專利名稱：一種雙果糖酐Ⅲ的雙酶耦合制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙果糖酐III生物制備方法，尤其是指一種雙果糖酐III的雙酶 耦合制備方法，屬于功能性食品生物加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，功能食品成為廣大消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)，其開發(fā)更是廣大食品從業(yè)者研發(fā) 的焦點(diǎn)。糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低齡化，使得低熱量、具有更多功能 營養(yǎng)特性的功能性甜味劑成為關(guān)注的熱點(diǎn)。雙果糖酐III(Difruc0Se anhydride，DFAIII)是一種兩個(gè)果糖結(jié)合的最小的非 還原性雙糖，菊苣、菊芋等植物中含有少量的雙果糖酐III，在蜂蜜、咖啡等的加工過程中產(chǎn) 生少量雙果糖酐III。其相對甜度為蔗糖的一半，而熱量值卻只有蔗糖的1/15 ；性質(zhì)十分 穩(wěn)定，74%相對濕度下不吸濕；對熱和酸十分穩(wěn)定，在高酸度與高溫的條件下不會(huì)水解，在 一般食品加工條件下，幾乎不會(huì)出現(xiàn)褐變或分解現(xiàn)象。雙果糖酐III還具有良好的生理功 能，如在消化道不吸收，且不產(chǎn)生能量，可作為一種甜味劑；作為一種增歧因子，可促進(jìn)腸道 微生物的生長，明顯改善排便、利尿功能；作為促進(jìn)人體對Ca、Mg、Zn、CU等礦物元素吸收的 功能性糖類，增進(jìn)骨骼的生長；不能被誘發(fā)蛀牙的口腔鏈球菌利用，不產(chǎn)酸，具有抗齲齒的 功能。這些優(yōu)點(diǎn)使其在食品工業(yè)中的應(yīng)用有廣闊的前景。天然的雙果糖酐III含量很少，提取分離成本高，化學(xué)合成有許多不利的因素， 比如分離純化復(fù)雜且污染環(huán)境；而生物法制備雙果糖酐III，屬于天然產(chǎn)品，符合消費(fèi)者 的心理，因此采用生物轉(zhuǎn)化法成為雙果糖酐III制備研究的熱點(diǎn)。生物轉(zhuǎn)化法的研究有 30多年的歷史，1973年Uchiyama T首次從產(chǎn)脲節(jié)桿菌中發(fā)現(xiàn)了菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(inulin fructotransferase, EC2. 4. 1.93)，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)十余種微生物可以產(chǎn)此酶，主要集中 在節(jié)桿菌屬，包括 Arthrobacter urefaciens7116、Arthrobacter sp. A_6、Arthrobacter ilicis 0K17B、Arthrobacter globiformisCl1-1、Arthrobacter sp. H65-7、Arthrobacter pascens T13-2、Arthrobacter sp. Buol41、 Arthrobacter sp. L68-1,另外在三種其它 菌屬中也發(fā)現(xiàn) 了此醇，如 Flavobacterium sp. LC—413、Bacillus sp. Snu_7、Leifsonia sp.T88-4。本發(fā)明人深入調(diào)查和研究了現(xiàn)有技術(shù)并對各種產(chǎn)雙果糖酐III的方法進(jìn)行了研 究，提出以一種新的底物蔗糖和兩種酶(蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶與菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶)結(jié)合作用制 取雙果糖酐III的方法。通過蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶將蔗糖轉(zhuǎn)化為低聚果糖，再加入菊糖果糖轉(zhuǎn) 移酶，得到雙果糖酐III?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)提出了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種廉價(jià)的雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法。利用雙酶耦 合的方法，區(qū)別現(xiàn)有大多數(shù)單酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法，其步驟為A、將蔗糖作為底物溶于去離子水中，配成蔗糖反應(yīng)底物，蔗糖反應(yīng)底物濃度控制 在20 300g/L，調(diào)節(jié)pH值5 7，升溫至30 55°C，加入蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶，加入量為1 20U/g蔗糖，恒溫反應(yīng)4 12小時(shí)；B、在步驟(A)之后，再加入菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶，加入量為2 15U/g蔗糖，調(diào)節(jié)pH值 5 7，利用雙酶耦合催化反應(yīng)技術(shù)，40 60°C保溫反應(yīng)12 36小時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)35%以上；C、將步驟(B)所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物溶液加熱，滅酶活，加入所得體系質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3% 的活性炭，脫色過濾；濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃縮液2 5倍體積的乙 醇，冷卻結(jié)晶；離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后得到雙果糖酐III 粗品；D、重結(jié)晶將得到的雙果糖酐III粗品按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 30%的濃度溶解于去離 子水中，升溫至70 80°C，加入雙果糖酐III粗品質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的活性炭，脫色過濾，濃縮 至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃縮液2 5倍體積的乙醇，冷卻結(jié)晶，離心去除上 清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后得到雙果糖酐III成品。根據(jù)本方法轉(zhuǎn)化效率及后續(xù)提取、加工等工藝的要求，有效地控制酶在轉(zhuǎn)化液中 的濃度，不僅可以提高轉(zhuǎn)化率，也可充分利用酶活力，是反應(yīng)體系達(dá)到最佳的穩(wěn)定條件，確 保產(chǎn)品的加工工藝要求。上述雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法，作為優(yōu)選，所述的步驟A中，轉(zhuǎn)化液底物 濃度控制在20 300g/L。底物濃度的控制決定反應(yīng)底物的轉(zhuǎn)化率，符合后續(xù)加工工藝的要 求，因此有效地控制反應(yīng)底物的濃度，不僅可以提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，也可充分地利用酶活力， 使反應(yīng)條件符合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的要求，從而達(dá)到穩(wěn)定工藝，提高生產(chǎn)效率，節(jié)約能源。上述雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法，作為優(yōu)選，所述的步驟B中，溶液中加入 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的量是2 15U/g(酶活力/底物質(zhì)量)。上述雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法，作為優(yōu)選，所述的步驟C和D為精制過 程。生產(chǎn)過程中，一次性產(chǎn)品出來很難直接達(dá)到合格，因此需要一個(gè)精制過程。用高效液相色譜法檢測DFAIII的含量。HPLC檢測條件糖柱(Waters Sugur-Pak 1,6. 5X300mm)；流動(dòng)相超純水；示差折光檢測器(Shodex RI101)；柱溫80°C ；流速 0. 4mL/min ；進(jìn)樣量10ii L。檢測反應(yīng)液的DFAIII的峰面積與一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品DFAIII的峰面積的比值， 得出反應(yīng)液中DFAIII的含量。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化率可超過35%。本發(fā)明利用微生物產(chǎn)酶，酶活力高，容易得到酶液。產(chǎn)酶的微生物均來源于自然， 穩(wěn)定性高，安全性好；本發(fā)明特點(diǎn)在于工藝控制穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，能耗低，所得產(chǎn)品安全可靠等優(yōu)點(diǎn)， 具有產(chǎn)業(yè)化的前景。


圖1高效液相色譜法檢測DFAIII的含量圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 將100g蔗糖干品溶解于1L去離子水中，用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至5. 5，升溫至 30°C，加入蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶對底物的量是lU/g，恒溫轉(zhuǎn)化12小時(shí)；再加入菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶 對底物的量是15U/g，溫度40°C、pH5. 5，反應(yīng)36小時(shí)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)37%。滅酶活，加活性炭 脫色過濾，濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃縮液體積2倍的乙醇，冷卻結(jié)晶。 離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后得到DFAIII粗品。將得到的DFAIII粗品取100g按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的濃度溶解于去離子水中，升溫至 70°C，加入粗品質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的活性炭，脫色過濾，濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加 入濃縮液2倍體積的乙醇，冷卻結(jié)晶，離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干 燥后得到DFAIII成品。用高效液相色譜法檢測DFAIII的含量，含量見圖1。HPLC檢測條件糖柱(Waters Sugur-Pak 1,6. 5X 300mm)；流動(dòng)相，超純水；示差折光檢測器(ShodexRIlOl)；柱溫， 80°C ；流速，0. 4mL/min ；進(jìn)樣量，10 u L。檢測反應(yīng)液的DFAIII的峰面積與一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品DFAIII的峰面積的比值， 得出反應(yīng)液中DFAIII的含量。實(shí)施案例2 將20g蔗糖干品溶解于1L去離子水中，用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至6，升溫至55°C， 加入蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶對底物的量是20U/g，放入55°C恒溫轉(zhuǎn)化4小時(shí)；再加入菊糖果糖轉(zhuǎn)移 酶對底物的量是10U/g，溫度55°C、pH6，反應(yīng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)45%。滅酶活，加活性炭 脫色過濾，濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃縮液3倍體積的乙醇，冷卻結(jié)晶， 離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后得到DFAIII粗品。將得到的DFAIII粗品取100g按重量比20%的濃度溶解于去離子水中，升溫至 80°C，加入粗品重量3%的活性炭，脫色過濾，濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃 縮液2倍體積的乙醇，冷卻結(jié)晶，離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后 得到DFAIII成品。實(shí)施案例3 將300g蔗糖干品溶解于1L去離子水中，用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7，升溫至50°C， 加入蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶對底物的量是6U/g，放入50°C恒溫轉(zhuǎn)化8小時(shí)；再加入菊糖果糖轉(zhuǎn)移 酶對底物的量是2U/g，溫度50°C，pH5. 5，反應(yīng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)39%。滅酶活，加活性炭 脫色過濾，濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃縮液2倍體積的乙醇，冷卻結(jié)晶， 離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后得到DFAIII粗品。將得到的DFAIII粗品取100g按重量比30%的濃度溶解于去離子水中，升溫至 80°C，加入粗品重量4%的活性炭，脫色過濾，濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃 縮液體積4倍的乙醇，冷卻結(jié)晶，離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后 得到成品。本文所描述的具體實(shí)施案例僅作為對本發(fā)明精神和部分實(shí)驗(yàn)做舉例說明。本發(fā)明 所述領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實(shí)施案例做出各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。
權(quán)利要求
一種雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法，其特征在于步驟為A、將蔗糖作為底物溶于去離子水中，配成蔗糖反應(yīng)底物，蔗糖反應(yīng)底物濃度控制在20～300g/L，調(diào)節(jié)pH值5～7，升溫至30～55℃，加入蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶，加入量為1～20U/g蔗糖，恒溫反應(yīng)4～12小時(shí)；B、在步驟(A)之后，再加入菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶，加入量為2～15U/g蔗糖，調(diào)節(jié)pH值5～7，利用雙酶耦合催化反應(yīng)技術(shù)，40～60℃保溫反應(yīng)12～36小時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)35％以上；C、將步驟(B)所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物溶液加熱，滅酶活，加入所得體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％～3％的活性炭，脫色過濾；濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃縮液2～5倍體積的乙醇，冷卻結(jié)晶；離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后得到雙果糖酐III粗品；D、重結(jié)晶將得到的雙果糖酐III粗品按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％～30％的濃度溶解于去離子水中，升溫至70～80℃，加入雙果糖酐III粗品質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％的活性炭，脫色過濾，濃縮至有少量晶體析出后，向濃縮液中加入濃縮液2～5倍體積的乙醇，冷卻結(jié)晶，離心去除上清液后，用乙醇清洗晶體表面殘留液，干燥后得到雙果糖酐III成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法，其特征在于雙酶耦合合 成雙果糖酐III的轉(zhuǎn)化率達(dá)39%。
全文摘要
一種雙果糖酐III的雙酶耦合制備方法，屬于功能性食品生物加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以蔗糖為底液，采用蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶和菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶，通過雙酶耦合催化反應(yīng)來合成雙果糖酐III。蔗糖底物濃度控制在20～300g/L，先用蔗糖果糖轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，添加量為1～20U/g底物，在30～55℃催化反應(yīng)4～12小時(shí)，再加入菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶，添加量為2～15U/g底物，在40～60℃催化反應(yīng)12～36小時(shí)，生物轉(zhuǎn)化率超過35％。本發(fā)明生產(chǎn)方法簡單，對環(huán)境無污染，所得到的雙果糖酐III安全可靠，屬于一種市場前景廣闊的低熱量新型甜味劑。
文檔編號C12P19/18GK101974584SQ201010267199
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者周榴明, 張濤, 杭華, 江波, 沐萬孟, 繆銘 申請人:江南大學(xué)