間里，在轉(zhuǎn)化的煙草原生質(zhì)體提取物里合成的果聚糖大小取決于所生產(chǎn)的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性數(shù)量，后者又取決于轉(zhuǎn)化的pA7-asl質(zhì)粒的數(shù)量。在第3～5道中可以看到，已合成了聚合度(DP)大于7(DP＞7)的寡糖和多糖，它們在層析時沒有從上樣點遷移出去，同樣情況適用于從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的提取物，見圖9和10中所示。
序列表<110> Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften e.V.<120>編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的核酸分子及其應(yīng)用<130>C1056PCT<140><141><160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2197<212>DNA<213>聚多曲霉<400>1gaattcggca cgaggccgcc atgaagctcc cctcttcact ggacattctt ctcgccagac 60aggcggttgg cggtactgag gtcgactacg actcaccacc ccctgacctg acgacgctcc 120ctgagaactc gctgttcgag acctggagac ccaagatcca cgttctgccc ccaaatggcc 180aaatcgggga cccatgcgct cattacaatg acccggcgac gggtttgttc catgtcggat 240tcctccacaa tggcaccggc atttccagcg tctacaccga tgacctggtg acctatcgtg 300atatcaatcc taacggcggc tacattattg ttgctggtgg ccccaatgac cccgaagccg 360tctttgatgg atctgtcatc cccagcggaa tcgatgacct gcccacgctc ctttatacct 420ctgtgacatc gttgccaatc cactggactc taccttatac ccccggaagc gagactcagt 480cactggccgt aagtgacgat ggtggtcacc acttcgataa gcttgaccga ggcccagtca 540ttccacttcc gccagatgga ctcgatgtta cagccttccg tgacccttat gtattccaga 600accacgaggt agacgaagtt accggtagtg acccagatac atggtatgcc gccatatccg 660ggggtgtcca tgatgtaggg cccggaatct ttctctaccg caaccaagac tcctcctttg 720agaactggga atatctaggc gagtggtggc aagaacccgc caactcgact tggggtgacg 780gcacttgggc caaacgctgg ggctacaatt tcgaaaccgg caacgtcttc tctctcgatc 840gagaagggta caacgttgac ggccacacgt ttatgactat tggagttgag ggtgcatacg 900cgcccatcca gccctcggtt acatctatgc atgccatgct gtgggcagcg ggaaatgttt 960cctcagagaa tggcgaaaac gttaccttca cgccttatat ggccggtgct ttggactggg 1020gcatggccgc atacgccggt gctggaaagg ttctacccag cacatctcag gcttctgaga 1080agagtggagc gcccgaccgc ttcatctcgt gggtttggct tacaggtgat gaatttggtg 1140ctgccgctgg atttcctgct gcccagcagg ggtggcagaa tactctcctg cttccgcgtg 1200aattgagtat acacacaatc cagaatgtgg tcgacaacga actcatccac gagactgcat 1260cctggcgtgt ggcagaacat ggcggcgaga ggagatctgg tggtgtcgag ctggagacac 1320tgggaatcaa tattgcgagg gagacctacg atgcaatcgt ctcttctggg acctcgtttg 1380aggagccttc gcgagacatt aatgaatccg gcaccattcc atttgagcgc tcgcccacta 1440gcaggttctt cgcccttgaa gcccaaatct ccttccccca gtctgcgcga gactcggaag 1500tccagtccgg atttcaaatc cttgcttctg aactcgagtg gacgacgatc tattatcagt 1560tttcgaatga gtcgattgtc attgaccgta accacacaag tgctgcgtcc gagactacac 1620ctggtctcgg tactgtgact gagtctggcc gtatccggct tttcgatatc gcgggtggtt 1680gcgatcatga tggacatggc ggccacgatg gcggcaacga tgatgaccac aacggtgacg 1740gtgatcatag cggtgacggt gaccacaatg acgatgatga ccataacgtc gacggcgatg 1800acaaggagcg tgctcgttac caaaagcgag atggcccttg cgataaagac catgataagg 1860ttgagacatt ggatctcacc attgtcgtcg ataactcagt gcttgaagtt tacgccaact 1920cacgatttgt ggtgtcgacc tgggttcggc cttggtacac caattcaacg gagattcgct 1980tcttccacaa cggcgagggt gaggtcagct ttgacaacat tgcggttcat gatggtctgt 2040atgatgcata tccggacagg gacaactgaa gatttcactg gttgatgtat tagcttgcga 2100gctataaaga tggcgataat tagtagattt aatccaatga attacctgcc gagattgcag 2160atttattctt acaaaaaaaa aaaaaaaaaa actcgag 2197<210>2<211>682<212>PRT<213>聚多曲霉<400>2Met Lys Leu Pro Ser Ser Leu Asp Ile Leu Leu Ala Arg Gln Ala Val1 5 10 15Gly Gly Thr Glu Val Asp Tyr Asp Ser Pro Pro Pro Asp Leu Thr Thr20 25 30Leu Pro Glu ASh Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro Lys Ile His Val35 40 45Leu Pro Pro Asn Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Asn Asp50 55 60Pro Ala Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly65 70 75 80Ile Ser Ser Val Tyr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg Asp Ile Asn85 90 95Pro Ash Gly Gly Tyr Ile Ile Val Ala Gly Gly Pro Ash Asp Pro Glu100 105 110Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Ile Asp Asp Leu Pro115 120 125Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Thr Ser Leu Pro Ile His Trp Thr Leu130 135 140Pro Tyr Thr Pro Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ser Asp Asp145 150 155 160Gly Gly His His Phe Asp Lys Leu Asp Arg Gly Pro Val Ile Pro Leu165 170 175Pro Pro Asp Gly Leu Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe180 185 190Gln Asn His Glu Val Asp Glu Val Thr Gly Ser Asp Pro Asp Thr Trp195 200 205Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val His Asp Val Gly Pro Gly Ile Phe210 215 220Leu Tyr Arg Asn Gln Asp Ser Ser Phe Glu Asn Trp Glu Tyr Leu Gly225 230 235 240Glu Trp Trp Gln Glu Pro Ala Asn Ser Thr Trp Gly Asp Gly Thr Trp245 250 255Ala Lys Arg Trp Gly Tyr Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Phe Ser Leu260 265 270Asp Arg Glu Gly Tyr Asn Val Asp Gly His Thr Phe Met Thr Ile Gly275 280 285Val Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Ile Gln Pro Ser Val Thr Ser Met His290 295 300Ala Met Leu Trp Ala Ala Gly Asn Val Ser Ser Glu Asn Gly Glu Asn305 310 315 320Val Thr Phe Thr Pro Tyr Met Ala Gly Ala Leu Asp Trp Gly Met Ala325 330 335Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Lys Val Leu Pro Ser Thr Ser Gln Ala Ser340 345 350Glu Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Trp Val Trp Leu Thr355 360 365Gly Asp Glu Phe Gly Ala Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ala Gln Gln Gly370 375 380Trp Gln Asn Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Ser Ile His Thr Ile385 390 395 400Gln Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Ile His Glu Thr Ala Ser Trp Arg405 410 415Val Ala Glu His Gly Gly Glu Arg Arg Ser Gly Gly Val Glu Leu Glu420 425 430Thr Leu Gly Ile Asn Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Val Ser435 440 445Ser Gly Thr Ser Phe Glu Glu Pro Ser Arg Asp Ile Asn Glu Ser Gly450 455 460Thr Ile Pro Phe Glu Arg Ser Pro Thr Ser Arg Phe Phe Ala Leu Glu465 470 475 480Ala Gln Ile Ser Phe Pro Gln Ser Ala Arg Asp Ser Glu Val Gln Ser485 490 495Gly Phe Gln Ile Leu Ala Ser Glu Leu Glu Trp Thr Thr Ile Tyr Tyr500 505 510Gln Phe Ser Asn Glu Ser lle Val lle Asp Arg Asa His Thr Ser Ala515 520 525Ala Ser Glu Thr Thr Pro Gly Leu Gly Thr Val Thr Glu Ser Gly Arg530 535 540Ile Arg Leu Phe Asp Ile Ala Gly Gly Cys Asp His Asp Gly His Gly545 550 555 560Gly His Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp His Asn Gly Asp Gly Asp His565 570 575Ser Gly Asp Gly Asp His Asn Asp Asp Asp Asp His Asn Val Asp Gly580 585 590Asp Asp Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gln Lys Arg Asp Gly Pro Cys Asp595 600 605Lys Asp His Asp Lys Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Ile Val Val Asp610 615 620Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Ser Arg Phe Val Val Ser Thr625 630 635 640Trp Val Arg Pro Trp Tyr Thr Ash Ser Thr Glu Ile Arg Phe Phe His645 650 655Asn Gly Glu Gly Glu Val Ser Phe Asp Asn Ile Ala Val His Asp Gly660 665 670Leu Tyr Asp Ala Tyr Pro Asp Arg Asp Asn675 680<210>3<211>11<212>PRT<213>聚多曲霉<400>3Val Leu Pro Ser Thr Ser Gln Ala Ser Glu Lys1 5 10<210>4<211>7<212>PRT<213>聚多曲霉<400>4Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg1 5<210>5<211>10<212>PRT<213>聚多曲霉<400>5Asp Pro Tyr Val Phe Gln Ash His Glu Val1 5 10<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>6gaygayytng tnacntaymg20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>7ckrtangtna cnarrtcrtc20<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>8gtnttycara aycaygarg19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>9tgrttytgra anacrtangg20<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>10gcytgnswng tnswngg1權(quán)利要求
1．編碼果糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子，其選自下組(a)編碼一種包含SEQ ID No.2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；(b)包含SEQ ID No.1中所示編碼區(qū)核苷酸序列或相應(yīng)核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)與(a)或(b)的核酸分子的互補鏈雜交的核酸分子；(d)核苷酸序列由于遺傳密碼子的筒并性而與(c)的核酸分子序列不同的核酸分子；以及與其互補的核酸分子。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，它是DNA或RNA分子。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸分子，其編碼一種真菌多肽。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分子，其中真菌要是曲霉屬的真菌。
5．含有根據(jù)權(quán)利要求1～4中任何一項的核酸分子的載體。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其中核酸分子可操作地與保證可翻譯RNA在原核和/或真核細胞中轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)控元件相連。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的載體，其中核酸分子含有編碼影響果糖基轉(zhuǎn)移酶細胞內(nèi)或細胞外定位的信號序列的區(qū)域。
8．用根據(jù)權(quán)利要求1～4中任何一項的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求5～7中任何一項的載體所轉(zhuǎn)化的宿主細胞或源于這種細胞的細胞。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的宿主細胞，它是細菌細胞或真菌細胞。
10．已用權(quán)利要求1～4中任何一項的核酸分子或權(quán)利要求5～7中任何一項的載體轉(zhuǎn)化了的植物細胞或源于這種細胞的細胞。
11．一種制備植物的方法，其中(a)通過引入權(quán)利要求1～4中任何一項的核酸分子和/或權(quán)利要求5～7中任何一項的載體而遺傳修飾植物細胞，和(b)由該細胞再生植物，和任選地(c)再從(b)中的植物繁殖植物。
12．含有根據(jù)權(quán)利要求10的植物細胞或可由權(quán)利要求11的方法得到的植物細胞的植物。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的植物，它是一種有用植物。
14．含有權(quán)利要求10的植物細胞的權(quán)利要求12或13植物的繁殖材料。
15．權(quán)利要求12或13的植物可收獲的植物部分。
16．含有權(quán)利要求15的可收獲植物部分的動物和/或人類的食料。
17．一種制備權(quán)利要求8或9的宿主細胞的方法，其中用權(quán)利要求1～4任何一項的核酸分子或用權(quán)利要求5～7中任何一項的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募毎?br> 18．一種制備果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求8或9的宿主細胞或權(quán)利要求10的植物細胞在允許合成果糖基轉(zhuǎn)移酶的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)細胞和/或培養(yǎng)基分離出果糖基轉(zhuǎn)移酶。
19．由權(quán)利要求1～4中任何一項的核酸分子編碼的或可由權(quán)利要求8的方法得到的果糖基轉(zhuǎn)移酶。
20．與權(quán)利要求1～4中任何一項的核酸分子或其互補鏈特異性雜交的核酸分子。
21．一種生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允許產(chǎn)生果糖基轉(zhuǎn)移酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8或9的宿主細胞或含有這種細胞的宿主，并將任選加入的蔗糖或等價底物轉(zhuǎn)化為聚果糖，和(b)從培養(yǎng)的細胞、宿主或培養(yǎng)基得到如此產(chǎn)生的聚果糖。
22．一種生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允許轉(zhuǎn)化成聚果糖的條件下，用權(quán)利要求19的果糖轉(zhuǎn)酶接觸蔗糖或等價底物；和(b)獲取如此產(chǎn)生的聚果糖。
23．一種生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法，包括從權(quán)利要求10的植物細胞、權(quán)利要求12或13的植物或這種植物的部分提取聚果糖的步驟。
24．一種生產(chǎn)表面活化劑的方法，包括權(quán)利要求21或22的(a)步驟和(b)步驟或權(quán)利要求23的提取步驟。
25．權(quán)利要求8或9的宿主細胞或權(quán)利要求10的植物細胞作為食品添加劑的應(yīng)用。
26．權(quán)利要求19的果糖基轉(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖中的應(yīng)用。
全文摘要
公開了編碼具有果糖基轉(zhuǎn)酶活性的多肽的核酸分子，還公開了含有這種核酸分子的載體、宿主細胞和轉(zhuǎn)基因植物，以及使用所述宿主和/或由它們所產(chǎn)生的果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)聚果糖、特別是菊淀粉型聚果糖的方法。
文檔編號A23L1/09GK1317048SQ99810593
公開日2001年10月10日 申請日期1999年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月2日
發(fā)明者A·G·海爾, J·雷姆, R·溫登伯格 申請人:馬普科技促進協(xié)會