專利名稱：高活性果糖纈氨酸氧化酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高活性果糖纈氨酸氧化酶，本發(fā)明也同時涉及一種高活性果糖纈 氨酸氧化酶的制備方法。
背景技術(shù)：
血液中的糖化血紅蛋白(以下簡稱糖化Hb)反映了一段時期內(nèi)生物體內(nèi)的血 糖水平，近年來被用作糖尿病的診斷和治療的重要指標(biāo)。目前，糖化Hb可采用高效 液相色譜法、微柱法、免疫法、色素法等方法來測定，但這些方法或者需要專用儀器、 價格昂貴，或者檢測時間長、測量精度差，最近流行的酶法檢測，利用氧化還原反應(yīng)， 不需要特殊的測定儀器，操作簡便易行，精度高，時間短，因此廣泛應(yīng)用于生化分析 和臨床檢査。
利用上述氧化還原反應(yīng)的糖化Hb的測定過程中，需要一類特殊的酶類——果糖 基氨基酸氧化酶，該酶可作用于糖化Hb或糖化氨基酸，產(chǎn)生過氧化氫，然后添加過 氧化物酶和還原劑，使過氧化氫和還原劑之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)，可通過測定還原劑 的顯色來測定過氧化氫量，從而可知樣品中糖化Hb含量。
然而，利用現(xiàn)有果糖基氨基酸氧化酶催化該反應(yīng)，時間仍嫌稍長，酶量需求較高。 所以要求開發(fā)新型高活性果糖基氨基酸氧化酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種活性約為普通果糖纈氨酸氧化酶活性 6倍的高活性果糖纈氨酸氧化酶，其可用于糖化Hb試劑盒檢測，所用酶量減少，反 應(yīng)時間縮短。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種高活性果糖纈氨酸氧化酶的制備方法。 本發(fā)明基于果糖纈氨酸氧化酶的編碼序列，通過易錯PCR技術(shù)，建立了果糖纈 氨酸氧化酶的突變文庫，將突變文庫轉(zhuǎn)入大腸桿菌，進(jìn)行兩輪篩選，得到了活性約為 普通果糖纈氨酸氧化酶活性6倍的新型高活性果糖纈氨酸氧化酶。該高活性果糖纈氨 酸氧化酶，其氨基酸序列為SEQID.No.2的序列。
本發(fā)明的一種編碼高活性果糖纈氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸序列為SEQ ID. No. 1所示序列。
本發(fā)明的高活性果糖纈氨酸氧化酶的制備方法步驟如下
(1) 以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進(jìn)行易錯PCR 擴(kuò)增，建立果糖纈氨酸氧化酶的突變文庫；
(2) 將突變文庫轉(zhuǎn)入大腸桿菌，對'其基因進(jìn)行克隆、重組轉(zhuǎn)化和表達(dá)；
(3) 利用醌法測定酶活性，篩選出高活性果糖纈氨酸氧化酶。 隨著酶催化應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的逐步深入，研究者發(fā)現(xiàn)，酶催化的精確
性和有效性常常不能很好地滿足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用的要求，而且天然酶的穩(wěn)定性 差、活性低使催化效率很低，還缺乏有商業(yè)價值的催化功能。為此，人們利用酶的定 向進(jìn)化技術(shù)對天然酶進(jìn)行改造，從而獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。
定向進(jìn)化包括隨機(jī)突變和篩選，其中隨機(jī)突變應(yīng)用較為普遍的技術(shù)是易錯PCR 突變，即通過調(diào)整PCR體系中的離子濃度，各種dNTP含量，引物和模板濃度，使用 易產(chǎn)生突變的Taq酶，使用突變率高的菌株等方法，使PCR產(chǎn)物相對于模板產(chǎn)生許 多點突變，從而改變蛋白的氨基酸序列。*通過條件篩選，獲得具有期望特性的目的酶。
棒狀桿菌屬Corynebacterium sp. 2-4-1菌株含有果糖基纈氨酸氧化酶(FVO)的編 碼基因。本發(fā)明基于FVO的基因編碼序列，設(shè)計兩條FVO基因的易錯PCR引物， 上游引物序列為5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3，，下游引物序列 為5'-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，。以FVO的基因編碼序列作 為模板，進(jìn)行易錯PCR擴(kuò)增，經(jīng)擴(kuò)增35個循環(huán)后，PCR產(chǎn)物純化回收，與原核表達(dá) 載體pMD-l8 T Vector連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XLl-Red中，涂布LB平板，收集含有 插入片段的克隆，組成突變體庫。
提取突變體庫中的質(zhì)粒DNA，酶切，回收目的片段，連接入載體pGEX-4T-lm，轉(zhuǎn) 化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果.糖纈氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-二(甲 基氨基)-聯(lián)苯胺[DA-64]的LB平板，由于大腸桿菌自身含有過氧化物酶，故37'C培養(yǎng) 12-24小時后，可見明顯變色現(xiàn)象。挑取變g快和變色圈大的克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)基培 養(yǎng)。
將初步篩選出的克隆在25'C液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，誘導(dǎo)表達(dá)，裂解細(xì)菌， 利用醌法測定酶活性，最終得到一株酶活性約為普通果糖纈氨酸氧化酶活性6倍的高
活性菌株，其所攜帶的FVO突變命名為FV0-m-21。通過測序分析發(fā)現(xiàn)，該突變克隆中 發(fā)生五個堿基點突變，分別是堿基序列中57位C—T、 374位T—C、 534位G—A、 914 位C—A和1056位G—C，共引起了兩個氨基酸突變，分別是氨基酸序列中125位Ile —Thr和305位Ala—Glu。將FVO-m-21大量培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后純化分離目的酶，用 于糖化Hb蛋白的檢測，可得到較好效果。
本發(fā)明的果糖纈氨酸氧化酶，活性高，約為普通果糖纈氨酸氧化酶活性6倍，其 可用于糖化Hb試劑盒檢測，所用酶量減少，反應(yīng)時間縮短，適合于試劑盒的制備和 應(yīng)用，可廣泛應(yīng)用于臨床檢測。而且，制備方法都是采用現(xiàn)有常規(guī)手段，易于實施。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不僅限于下述實施例。 實施例1
以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進(jìn)行易錯PCR擴(kuò)增。
1. 引物序列
正向弓I物 5 ，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3' 反向引物 5'陽TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3 ，
2. 易錯PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件
PCR反應(yīng)體系 100nL體系中含有
10 mM Tris-HClpH 8.30， 50 mM KC1， 6.5 mM MgCl2， 0.15 mM MnCl2， 0,2 mM dGTP/dATP， 0.8 mM dTTP/dCTP， 2.2 pg SSB Protein, 0.5正向/反向引物，10 ng模板DNA 2.5單位TaqDNA聚合酶。 PCR反應(yīng)條件
94 。C 5 min; 94 °C 30 see, 55 。C 30 sec， 72 °C 2 min, 35個循環(huán)；72 °C 10 min; 4 。C forever 。
3. 易錯PCR產(chǎn)物取3 nL于P/。的瓊脂糖凝膠電泳，可見l kb左右有產(chǎn)物條帶。將 易錯PCR產(chǎn)物用純化回收試劑盒純化回收，與pMD-18TVector連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿 菌XL 1-Red中，涂布Amp抗性LB平板，可獲得Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基 因的突變體庫。 實施例2:
突變體菌株的初篩
提取突變體庫中的質(zhì)粒DNA，用BamHI和Hind III雙酶切，回收lkb左右的目 的片段，載體pGEX-4T-lm同樣用BamH I和Hind III雙酶切，回收，二者4'C連接過 夜，轉(zhuǎn)化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖纈氨酸和1^-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-聯(lián)苯胺[DA-64]的LB平板；37'C培養(yǎng)12-24小時后，可見明顯變色現(xiàn) 象。挑取變色快和變色圈大的克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，共挑取克隆48個。
實施例3:
突變體酶活性的醌法檢測
1. 在誘導(dǎo)表達(dá)4小時后，收集菌液，測量并且記錄細(xì)胞培養(yǎng)物的OD600值。
2. 制備檢測酶活的細(xì)菌裂解液。在374hLB-PERtm細(xì)菌蛋白抽提試劑(Pierce product 78248)中重新懸浮細(xì)胞，再加入50uL蛋白酶和磷酸化酶抑制劑以及細(xì)菌細(xì)胞提取物
(Sigma產(chǎn)品P8465), 1 uL 34 mg/mL的氯霉素(用甲醇配制)?？焖贉u旋振蕩一分 鐘。在冰上放置5 min。離心1 min后置于冰上。
3. 用Bradford法測定蛋白含量。
4. 取50pL上述細(xì)菌裂解液加到醌法反應(yīng)混合液中，37'C溫浴1-3 min，測量555 nm 處吸光值。反應(yīng)混合液成分為100 mM磷酸鉀緩沖液(pH 8.0), 1 purpurogallin unit/ml 過氧化物酶，0.45 mM 4-氨基安替吡啉，0.5mMTOOS (N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基) -3-甲基苯胺)，5.0mM果糖纈氨酸，總體積為3mL。
其中， 一個酶活力單位定義為在37'C每分鐘可催化產(chǎn)生0.5pM醌染料。實際酶活力 按每分鐘每mg蛋白質(zhì)所形成的nmol產(chǎn)物來測定。
實施例4:
高活性突變FVO的序列測定
通過酶活力測定，篩選出活力約為普通果糖纈氨酸氧化酶活力6倍的高活突變。 提取質(zhì)粒DNA，測序發(fā)現(xiàn)該突變序列如SEQ ID. No. 1所示。
其中發(fā)生突變的位點，為57位C—T、 374位T—C、 534位G—A、 914位C—A 和1056位G—C。
對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID. No. 2所示。
其中發(fā)生突變的氨基酸位點，共有兩個氨基酸突變，分別是氨基酸序列中125位 lie—Thr和305位Ala—Glu。
以上實施例是對專利的說明和進(jìn)一步解釋，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的 精神和權(quán)利保護(hù)范圍內(nèi)所做的任何修改，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
SEQUENCE LISTING <110>寧波美康生物科技有限公司 <120>高活性果糖纈氨酸氧化酶及其制備方法 <130> 001 <160〉 2
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 1119
<212> DNA
<213> Corynebacterium sp. <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1119)
<400> 1
atg tec tec acc get acc aag cat gtc gcc gtc att ggc ggc ggc ate 48 Met Ser Ser Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val lie Gly Gly Gly lie 15 10 15
ctg ggc gtt tec acc gcc gtc cac ctg etc cgc caa ggc gca aca gtc 96 Leu Gly Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gin Gly Ala Thr Val 20 25 30acc etc ttg acc gaa cag ggc etc gcc age gaa gcc acg ggc egg tec 144 Thr Leu Leu Thr Glu Gin Gly Leu Ala'Ser Glu Ala Thr Gly Arg Ser 35 40 45
ttg tec tgg etc aac tec gcc ggg gaa cgc tec act ccc tat cac cag 192 Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Gly Glu Arg Ser Thr Pro Tyr His Gin 50 55 60
ctg cgc ate get ggc gtt gac egg tac cgc acg ctg ttc gcc gcc gat 240
Leu Arg He Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Phe Ala Ala Asp
65 70 75 80
ccc age egg gaa tgg ttg cag ttc ggg ggc ggg etc atg tgg aac gcc 288 Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gin Phe Gly Gly Gly Leu Met Trp Asn Ala
85 卯 95
gcc ggg gaa agt gag gtc acc aaa gcc egg cac gcc tac gag aag tec 336 Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser 100 105 110
ate ggc tac gac tec caa ctg ctg gcc cct gaa gaa acc ggc teg gtc 384 lie Gly Tyr Asp Ser Gin Leu Leu Ala fro Glu Glu Thr Gly Ser Val 115 120 125
acg cca ggc ate gac gcc agt gcc gtc ccg gag aac gca ate ttc aat 432 Thr Pro Gly lie Asp Ala Ser Ala Val Pro Glu Asn Ala lie Phe Asn 130 135 140
cct ggc gag ggc tgg gtc age ctg ccg gac ctg gtg aac ttc ctg atg 480
Pro Gly Glu Gly Trp Val Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met
145 150 155 160gag gaa ttc cac gcc ctg ggc ggc cag ttg gtc etc aac gca ggt aaa 528 Glu Glu Phe His Ala Leu Gly Gly Gin.Leu Val Leu Asn Ala Gly Lys
165 170 175
gcc tea gtg atg gtc gag ggc ggc egg get acc gcg gtc gaa acc gcc 576 Ala Ser Val Met Val Glu Gly Gly Arg Ala Thr Ala Val Glu Thr Ala 180 185 l卯
acc ggt gaa acc tac ccc gcg gac gcc gtt etc gta gcc tgc ggt gcc 624 Thr Gly Glu Thr Tyr Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ala Cys Gly Ala 195 200 205
gcg acg ccg gcc gtc gta aaa ccg etc ggg gtc gag ata ccg aac ggt 672 Ala Thr Pro Ala Val Val Lys Pro Leu Gly Val Glu lie Pro Asn Gly 210 215 220
tec ccg gtc tec atg ctg gtt gtt acc aag ccc gtg gag cac cag gtc 720
Ser Pro Val Ser Met Leu Val Val Thr Lys Pro Val Glu His Gin Val
225 230 235 240
gcg gca gtg atg aat acg ccg cgc get gcc gtg cga ccc aat ccg ggt 768 Ala Ala Val Met Asn Thr Pro Arg Ala Ala Val Arg Pro Asn Pro Gly
245 250 255
aac act ttt gcc ttg gat cac gac tgg tat gaa ggg cac ate act gag 816 Asn Thr Phe Ala Leu Asp His Asp Trp Tyr Glu Gly His lie Thr Glu 260 265 270
cac gcg gac ggt teg ttc acc ate ccg gat gat gtc gtc cag gaa ttg 864 His Ala Asp Gly Ser Phe Thr lie Pro Asp Asp Val Val Gin Glu Leu
275 280 285
gca gac gag tea tec aag ctg ate gca gga aac ccc gag etc aag ccg 912 Ala Asp Glu Ser Ser Lys Leu lie Ala Gly Asn Pro Glu Leu Lys Pro 290 295 300
gaa tcg tgg aag ate ggt tac aag ccg ate ccg ggc gac ggc gaa cca 960
Glu Ser Trp Lys lie Gly Tyr Lys Pro lie Pro Gly Asp Gly Glu Pro
305 310 315 320
gtc ttc ggg gaa etc ggc cga gta ccg ggc tgc ttc gtg get ttc acc 1008 Val Phe Gly Glu Leu Gly Arg Val Pro Gly Cys Phe Val Ala Phe Thr
325 330 335
cac tea ggt gcc acc ctg ggc etc ate gca ggc gaa ttg etc tec ggc 1056 His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu lie Ala Gly Glu Leu Leu Ser Gly 340 345 350
cag ate ctg acg ggg gac aag cac ccc atg ttc gcc acg ttc egg ccg 1104 Gin lie Leu Thr Gly Asp Lys His Pro Met Phe Ala Thr Phe Arg Pro 355 360 365
ggc egg ttc tec tag 1119 Gly Arg Phe Ser 370
<210> 2
<211> 372
<212> PRT
<213> Corynebacterium sp.
<400> 2
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Leu Arg He Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Phe Ala Ala Asp
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Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gin Phe Gly Gly Gly Leu Met Trp Asn Ala
85 90 95
Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser 100 105 110
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Pro Gly Glu Gly Trp Val Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met
145 150 155 160
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GlyArgPheSer 370
權(quán)利要求
1.一種高活性果糖纈氨酸氧化酶，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID.No.2的序列。
2、 一種編碼權(quán)利要求1所述的高活性果糖纈氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸 序列為SEQ ID. No. 1所示序列。
3、 一種高活性果糖纈氨酸氧化酶的制備方法，其特征在于其步驟如下(1) 以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進(jìn)行易錯PCR 擴(kuò)增，建立果糖纈氨酸氧化酶的突變文庫；(2) 將突變文庫轉(zhuǎn)入大腸桿菌，對其基因進(jìn)行克隆、重組轉(zhuǎn)化和表達(dá)；(3) 利用醌法測定酶活性，篩選出高活性果糖纈氨酸氧化酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高活性果糖纈氨酸氧化酶及其制備方法，其氨基酸序列為SEQ ID.No.2的序列；核苷酸序列為SEQ ID.No.1所示序列。制備步驟為(1)以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進(jìn)行易錯PCR擴(kuò)增，建立果糖纈氨酸氧化酶的突變文庫；(2)將突變文庫轉(zhuǎn)入大腸桿菌，對其基因進(jìn)行克隆、重組轉(zhuǎn)化和表達(dá)；(3)利用醌法測定酶活性，篩選出高活性果糖纈氨酸氧化酶。所得果糖纈氨酸氧化酶活性約為普通果糖纈氨酸氧化酶活性的6倍，其可用于糖化Hb試劑盒檢測，所用酶量減少，反應(yīng)時間縮短。
文檔編號C12N9/02GK101368174SQ200810166340
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月23日
發(fā)明者姜云飛, 鄒炳德 申請人:寧波美康生物科技有限公司