專利名稱：利用酶活性的競爭性干擾和恢復(fù)檢測被分析物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的內(nèi)容涉及利用多核苷酸和結(jié)合分子來檢測溶液中的被分析 物的方法，其中該方法利用了酶活性的竟?fàn)幮愿蓴_和恢復(fù)。
背景技術(shù)：
樣品中被分析物的定量和定性4全測經(jīng)常用于化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。例如，
括，例如病毒和細菌抗原、免疫球蛋白、激素、細胞、藥物、毒素和管制 藥物。由于這些技術(shù)通常缺乏足夠的靈敏度和精密度，因此已經(jīng)開發(fā)出放 大系統(tǒng)。
已經(jīng)開發(fā)出許多不同的用于定性和定量檢測樣品中的被分析物的免
疫分析方法，如酶if關(guān)免疫吸附分析(ELISA)、》文射免疫分析(RIA)和酶 免疫分析(EIA)。例如，免疫分析可以設(shè)定為均相或異相分析，其中異相 分析為包含固相和液相的兩相分析，而均相分析是以單一相進行的。異相 分析，如ELISA是常用的，但不利的是其要求的步驟比均相分析多。而且， 除了需要額外的清洗步驟外，異相分析的缺點還在于其永遠不能真正地實 現(xiàn)自動化?，F(xiàn)有的均相分析，例如酶片段互補(EFC)。 EFC是基于抗體-抗原結(jié)合的均相分析，但不利的是其靈敏度和分辨率低，因為其通常只對 小抗原起作用，并且僅在具有高背景活性的分析中起作用。
問題在于當(dāng)前可用的分析方法都需要有技術(shù)的技術(shù)人員，只有幾種技 術(shù)成功地適用于選擇的被分析物的檢測，并且沒有既是均相的又在各種分 析條件下對各種被分析物都靈敏的方法。因此，技術(shù)人員希望得到一種易 于使用的均相分析方法，其耗時少于異相分析，具有高靈敏度和精密度而 且能實現(xiàn)自動化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的教導(dǎo)主要涉及利用多核苷酸和結(jié)合分子檢測溶液中的 被分析物的方法，其中該方法利用了酶活性的竟?fàn)幮愿蓴_和恢復(fù)。該教導(dǎo)還涉及用于實施該方法的試劑和試劑盒。
在某些實施方案中，本發(fā)明的教導(dǎo)涉及了測定溶液中被分析物的濃度
的方法。該方法包括選擇結(jié)合化合物；選擇被分析物的類似物并使類似物 結(jié)合到多核苷酸底物以構(gòu)成試劑，用于利用期望的多核香酸反應(yīng)測定分析 溶液中被分析物的含量。分析溶液中試劑與結(jié)合化合物的結(jié)合與分析溶液 中被分析物與結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)?。該方法還包括選擇用于催化期望 的多核苷酸反應(yīng)的期望的酶。
選擇并構(gòu)成成分后，可以選擇該方法中使用的成分的相對用量。同樣
的酶的量:確定結(jié)合化合物與試劑的期望比率。'、、'，
然后形成分析溶液，其包含一定量的結(jié)合化合物和含量待測的被分析 物。隨后，將一定量的試劑加到分析溶液中，其中試劑的用量和結(jié)合化合 物的用量實現(xiàn)了結(jié)合化合物與試劑的期望比率。再向分析溶液中加入預(yù)先 選定用量的期望的酶，用于催化期望的多核苷酸反應(yīng)。然后測定期望的多 核苷酸反應(yīng)中期望的酶活性，來確定分析溶液中被分析物的含量。測定酶 活性的方法的例子包括但不限于技術(shù)人員所知的熒光和吸光率測定方法。
在某些實施方案中，結(jié)合化合物包括配體結(jié)合分子、抗體或細胞受體。 在某些實施方案中，類似物包含被分析物的結(jié)構(gòu)或者為具有被分析物的分 子結(jié)構(gòu)的化合物。在某些實施方案中，多核香酸底物包括多核苷酸引物、 多核苷酸模板或二者的組合。在某些實施方案中，多核苷酸底物為雙鏈
DNA或單鏈DNA。
在某些實施方案中，期望的多核苷酸反應(yīng)包括核苷酸聚合反應(yīng)、核苷 酸裂解反應(yīng)或者核苷酸聚合反應(yīng)和核苷酸裂解反應(yīng)的組合。在某些實施方 案中，期望的多核苷酸反應(yīng)包括核苷酸重組反應(yīng)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的教導(dǎo)涉及用于竟?fàn)幮越Y(jié)合分析的試劑。 該試劑可以包括結(jié)合到類似物的多核苷酸底物，并且可以選擇類似物(i) 與分析溶液中預(yù)先選定的結(jié)合化合物相結(jié)合；以及(ii)與分析溶液中被 分析物與預(yù)先選定的結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)?。可以選擇多核苷酸底物參 與期望的多核苷酸反應(yīng)，該反應(yīng)通過分析溶液中結(jié)合化合物與類似物的結(jié) 合而抑制或終止。
在某些實施方案中，本發(fā)明的教導(dǎo)涉及用于測定分析溶液中被分析物 含量的竟?fàn)幮越Y(jié)合分析試劑盒。該試劑盒包含上述試劑，以及用于竟?fàn)幮?br> 6結(jié)合分析的結(jié)合化合物，其中分析溶液中試劑與結(jié)合化合物的結(jié)合，與分 析溶液中被分析物與結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)?。試劑盒還包括用于催化期 望的多核苷酸反應(yīng)的酶，其中測定酶的活性用于確定分析溶液中被分析物 的含量。


圖1A至1C說明了根據(jù)某些實施方案，聚合酶活性的干擾和恢復(fù)的原理。
圖2A至2C說明了根據(jù)某些實施方案，核酸外切酶活性的干擾和恢復(fù) 的原理。
圖3A至3C說明了根據(jù)某些實施方案，聚合酶反應(yīng)干擾和核酸外切酶 干擾的循環(huán)以及恢復(fù)循環(huán)的原理。
圖4A至4C說明了根據(jù)某些實施方案，轉(zhuǎn)移酶活性的干擾和恢復(fù)的 原理。
圖5說明了根據(jù)某些實施方案，利用聚合酶反應(yīng)干擾的竟?fàn)幮越Y(jié)合分 析方法。
圖6說明了根據(jù)某些實施方案，利用核酸外切酶反應(yīng)干擾的竟?fàn)幮越Y(jié) 合分析方法。
圖7說明了根據(jù)某些實施方案，利用轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)干擾的竟?fàn)幮越Y(jié)合分 才斤方法。
圖8說明了根據(jù)某些實施方案，如何使用實時PCR測定聚合酶反應(yīng)的 抗-Dig^元體的干擾。
具體實施例方式
本發(fā)明提供的教導(dǎo)主要涉及利用多核苷酸和結(jié)合分子檢測溶液中被 分析物的方法，其中該方法利用酶活性的竟?fàn)幮愿蓴_和恢復(fù)。本發(fā)明提供 的教導(dǎo)包括均相分析。
本發(fā)明的教導(dǎo)還涉及用于實施該方法的試劑和試劑盒。 在本發(fā)明教導(dǎo)的每種方法中，多核苷酸反應(yīng)的程度被用于測定溶液中 被分析物的含量。在某些實施方案中，多核苷酸反應(yīng)可以是使用聚合酶的 聚合反應(yīng)、使用核酸外切酶的裂解反應(yīng)、循環(huán)使用聚合酶和核酸外切酶的 聚合和裂解反應(yīng)的循環(huán)，或重組反應(yīng)。
7圖1A至1C說明了根據(jù)某些實施方案，聚合酶活性的干擾和恢復(fù)的原 理。不想受任何理論或作用機理的限制，據(jù)信所發(fā)生的聚合酶活性的干擾 和恢復(fù)如下圖1 (A)說明了由聚合酶106催化的聚合反應(yīng)，其中多核 苷酸底物102結(jié)合類似物104。在某些實施方案中，多核苦酸底物102與 類似物104可以組合成試劑。選擇的類似物104與預(yù)先選定的結(jié)合化合物 108相結(jié)合，干擾聚合反應(yīng)。在圖1A中，聚合酶106用于聚合反應(yīng)以生 成雙鏈多核苷酸112。在圖1B中，結(jié)合化合物108結(jié)合類似物104，并干 擾聚合反應(yīng)，這樣通過加入結(jié)合化合物108來抑制或終止聚合反應(yīng)。在圖 1C中，被分析物IIO也能與結(jié)合化合物108結(jié)合，并與結(jié)合到結(jié)合化合物 108的類似物104相竟?fàn)?。結(jié)合的竟?fàn)幾璧K了一部分可用的結(jié)合化合物 108,從而導(dǎo)致某些聚合反應(yīng)的恢復(fù)，生成雙鏈多核苷酸112。被分析物的 含量決定了恢復(fù)的量，因此恢復(fù)的量可以測定被分析物的含量。
圖2A至2C說明了根據(jù)某些實施方案，核酸外切酶活性的干擾和恢復(fù) 的原理。不想受任何理論或作用機理的限制，據(jù)信發(fā)生的核酸外切酶活性 的干擾和恢復(fù)如下圖2A說明了由核酸外切酶206催化的裂解反應(yīng)，其 中多核苷酸底物202結(jié)合類似物204。所選的類似物204與預(yù)先選定的結(jié) 合化合物208相結(jié)合，干擾裂解反應(yīng)。在圖2A中，裂解反應(yīng)中使用核酸 外切酶206將雙鏈多核苷酸202裂解為部分降解的多核苷酸212,最終成 為單鏈多核香酸。在圖2B中，結(jié)合化合物208結(jié)合類似物204,并干擾 裂解反應(yīng)，這樣通過加入結(jié)合化合物208來抑制或終止裂解反應(yīng)。在圖2C 中，被分析物210也能與結(jié)合化合物208結(jié)合，與結(jié)合到結(jié)合化合物208 的類似物204相竟?fàn)?。結(jié)合的竟?fàn)幾璧K了 一部分可利用的結(jié)合化合物208, 從而導(dǎo)致某些裂解反應(yīng)的恢復(fù)，單鏈多核苷酸214的生成。被分析物的含 量決定了恢復(fù)的量，因此恢復(fù)的量可以測定被分析物的含量。
圖3A至3C說明了根據(jù)某些實施方案，聚合酶反應(yīng)干擾和核酸外切酶 干擾的循環(huán)以及恢復(fù)循環(huán)的原理。不想受任何理論或作用機理的限制，據(jù) 信所發(fā)生的聚合酶和核酸外切酶反應(yīng)循環(huán)的干擾和恢復(fù)活性如下圖3A 說明了包括采用聚合酶303的多核苷酸底物302的聚合和采用核酸外切酶 305的裂解的循環(huán)反應(yīng)。如圖1和圖2所示，被選的類似物304結(jié)合到結(jié) 合化合物308。在圖3B中，所示的結(jié)合化合物308干擾循環(huán)的兩個階段， 聚合和裂解。在圖3C中，被分析物310也能與結(jié)合化合物308結(jié)合，與 類似物304竟?fàn)幮越Y(jié)合到結(jié)合化合物308。該竟?fàn)幮越Y(jié)合阻礙了一部分可利用的結(jié)合化合物308,從而導(dǎo)致某些裂解反應(yīng)和聚合反應(yīng)的恢復(fù)，導(dǎo)致 多核苷酸底物302形成雙鏈多核苷酸和該雙鏈多核苦酸降解的循環(huán)增長。 被分析物的含量決定了恢復(fù)的量，故可以用恢復(fù)的量來測定被分析物的含 量。循環(huán)的作用是通過放大測得的信號來提高檢測的靈敏度，其中放大的 程度取決于檢測過程中使用的循環(huán)次數(shù)。
圖4A至4C說明了根據(jù)某些實施方案，轉(zhuǎn)移酶活性的干擾和恢復(fù)的 原理。不想受任何理論或作用機理的限制，據(jù)信所發(fā)生的轉(zhuǎn)移酶活性的干 擾和恢復(fù)如下圖4A說明的多核苷酸底物402是單鏈多核苷酸。單鏈多 核苷酸402為本實施例中的靶多核苷酸。轉(zhuǎn)移酶403和雙鏈多核普酸探針 405與單鏈靶多核苷酸402相結(jié)合發(fā)生重組反應(yīng)，其中的靶多核苷酸402 取代FAM-標(biāo)記的多核苷酸409生成重組的雙鏈多核香酸407。在圖4B中， 結(jié)合化合物408結(jié)合到類似物404,干護O重組反應(yīng)，這樣通過加入結(jié)合化 合物408來抑制或終止重組反應(yīng)。在圖4C中，-故分析物410也能與結(jié)合 化合物408結(jié)合，與類似物404竟?fàn)幮越Y(jié)合到結(jié)合化合物408。該竟?fàn)幮?結(jié)合阻礙了一部分可利用的結(jié)合化合物408,從而導(dǎo)致某些重組反應(yīng)的恢 復(fù)，生成重組雙鏈多核香酸407。被分析物的含量決定了恢復(fù)的量，故可 以用恢復(fù)的量來測定被分析物的含量。
本發(fā)明的內(nèi)容主要涉及測定溶液中被分析物濃度的方法，該方法包括 上文討論的某些形式的反應(yīng)。在某些實施方案中，期望的多核苷酸反應(yīng)包 括核苷酸聚合反應(yīng)、核苷酸裂解反應(yīng)或者核苷酸聚合反應(yīng)和核苷酸裂解反 應(yīng)的組合。在某些實施方案中，期望的多核苷酸反應(yīng)包括核苷酸重組反應(yīng)。 在某些實施方案中，與現(xiàn)有可使用的均相分析相比，期望的反應(yīng)獲得了明 顯更高的靈敏度，這是通過循環(huán)反應(yīng)，使用實時PCR，使用序列長度超過 lkb或更長的多核苦酸底物，或它們的組合來實現(xiàn)的。
可以利用熒光信號的出現(xiàn)或消失來檢測被分析物，所述熒光信號由化 學(xué)藥品產(chǎn)生，如與寡核苷酸結(jié)合的染料；或者來自吸收光譜，如UV-可見 光語信號。在某些實施方案中，檢測包括識別由酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā) 光信號。在某些實施方案中，可以通過使用實時PCR檢測來提高檢測的靈 敏度。在某些實施方案中，可以使用化學(xué)染料，例如PICOGREEN來檢測 雙鏈多核苦酸。在某些實施方案中，用熒光素和darkquencher預(yù)先標(biāo)記雙 鏈探針，這樣可以用于檢測轉(zhuǎn)移酶活性。在某些實施方案中，可以使用熒 光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)來檢測熒光信號。技術(shù)人員將認識到多種
9已知檢測系統(tǒng)中的任何一種都可以用于補充本發(fā)明提供的內(nèi)容。
本發(fā)明提供的內(nèi)容主要涉及均相分析，其中無需從其他反應(yīng)成分中分 離出流體樣品就可以檢測被分析物的存在和含量。異相分析與均相分析的 區(qū)別在于，異相分析的反應(yīng)介質(zhì)包含至少兩個獨立的相，如具有附著的用 于結(jié)合被分析物的試劑的固相載體和含有被分析物的流體介質(zhì)。
該方法包括選擇結(jié)合化合物；選擇被分析物的類似物并將類似物與多
核苷酸底物結(jié)合以構(gòu)成試劑，利用期望的多核苷酸反應(yīng)來測定分析溶液中 被分析物的含量。分析溶液中試劑與結(jié)合化合物的結(jié)合，與分析溶液中被 分析物與結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)帯?br> 技術(shù)人員將認識到，被分析物可以為流體分析樣品中可以確定其存在 和含量任何化合物。被分析物的例子包括但不限于毒素、管制藥物、激素、 小分子藥物、生物藥品、核酸、蛋白質(zhì)、肽、免疫球蛋白或它們的片段、 抗原或細菌或病毒顆粒，其在免疫或其他反應(yīng)中能與配體反應(yīng)。
結(jié)合化合物的選擇取決于樣品中要確定和/或定量的被分析物的結(jié)構(gòu)。 例如，若被分析物為抗原，抗原的抗體可以用作適合的結(jié)合化合物。若被 分析物為細胞因子，例如細胞受體可以用作細胞因子的適合的結(jié)合化合 物。因此，在某些實施方案中，結(jié)合化合物包括配體結(jié)合分子、抗體或細 胞受體。這些結(jié)合化合物的例子可以包括但不限于免疫球蛋白、維生素結(jié)
合蛋白、IL-1受體、T-細胞受體等。
結(jié)合化合物的選擇至少部分取決于結(jié)合化合物與被分析物和類似物 的相對結(jié)合親和力。以配體結(jié)合分子為例，其可以包括對另一目標(biāo)化合物 具有高結(jié)合親和力的任何分子。在某些實施方案中，結(jié)合親和力的范圍為 從大約lxlO"M到大約lxlO"M、從大約lxl(^M到大約lxl(T7M、從大 約5xlO-5M到大約5xlO"M以及從大約8xl(r5M到大約2xlO-6M。
類似物的選擇也取決于樣品中要確定和/或定量的被分析物的結(jié)構(gòu)。在 某些實施方案中，類似物包括被分析物的結(jié)構(gòu)或為具有被分析物分子結(jié)構(gòu) 的化合物?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將類似物結(jié)合到底物。 例如，類似物可以為結(jié)合到接頭的被分析物，并且接頭結(jié)合到多核苷酸底 物。但是，類似物與多核苷酸底物的結(jié)合可以使用接頭，也可以不使用接 頭，這取決于各實施方案。
多核苷酸底物的選擇應(yīng)當(dāng)對應(yīng)于所選擇的期望的多核苷酸反應(yīng)，該期 望的多核苷酸反應(yīng)可以是例如聚合反應(yīng)、裂解反應(yīng)、聚合和裂解的循環(huán)或
10重組反應(yīng)。在某些實施方案中，多核苷酸底物包括多核芬酸引物、多核苷 酸模板或者它們的組合。
在某些實施方案中，多核苷酸底物為單鏈或雙鏈的。在某些實施方案
中，多核苷酸底物為雙鏈DNA或單鏈DNA。在某些實施方案中，多核苷 酸底物可以包括RNA。在某些實施方案中，多核苦酸可以包括至少10個 核苷酸的序列。在某些實施方案中，多核香酸底物包括至少20個核苦酸、 至少30個核苷酸、至少50個核苷酸、至少75個核苦酸、至少100個核 苷酸或至少200個核苷酸的序列。事實上，在某些實施方案中，多核苷酸 底物可以更長，具有至少500個核普酸，甚至1000個核苦酸或更長的長 度。在某些實施方案中，多核苷酸底物可以包括起始區(qū)域、啟動子區(qū)域或 者它們的組合。起始區(qū)域可以包括聚合反應(yīng)起始的核苷酸序列，可以在單 鏈或雙鏈多核苦酸上。啟動子區(qū)域可以指雙鏈起始區(qū)域，并且在某些實施 方案中，通過將寡核苷酸或引物退火到單鏈多核苷酸的起始區(qū)域而形成雙 鏈起始區(qū)域，其中寡核苷酸或引物是與起始區(qū)域互補的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如何形成用于本發(fā)明描述的聚合反應(yīng)、裂解反 應(yīng)或重組反應(yīng)的多核苷酸底物。在某些實施方案中，多核苷酸包括至少20 個核苦酸殘基，各殘基包括噪呤或嘧咬堿基、糖和磷酸酯，且通常通過磷 酸二酯鍵與其他殘基相連接。核苦酸應(yīng)具有包括本發(fā)明所述的起始區(qū)域的 核苷酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸可以為具有噬菌體啟動子的雙 鏈多核苷酸，該噬菌體啟動子如T7 RNA聚合酶啟動子或QB噬菌體啟動 子。在某些實施方案中，多核苷酸可以為含有啟動區(qū)域的單鏈多核苷酸。 功能性啟動子區(qū)域可以通過將短鏈寡核苷酸引物退火到啟動區(qū)域來形成 功能性啟動子。在某些實施方案中，多核苷酸可以包含多于一個啟動子的 序列。
在某些實施方案中，類似物通過接頭連接到多核苷酸。選擇的接頭實 質(zhì)上不會影響期望的聚合、裂解或重組反應(yīng)，當(dāng)然其不應(yīng)實質(zhì)上影響結(jié)合 化合物結(jié)合到類似物的能力。在某些實施方案中，可以使用生物素和/或抗 生物素蛋白作為接頭。
本發(fā)明提出的教導(dǎo)為技術(shù)人員提供了 一種檢測各種分析溶液中任何 一種中被分析物的含量的新方法，所述分析溶液如生物或非生物的流體樣 品。在某些實施方案中，分析為免疫分析，在某些實施方案中，樣品為血 清樣品。樣品可以為體液，例如血液、血清、血漿、脊髓液、精液、唾液、積液、分泌物、膿液、羊水、尿液、糞便、獲自濃縮的肺呼出物或分泌物 的流體、細胞組織等。在某些實施方案中，流體樣品可以為培養(yǎng)基、藥理 學(xué)試劑樣品、食物樣品、乳制品、水樣品等。在某些實施方案中，樣品可 以為工業(yè)流體才羊品。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供的教導(dǎo)可以用于檢測目前通過異相系 統(tǒng)檢測的被分析物，包括免疫原性被分析物，如抗體，或非免疫原性被分
析物，如糖蛋白。以T-細胞受體為例，如CD4可以用作抗fflV抗體的結(jié) 合化合物?；蛘咦鳛榱硪粋€例子，識別糖蛋白上的多糖的凝集素可以用作 糖蛋白的結(jié)合化合物。
本發(fā)明提供的教導(dǎo)可用于測定樣品中維生素D3的濃度。維生素D3 是一種前激素，長期以來已知其在調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣和磷水平，以及骨骼礦化中 的重要作用。在維生素D3快速擴展的研究領(lǐng)域中，臨床應(yīng)用很大程度上 不得不受到所使用的方法的限制，同樣地，技術(shù)人員希望具有使用本發(fā)明 教導(dǎo)的方法來檢測維生素D3水平的能力。在某些實施方案中，被分析物 可以為維生素D3;類似物可以包括維生素D3或其書f生物，并且可以與多 核苷酸相結(jié)合以形成分析試劑；以及可以使用抗-維生素D3抗體作為結(jié)合 化合物?？梢赃x擇KlenowDNA聚合酶用于酶反應(yīng)。當(dāng)抗-維生素D3抗體 結(jié)合到試劑時會阻礙Klenow酶活性。樣品中游離的維生素D3通過竟?fàn)幮?結(jié)合到抗-維生素D3抗體使Klenow酶活性恢復(fù)，Klenow酶活性恢復(fù)的量 可以確定樣品中維生素D3的含量。
藥物濫用是當(dāng)今社會的重要問題，因此，本領(lǐng)域人員期望改進的簡單、 準(zhǔn)確且并t確測定藥物水平的方法。然而，目前該領(lǐng)域內(nèi)仍然Y吏用異相分析， 該領(lǐng)域?qū)谋景l(fā)明所教導(dǎo)的方法中受益。本發(fā)明提供的教導(dǎo)可以用于檢測 例如可卡因。在某些實施方案中，被分析物可以為可卡因；類似物可以包 括可卡因或其衍生物，并且可以與多核苦酸相結(jié)合以形成分析試劑；并且 抗-可卡因抗體可以用作結(jié)合化合物?？梢赃x擇Klenow DNA聚合酶用于 酶反應(yīng)。樣品中的可卡因?qū)⒕範(fàn)幮越Y(jié)合到抗-可卡因抗體。恢復(fù)Klenow酶 的活性對應(yīng)于樣品中可卡因的濃度。當(dāng)抗-可卡因抗體結(jié)合到試劑時，會阻 礙Klenow酶活性。樣品中的游離可卡因通過竟?fàn)幮越Y(jié)合到抗-可卡因抗體 而恢復(fù)Klenow酶活性，Klenow酶活性恢復(fù)的量可以確定樣品中的可卡因 的含量。
使用本發(fā)明提供的方法，還可以容易地測定具有較大分子體積的被分析物。以鈉尿肽(BNP)和鈉尿肽原(proBNP)為例，它們可用于評估心 力衰竭、左心室功能不全和急性冠狀動力永綜合征。proBNP是心臟疾病的 重要心臟標(biāo)記物，技術(shù)人員期望有一種易于使用、準(zhǔn)確且精確的檢測 proBNP的方法。在某些實施方案中，被分析物為proBNP,抗-proBNP單 克隆抗體可以用作結(jié)合化合物。而且類似物可以包含proBNP的抗原決定 簇一可以被抗-proBNP抗體識別的肽，可以與多核普酸結(jié)合形成試劑?？?以選擇Klenow DNA聚合酶用于酶反應(yīng)。當(dāng)抗-proBNP抗體結(jié)合到試劑時， 會阻礙Klenow酶活性。樣品中的游離proBNP也包括該抗原決定蔟，將 通過竟?fàn)幮越Y(jié)合到抗-proBNP抗體來恢復(fù)Klenow酶活性，Klenow酶活性 恢復(fù)的量將確定樣品中的proBNP的含量。
工業(yè)樣品還可以包含目標(biāo)被分析物，同樣地，本發(fā)明教導(dǎo)的方法可適 用于工業(yè)樣品。例如在環(huán)境研究中，還可以用本發(fā)明檢測污染土壤樣品中 的風(fēng)化油(weathered oil )。溶劑可萃取物質(zhì)(SEM)可以用于免疫動物并 在動物中形成抗體，以致于形成抗-SEM抗體。在某些實施方案中，被分 析物為SEM,類似物可以包括SEM并可以與多核苦酸相結(jié)合以形成試劑。 可以選擇Klenow DNA聚合酶用于酶反應(yīng)。當(dāng)抗-SEM抗體與試劑相結(jié)合 時，會阻礙Klenow酶活性。樣品中的游離SEM將通過竟?fàn)幮越Y(jié)合到抗 -SEM抗體而恢復(fù)Klenow酶活性，Klenow酶活性恢復(fù)的量將確定樣品中 的SEM的含量。
生物素(維生素H或B7)是與抗生物素蛋白結(jié)合的小分子， 一種具 有高親和力的四聚體蛋白。同樣地，生物素常用作與抗生物素蛋白相結(jié)合 的標(biāo)記化合物。在某些實施方案中，各種被分析物中的任何一種都可以用 生物素標(biāo)記，使用本發(fā)明教導(dǎo)的方法來定量4企測。可以選擇生物素標(biāo)記的 化合物作為被分析物，類似物可以包括生物素并可以與多核苷酸相結(jié)合以 形成試劑。抗生物素蛋白可以用作結(jié)合化合物，可以選擇Klenow DNA聚 合酶用于酶反應(yīng)。當(dāng)抗生物素蛋白結(jié)合到試劑時，會阻礙Klenow酶活性。 樣品中游離的生物素-標(biāo)記的被分析物將通過竟?fàn)幮越Y(jié)合到抗生物素蛋白 而使Klenow酶活性恢復(fù)，Klenow酶活性恢復(fù)的量將確定樣品中的被分析 物的含量。
在選擇并構(gòu)建了用于特定用途的成分后，可以選擇成分的相對量來優(yōu) 化該方法的應(yīng)用。優(yōu)化該方法的應(yīng)用包括針對分析溶液中特定濃度的被分 析物，確定結(jié)合化合物與試劑的期望比率。該步驟包括提供預(yù)先選定的期
13望量的酶來催化期望的反應(yīng)。通過確定期望的反應(yīng)的動力學(xué)來選擇期望的
酶的期望用量和類型。酶的例子包括但不限于聚合酶，如DNA聚合酶和 RNA聚合酶；核酸酶，如核酸外切酶；轉(zhuǎn)移酶，如RecA, RadA， Rad51等， 其中酶可以利用寡核香酸作為底物。
建立結(jié)合化合物的系列濃度來確定結(jié)合化合物與試劑的期望比率?；?于預(yù)期的待測被分析物的濃度范圍來選擇結(jié)合化合物的濃度范圍。每種檢 測樣品分別基于每種結(jié)合化合物的濃度，包括固定量的酶和固定量的試 劑。在某些實施方案中，例如，試劑的固定量可以是與被分析物的預(yù)期量 等摩爾的試劑的量。在某些實施方案中，所使用的試劑的量可能取決于試 劑如何充分地與被分析物竟?fàn)幮越Y(jié)合結(jié)合化合物。
一旦針對預(yù)期的被分析物的濃度范圍確定了結(jié)合化合物與試劑的期 望比率，就可以將結(jié)合化合物與試劑的期望比率固定，繪制被分析物-濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測定期望的多核苷酸反應(yīng)中期望的酶的活性。被分析物-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線可以基于具有在預(yù)期范圍內(nèi)的一 系列被分析物濃度的一 系 列溶液、固定量的期望的酶、具有期望比率的固定量的結(jié)合化合物與試劑。 被分析物-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于確定分析溶液中被分析物的含量。
繪制出被分析物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線后，配制含有待測被分析物和一定量結(jié) 合化合物的分析溶液。然后向分析溶液中加入一定量的試劑，使結(jié)合化合 物與試劑達到期望的比率。再將預(yù)先選定量的期望的酶加到分析溶液中催 化期望的多核苷酸反應(yīng)。然后在期望的多核苷酸反應(yīng)過程中測定期望的酶 的活性，使用被分析物-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線確定分析溶液中被分析物的含量。
在某些實施方案中，本發(fā)明的內(nèi)容涉及用于竟?fàn)幮越Y(jié)合分析的試劑。 該試劑可以包括與類似物結(jié)合的多核苷酸底物，可以選擇類似物(i)與分 析溶液中預(yù)先選定的結(jié)合化合物相結(jié)合；以及(ii)與分析溶液中被分析 物與預(yù)先選定的結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)??？梢赃x擇多核苷酸底物參與期 望的多核苷酸反應(yīng)，該反應(yīng)通過在分析溶液中結(jié)合化合物與類似物相結(jié)合
而#:抑制或終止。
在某些實施方案中，本發(fā)明的內(nèi)容涉及用于測定分析溶液中被分析物 的含量的竟?fàn)幮越Y(jié)合分析試劑盒。試劑盒包含上述的試劑，以及用于竟?fàn)?性結(jié)合分析的結(jié)合化合物，其中分析溶液中試劑與結(jié)合化合物的結(jié)合，與 分析溶液中被分析物與結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)?。該試劑盒還包括用于催 化期望的多核苷酸反應(yīng)的酶，其中測定酶的活性可以確定分析溶液中浮皮分
14析物的含量。 實施例1
在聚合酶反應(yīng)中利用抗-被分析物抗體干擾聚合
該實施例i兌明抗4皮分析物抗體如何被用作結(jié)合分子，以劑量依賴性的
方式有意干擾聚合酶反應(yīng)中的聚合。選擇的結(jié)合分子與類似物結(jié)合，該類
似物結(jié)合到DNA模板、引物或二者，并且結(jié)合分子與類似物的結(jié)合干擾 聚合酶反應(yīng)。
選擇用于聚合酶反應(yīng)的DNA模板。所選擇的DNA模板是下列的51 mer單鏈寡核香酸
ATGTCTC國3， ( SEQ ID NO:7 )
還可選擇用于該反應(yīng)的引物序列。該引物序列是下列的寡核苷酸 5'-GAGACAUGG畫3， ( SEQ ID NO:4 )
類似物與本實施例中的引物相結(jié)合。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 把尿嘧啶(U)結(jié)合到類似物。所選擇的類似物為地高辛(Dig ) ( Chevalier J.at.al. 1907)。而且如上所述，進行Dig與引物的結(jié)合來構(gòu)建具有用于結(jié) 合分子的結(jié)合4立點的試劑。選擇抗-Dig抗體Fab片|更(Roche Diagnostics, 德國)作為本實施例的結(jié)合分子。
制備50(xL反應(yīng)混合物，其中包含10 mM Tris-HCl ( pH 7.9 )、 50 mM NaCl、 10mMMgCl2、各種dNTP 2.5 nmol、 17nM模板/引物寡核苷酸以及 按1:200稀釋的PICOGREEN (Invitrogen, San Diego )。將Fab片段以系列 濃度加到反應(yīng)混合物中，該系列濃度包括濃度為5 nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160 nM和320 nM。將反應(yīng)混合物在室溫下孵育5分鐘， 再力口入1單位DNA聚合酶Klenow (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)以啟動聚合酶反應(yīng)。再孵育5分鐘后，通過產(chǎn)生的熒光來檢測DNA 聚合酶反應(yīng)生成的雙鏈DNA。使用480nm激發(fā)波長在520nm波長處檢測 熒光信號(Wittwer, C.T., et. Al 1997a )。
抗-Dig抗體以劑量依賴性方式明顯抑制了 DNA聚合酶鏈反應(yīng)。在雙 鏈DNA的形成過程中，累積了聚合酶反應(yīng)的副產(chǎn)物一焦磷酸(PPi)。根 據(jù)以下原理，通過4企測所生成PPi的量來確定反應(yīng)的程度
15,"nn. An。ATP硫酸化酵 一
(1) PPi + APS - ATP
(2) ATP+螢火蟲熒光素 狄絲> AMP + PPi+氧化熒光素+光
酶一無才幾焦磷酸酶催化PPi轉(zhuǎn)化為兩個當(dāng)量的Pi，可以用于放大檢測 并提高檢測的靈敏度，因為一分子PPi分解為兩分子Pi。裂解的無機磷酸 鹽(Pi)與2-氨基-6-巰基-7-甲基噤呤核糖核苷(MESG)反應(yīng)，由噤呤核 苷磷酸化酶(PNP)經(jīng)酶催化形成核糖1 -磷酸鹽和2-氨基-6-巰基-7-甲基 。票呤。MESG的酶轉(zhuǎn)化導(dǎo)致最大吸光率的移位，其中最大吸光率從底物的 330nm移到產(chǎn)物的360nm。該分析能夠檢測到小到lmL反應(yīng)混合物中的1 nMPPi，可以在6.5到8.5的pH值范圍內(nèi)操作。
所釋》丈的無機磷酸鹽(Pi)還可以按以下方法4企測
a 蔗糖磷酸化酶 a a
(1) Pi+蔗糖歸稚兩一 0^-葡萄糖-1^+果糖
(2) a-D-葡萄糖小Pi葡萄糖磷鼓位酶,a_D_,_6_Pi
(3 ) a-D-葡萄糖-6-Pi+NAD(P)葡萄糖_6^脫氣酵>0_葡萄糖酸-5一內(nèi)
酉旨-6-Pi十NAD(P)H
其中，在340nm處監(jiān)測生成的NAD(P)H。
實施例2
在聚合酶反應(yīng)中利用抗-被分析物抗體干擾聚合來檢測樣品中被分析 物的濃度
除非另外指明，本實施例使用實施例1教導(dǎo)的條件和材料。實施例1 描述了在聚合酶反應(yīng)中，抗-被分析物抗體如何干擾聚合以及如何以劑量依 賴的方式干擾聚合。本實施例說明在被分析物存在下，如何使用干擾來檢 測樣品中^皮分析物的濃度。
制備50pL的反應(yīng)混合物，其中包含10 mM Tris-HCl ( pH 7.9 )、 50 mM NaCl、 10 mM MgCl2、每種dNTP 2.5 nmol、按1:200稀釋的PICOGREEN (Invitrogen, San Diego)以及抗-Dig抗體Fab片#殳(Roche Diagnostics, Germany) 33nM。選擇被分析物以測試竟?fàn)幮越Y(jié)合被分析物的檢測技術(shù)。選擇Dig作為被分析物，并且向反應(yīng)混合物中加入具有不同Dig被分析物 濃度的樣品來與Dig類似物竟?fàn)幮越Y(jié)合抗體。本實施例中所使用的Dig最 大濃度為1600nM。
如上所述，Dig被分析物的類似物也是Dig，其中該Dig結(jié)合到引物 的尿嘧啶核苷，以實現(xiàn)與Dig被分析物竟?fàn)幮越Y(jié)合抗體結(jié)合分子的目的。 濃度為17nM的模板/引物寡核苷酸，與1單位DNA聚合酶Klenow相結(jié) 合來啟動聚合酶反應(yīng)。
圖5說明了根據(jù)某些實施方案，利用聚合酶反應(yīng)干擾的竟?fàn)幮越Y(jié)合分 析。如圖5所示，DNA聚合酶活性隨著被分析物Dig濃度的增加而增強， 相應(yīng)的PICOGREEN熒光也是如此。因此，該結(jié)果表明如何通過竟?fàn)幮越Y(jié) 合分析來檢測被分析物的濃度，本實施例中的被分析物為Dig,所述竟?fàn)?性結(jié)合分析包括聚合酶反應(yīng)干擾和恢復(fù)技術(shù)。
實施例3
在核酸外切酶反應(yīng)中利用抗-被分析物抗體干擾裂解 實施例1和實施例2描述了如何通過利用抗-:帔分析物抗體干擾聚合反 應(yīng)來使用竟?fàn)幮越Y(jié)合分析測定被分析物的濃度。本實施例使用抗-被分析物 抗體干擾核酸外切酶裂解反應(yīng)來測定樣品中被分析物的含量。
核酸外切酶反應(yīng)中被裂解的底物是下列雙鏈DNA ( dsDNA)片段 正義鏈序列為
ATGTCTCTCTGAC-3， ( SEQ ID NO:5 )
用Dig在序列的3，端標(biāo)記作為被分析物的類似物，其中該類似物與被分析
物竟?fàn)幮越Y(jié)合結(jié)合分子。
反義鏈序列為
5'國GTCAGAGAGACATGGTGGTGTTGTGGTTGGTGTGTGTTGGTTGTG TGTGGTGTTGGT-3， ( SEQ ID NO:l )
制備90)iL的反應(yīng)混合物，其中包含67 mM甘氨酸-KCl (pH 9.4)、 2.5 mM MgCl2、 50ug/mL BSA、 10 nM結(jié)合dsDNA的Dig以及按1:200稀 釋的PICOGREEN( Invitrogen, San Diego )。將抗-Dig抗體Fab片段(Roche Diagnostics,德國)按照系列濃度加到反應(yīng)混合物中，系列濃度包括濃度為 5nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160nM和320nM。將反應(yīng)混合物在室溫下孵育5分鐘，再加入2.5單位入-核酸外切酶 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)來啟動裂解反應(yīng)，選擇性地 從5'端水解dsDNA,形成ssDNA ( Tolun, G.和Myers, R. S. 2003 )。再孵 育5分鐘后，通過4全測熒光來檢測核酸外切酶活性，其中降解的dsDNA 顯示出熒光逐漸消失。當(dāng)結(jié)合分子一抗-Dig抗體Fab片段存在時，熒光信 號仍然很強，表明抗-Dig抗體干擾入-核酸外切酶的活性并且以劑量依賴 性方式干擾入-核酸外切酶的活性。
實施例4
在核酸外切酶反應(yīng)中利用抗-被分析物抗體干擾裂解來測定樣品中被 分析物的濃度
除非另外指明，本實施例使用實施例3教導(dǎo)的條件和材料。實施例3 顯示了在核酸外切酶反應(yīng)中，抗-被分析物抗體如何千擾dsDNA的裂解， 以及如何以劑量依賴性方式干擾dsDNA的裂解。該實施例說明了在纟皮分 析物存在時，如何使用干擾來測定樣品中被分析物的濃度。
在本實施例中，上述的抗-Dig抗體首先與Dig被分析物混合，使得被 分析物阻礙抗體的程度對應(yīng)于被分析物的濃度，使試劑與核酸外切酶自由 反應(yīng)達到試劑不再結(jié)合抗體的程度。在這種情況下，試劑為結(jié)合到Dig類 似物的dsDNA。固定抗體的濃度，以不同的濃度加入被分析物。本實施例 中所使用的Dig的最大濃度為960 nM。
隨著被分析物濃度降低，通過核酸外切酶反應(yīng)裂解的游離試劑的量也 降低。使用PICOGREEN的熒光檢測測量的是核酸外切酶活性的變化，由 此確定被分析物的濃度。
圖6說明了根據(jù)某些實施方案，利用核酸外切酶反應(yīng)干擾的竟?fàn)幮越Y(jié) 合分析。如圖6所示，隨著被分析物Dig濃度的增加，核酸外切酶活性增 強，正如PICOGREEN熒光相應(yīng)的降低所表明的。如圖6所示，被分析物 的濃度，在本實施例中凈皮分析物為Dig,可以通過包括核酸外切酶反應(yīng)干 擾和恢復(fù)技術(shù)的竟?fàn)幮越Y(jié)合分析來測定。
備選地，核酸外切酶反應(yīng)活性以及由此確定的被分析物濃度，還可以 通過使用dNMP (入-核酸外切酶反應(yīng)的另一產(chǎn)物)脫氫酶偶聯(lián)NADH或 NADPH來監(jiān)測。
18循環(huán)進行聚合酶-核酸外切酶反應(yīng)干擾的組合來放大檢測信號，檢測樣 品中較低濃度的被分析物
以上實施例2和實施例4利用聚合酶反應(yīng)的聚合干擾過程或核酸外切 酶反應(yīng)的裂解干擾過程中檢測的信號來確定樣品中被分析物的濃度。本實 施例說明可以利用(i)聚合酶反應(yīng)中抗-被分析物抗體對聚合的干擾，以 及(ii)核酸外切酶反應(yīng)中抗-被分析物抗體對裂解的干擾的循環(huán)來明顯放 大檢測信號，甚至以更高的靈敏度來測定樣品中的被分析物的濃度。
同樣地，本實驗表明DNA聚合酶和A-核酸外切酶可以組合形成循環(huán) 分析，該分析明顯放大了用于測定樣品中被分析物的濃度的檢測信號，甚 至可以檢測出更低濃度的被分析物。除非另外指明，本實施例使用實施例 1教導(dǎo)的條件和材料。
向反應(yīng)混合物中同時加入1單位聚合酶和2.5單位入-核酸外切酶。由 DNA聚合酶合成的dsDNA入-核酸外切酶/人DNA纟莫板上降解并除去， 生成多個焦石克酸(PPi)、 dAMP、 dCMP、 dGMP和dTMP。多次;改大4企測 信號，分別通過PPi分析和單核苷酸分析來4企測釋放的PPi和dNMPs。
當(dāng)Dig被分析物不存在時，抗-Dig抗體抑制DNA聚合酶的活性。當(dāng) 加入Dig被分析物時，聚合酶和入-核酸外切酶的活性提高。因此，本實施 例說明使用PPi分析和單核苷酸分析所檢測到的信號與樣品中Dig被分析 物的含量成比例。
實施例6
在轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中利用抗4皮分析物抗體干"f尤重組
上述實施例2和實施例4描述了聚合或裂解反應(yīng)的干擾如何影響酶的 活性并生成用于檢測樣品中被分析物的信號。本實施例描述了在轉(zhuǎn)移酶反 應(yīng)中，如何使用抗-被分析物抗體對重組的干擾來檢測樣品中被分析物的濃 度。
選擇雙鏈探針和單鏈靶點用于重組反應(yīng)。雙鏈DNA探針序列具有以 下結(jié)構(gòu)
5'FAM國AAACTAATAAGATTTACA-ACAATTTCTC-3， ( SEQ ID NO:3 );和 3'-DABYL畫TTTGATTATTCT-AAATGTTGTTAAAGAG-5， ( SEQ ID NO:2 )
單鏈耙點具有與5，F(xiàn)AM寡核香酸相同的序列。
195，-AAACTAATAAGATTTACAACAATTTCTC-3， ( SEQ ID NO:6 ),但 是該ssDNA為與類似物結(jié)合的多核苷酸，用以提供與結(jié)合分子相結(jié)合的 位點，干擾重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。在本實施例中，T"與Dig分子相結(jié) 合。
制備60pL反應(yīng)混合物，其中包含70mM Tris-HCl ( pH 7.6 )、 12 mM MgCl2、 0.3mMATP， ( ATP再生系統(tǒng)還需要3mM磷酸烯醇式丙酮酸鹽和 30U/ml丙酮酸激酶)，4.5 uM (以核苷酸的形式)靼單鏈Dig-DNA, 3uM RecA (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA )。將抗-Dig抗體Fab片#爻 (Roche Diagnostics,德國)按照系列濃度加到反應(yīng)混合物中，系列濃度包 括濃度為5nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160nM和320nM。
在37。C下孵育反應(yīng)混合物3分鐘，使抗體與類似物相結(jié)合，所述類似 物與單鏈靶點相結(jié)合。隨后將4.5 uM (在核香酸中)的雙鏈探針DNA加 到反應(yīng)混合物中。
于37'C下再賻育3分鐘后，在RecA DNA轉(zhuǎn)移酶催化下，通過雙鏈' DNA中FAM-標(biāo)記的5，-序列與不含F(xiàn)AM的5，-耙單鏈DNA耙序列的交換 產(chǎn)生熒光信號。使用4卯nm激發(fā)波長在520nm波長處監(jiān)測焚光信號。當(dāng) 結(jié)合分子一抗-Dig抗體Fab片段存在時，熒光信號降低，表明抗-Dig抗體 干擾轉(zhuǎn)移酶RecA的活性，并且以劑量依賴性的方式干擾轉(zhuǎn)移酶RecA的 活性。
實施例7
在轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中利用抗-被分析物抗體對重組的干擾來檢測樣品中被 分析物的濃度
除非另外指明，本實施例使用實施例6中教導(dǎo)的條件和材料。實施例 6描述了在轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中，抗-被分析物抗體如何干擾dsDNA探針和ssDNA 靶序列之間的重組反應(yīng)，以及如何以劑量依賴性方式干擾dsDNA探針和 ssDNA靼序列之間的重組反應(yīng)。本實施例描述了在被分析物存在時，如何 利用干擾來檢測樣品中被分析物的濃度。
選擇Dig作為被分析物，將含有不同濃度的Dig被分析物的樣品加到 反應(yīng)混合物中，與Dig類似物竟?fàn)幮越Y(jié)合抗體。本實施例中所使用的Dig 最大濃度為650nM。
上述的抗-Dig抗體首先與Dig被分析物混合，使被分析物對抗體的阻礙程度與被分析物濃度相對應(yīng)，使試劑與轉(zhuǎn)移酶自由反應(yīng)達到試劑不與抗
體結(jié)合的程度。這種情況下，試劑為結(jié)合到Dig類似物的ssDNA。固定抗 體的濃度，隨著被分析物濃度的降低，用于RecA轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)重組的游離 試劑的量也降低，檢測520 nm的熒光測定轉(zhuǎn)移酶活性的變化，由此確定 被分析物的濃度。
圖7說明了根據(jù)某些實施方案，利用轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)干擾的竟?fàn)幮越Y(jié)合分 析。如圖7所示，轉(zhuǎn)移酶活性隨著被分析物Dig濃度的增加而增強，相應(yīng) 的520 nm處的焚光也是如此。因此，-故分析物的濃度，在本施實施例中 被分析物為Dig，可以通過竟?fàn)幮越Y(jié)合分析來測定，在本實施例中，包括 RecA轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)干擾和恢復(fù)技術(shù)。
實施例8
在聚合酶反應(yīng)中利用抗-被分析物抗體干擾聚合一檢測結(jié)果是產(chǎn)物收 率而非熒光或吸光率
除非另外指明，本實施例使用實施例1使用的條件和材料。實施例1 至7表明可以檢測聚合酶活性、核酸外切酶活性或轉(zhuǎn)移酶活性并用來確定 樣品中被分析物的含量。在實施例中，使用的與被分析物濃度相關(guān)的測量 值包括PICOGREEN焚光和UV吸光率。還可以使用實時定量PCR來提 高檢測的靈壽文度和精密度。
基于新合成的DNA鏈設(shè)計PCR引物。它們僅檢測新合成的DNA。 在本實施例中，酶的活性與用Dig類似物標(biāo)記的游離底物或抗-Dig抗體的 濃度相關(guān)。制備25pL的反應(yīng)混合物，其中包含10mMTris-HCl(pH7.9)、 50 mM NaCl、 10 mM MgCl2、 1 mM DTT、各種dNTP2.5nmo1、 1單位Klenow DNA聚合酶、1.25單位Taq DNA聚合酶、0.1 nM DNA模板/Dig結(jié)合引物 混合物以及各種PCR引物200 nM。提供各種濃度的抗體Fab片段(Roche Diagnostics,德國),最大濃度為666nM,最小濃度約10nM。
圖8說明了根據(jù)某些實施方案，如何使用實時PCR測定抗-Dig抗體 對聚合酶反應(yīng)的干擾。如圖8所示，正如使用實時PCR檢測所確定的，聚 合酶活性隨著結(jié)合化合物(抗-DigFab片段，[AB])的濃度的增加而降低。 實時PCR測定了所形成的相關(guān)的聚合產(chǎn)物，其中100°/。相關(guān)的產(chǎn)物應(yīng)對應(yīng) 于反應(yīng)混合物中無抗體。相關(guān)聚合產(chǎn)物的減少對應(yīng)于所加入的抗體或結(jié)合 化合物的量增加。應(yīng)注意到實時PCR提供了非常靈敏的檢測，同樣地，僅
21使用0.1 nM的多核苷酸底物。在此濃度時，10nM的抗體影響很小。因 此，實時PCR是另 一種可以用于檢測上述教導(dǎo)的任意一種酶活性的檢測方 法，在確定樣品中被分析物的含量時具有更高的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性。 僅使用常規(guī)實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到或能夠確認，本發(fā)明描述 的特定實施方案有許多等同方式。技術(shù)人員可以在超出特定實施方案的范 圍內(nèi)實踐本發(fā)明教導(dǎo)的概念。這樣的等同方式將包括在以下的權(quán)利要求書 中。此外，還有許多本發(fā)明教導(dǎo)和要求的列表和群組。技術(shù)人員將認識到 每種這樣的列表和群組包含不同的種類，并且可以通過移除或添加一個或 多個種類來修飾，因為每個本發(fā)明教導(dǎo)和要求的列表和群組可以不適用本 發(fā)明實施的每個可行的實施方案。序列表
<110>博爾誠(北京)科技有限公司
<120> 利用酶活性的竟?fàn)幮愿蓴_和恢復(fù)檢測被分析物
<130> DIC08110170
<150> US12/004,281 <151> 2007-12-20
<160> 7
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于"i兌明的示例序列 <400> 1
gtcagagaga catggtggtg ttgtggttgg tgtgtgttgg ttgtgtgtgg tgttgg %
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于"i兌明的示例序列<formula>formula see original document page 24</formula><400> 5
3ccaacacca cacacaacc3 acacacacc3 accacaacac cacc3tgtct ctctg3c 57
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于說明的示例序列
< > 6
aaactaataa gatttacaac aatttctc 28
<210> 7
<211〉 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>用于"^兌明的示例序列<400> 7
accaac3cc8 ca^caacca acacacacca accac肌cac caccatgtct c 51
2權(quán)利要求
1、一種測定溶液中被分析物濃度的方法，其中該方法包括選擇結(jié)合化合物；選擇被分析物的類似物，并使類似物與多核苷酸底物結(jié)合，構(gòu)成利用期望的多核苷酸反應(yīng)測定分析溶液中被分析物的含量的試劑；以及其中分析溶液中試劑與結(jié)合化合物的結(jié)合，與分析溶液中被分析物與結(jié)合化合物的結(jié)合相競爭；選擇期望的酶用于催化期望的多核苷酸反應(yīng)；針對分析溶液中特定被分析物的濃度和預(yù)先選定的期望的酶的量，確定結(jié)合化合物與試劑的期望比率；形成包含一定量結(jié)合化合物和含量待測的被分析物的分析溶液；將一定量的試劑加到分析溶液中，其中試劑的量和結(jié)合化合物的量達到期望的結(jié)合化合物與試劑的比率；將預(yù)先選定量的期望的酶加到分析溶液中，催化期望的多核苷酸反應(yīng)；以及檢測期望的多核苷酸反應(yīng)中期望的酶的活性來確定分析溶液中被分析物的含量。
2、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述結(jié)合化合物包括配體結(jié)合分子。
3、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述結(jié)合化合物包括抗體。
4、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述結(jié)合化合物包括細胞受體。
5、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述類似物包含被分析物的結(jié)構(gòu)。
6、 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述類似物為具有被分析物分子結(jié) 構(gòu)的化合物。
7、 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸底物包括多核苷酸引 物、多核苦酸模板或它們的組合。
8、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述多核苷酸底物為雙鏈DNA。
9、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述多核苷酸底物為單鏈DNA。
10、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括核苷 酸聚合反應(yīng)。
11、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括核苷 酸裂解反應(yīng)。
12、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述期望的多核香酸反應(yīng)包括核香 酸聚合反應(yīng)和核香酸裂解反應(yīng)的組合。
13、 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括核苷 酸重組反應(yīng)。
14、 一種用于竟?fàn)幮越Y(jié)合分析的試劑，其中該試劑包括 與類似物結(jié)合的多核苷酸底物，其中選擇的類似物(i)與分析溶液中預(yù)先選定的結(jié)合化合物相結(jié)合；并且(ii)與分析溶液中被分析物與預(yù)先 選定的結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)?；而且其中選擇的多核苦酸底物參與期望的多核芬酸反應(yīng)，該多核苷酸反應(yīng)
15、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述多核苷酸底物包括多核苷酸 引物、多核苦酸^^板或它們的組合。
16、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述多核苷酸底物為雙鏈DNA。
17、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述多核苷酸底物為單鏈DNA。
18、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述結(jié)合化合物包括配體結(jié)合分子。
19、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述結(jié)合化合物包括抗體。
20、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述結(jié)合化合物包括細胞受體。
21、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述類似物包含被分析物的結(jié)構(gòu)。
22、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述類似物為具有被分析物分子 結(jié)構(gòu)的化合物。
23、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括核 普酸聚合反應(yīng)。
24、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括核 苦酸裂解反應(yīng)。
25、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)為核苷 酸聚合反應(yīng)和核苷酸裂解反應(yīng)的組合。
26、 權(quán)利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括核 香酸重組反應(yīng)。
27、 一種用于測定分析溶液中被分析物含量的竟?fàn)幮越Y(jié)合分析試劑 盒，該試劑盒包括權(quán)利要求14所述的試劑；用于竟?fàn)幮越Y(jié)合分析的結(jié)合化合物，其中分析溶液中試劑與結(jié)合化合物的結(jié)合，與分析溶液中被分析物與結(jié)合化合物的結(jié)合相竟?fàn)帲灰约坝糜诖呋谕亩嗪塑账岱磻?yīng)的酶，其中測定酶活性來確定分析溶液 中被分析物的含量。
28、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑包括多核苷酸引物、 多核苷酸模板或它們的組合。
29、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑為雙鏈DNA。
30、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑為單鏈DNA。
31、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑包括具有被分析物結(jié) 構(gòu)的類似物。
32、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑包括具有被分析物分 子結(jié)構(gòu)的類似物。
33、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述結(jié)合化合物包括抗體。
34、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述結(jié)合化合物包括配體結(jié)合 分子。
35、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述結(jié)合化合物包括細胞受體。
36、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括 核苷酸聚合反應(yīng)。
37、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括 核苷酸裂解反應(yīng)。
38、 權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng)包括 核苷酸聚合反應(yīng)和核苷酸裂解反應(yīng)的組合。
39、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應(yīng) 包括核苷酸重組反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶活性的競爭性干擾和恢復(fù)檢測被分析物。本發(fā)明的內(nèi)容主要公開了一種測定溶液中被分析物濃度的方法。該方法包括選擇結(jié)合化合物；選擇被分析物的類似物并將類似物與多核苷酸底物結(jié)合構(gòu)成試劑，利用期望的多核苷酸反應(yīng)來測定分析溶液中被分析物的含量，該期望的多核苷酸反應(yīng)包括聚合反應(yīng)、裂解反應(yīng)或重組反應(yīng)。分析溶液中試劑與結(jié)合化合物的結(jié)合，與分析溶液中被分析物與結(jié)合化合物的結(jié)合相競爭。該方法還包括選擇用于催化期望的多核苷酸反應(yīng)的期望的酶。還提供了試劑和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101463388SQ20081018823
公開日2009年6月24日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者夏東元 申請人:博爾誠(北京)科技有限公司