一種生物素酶酶活性的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶活性的檢測方法，具體涉及一種生物素酶酶活性的檢測方法， 屬于生物醫(yī)藥檢測領域。
【背景技術】
[0002] 生物素（Biotin)又稱為維生素B7、維生素H、輔酶R，是一種水溶性的含硫維生 素。生物素是體內(nèi)4種羧化酶的輔酶，包括糖代謝中的關鍵酶丙酮酸羧化酶、催化脂肪酸 合成第一步反應的乙酰輔酶A羧化酶、在蛋白質代謝中起重要作用的丙酰輔酶A羧化酶和 β-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶。生物素的缺乏將導致上述酶活性缺失，引起體內(nèi)糖、脂及蛋 白質三大營養(yǎng)物質代謝異常，出現(xiàn)線粒體能量合成障礙，引起代謝性酸中毒、有機酸尿癥及 一系列神經(jīng)與皮膚系統(tǒng)損害，嚴重時致死。另外，生物素還是組蛋白的重要修飾成分，參與 基因表達與DNA修復等過程。
[0003] 生物素酶是一種糖蛋白，廣泛存在于血清、白細胞、成纖維細胞及肝臟等組織中。 生物素酶的主要功能是水解食物中及機體代謝產(chǎn)生的生物胞素和生物素-肽，產(chǎn)生游離的 生物素。雖然生物素在食物中廣泛存在，但絕大部分是以蛋白結合態(tài)存在，因此，生物素酶 缺陷將導致機體既無法從食物中攝取生物素又無法再生機體代謝產(chǎn)生的生物素，最終使機 體缺乏生物素，引起體內(nèi)糖、脂及蛋白質代謝異常，即出現(xiàn)生物素酶缺乏癥（Biotinidase deficiency，BD)，也稱遲發(fā)型多羧化酶缺乏癥。
[0004] 生物素酶缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳疾病，發(fā)病年齡一般在1周至10歲，平 均年齡3. 5個月，但也有幾年后仍無明顯癥狀的。生物素酶缺乏癥臨床表現(xiàn)復雜，涉及神經(jīng) 系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)，出現(xiàn)發(fā)育滯后、視力及聽力下降等，患者間癥狀差異較大；生化 異常包括代謝性酸中毒、有機酸尿癥及高氨血癥等，嚴重時出現(xiàn)昏迷甚至死亡。根據(jù)血漿殘 余生物素酶活性大小，可將生物素酶缺乏癥分成兩種類型，即嚴重缺乏型（酶活性〈10%正 常人平均值）和部分缺乏型（酶活性處于正常人平均值的10%~30% )。據(jù)1991年的統(tǒng) 計，生物素酶缺乏癥的全球發(fā)病率約為1/60, 000,但不同地區(qū)間發(fā)病率差異很大，例如希臘 高達1/4, 508、土耳其為1/11，000、歐洲10個國家的整體發(fā)病率為1/47, 486。在我國尚無 發(fā)病率統(tǒng)計，僅有約20例臨床病例報道，根據(jù)病例分布推測，本病在我國的發(fā)病率可能存 在南北差異?？诜坞x生物素可以改善或阻止生物素酶缺乏癥的臨床癥狀，療效顯著且無 毒副作用。若能及時確診患者，并終生補充生物素進行預防治療，患者將正常生長發(fā)育而不 受任何影響，但若診斷較晚，出現(xiàn)發(fā)育滯后、視力及聽力等器質性損傷時，這些癥狀將無法 恢復。因此，早期確診并進行預防治療，是防治生物素酶缺乏癥的關鍵。
[0005] 由于生物素酶缺乏癥臨床表現(xiàn)復雜多樣，且與許多其它疾病在臨床表現(xiàn)上有很多 相似之處（如皮疹等），容易被誤診；另外，部分缺乏型患者往往只在受壓（如感染等）情 況下才表現(xiàn)出癥狀，因此不易發(fā)現(xiàn)，但他們始終存在發(fā)病風險。若未得到正確及時的診治， 致病及致死率均較高。因此，建立生物素酶缺乏癥的診斷方法，對患者做出早期診斷，對改 善生物素酶缺乏癥患者生存質量、提高我國人口出生素質具有重要意義。
[0006] 生物素酶缺乏癥可從3個方面進行分析診斷，即生物素酶酶活性分析、體內(nèi)代謝 物水平分析及基因分析，但后兩者只能作為生物素酶缺乏癥診斷的輔助或確證手段。因為 基于代謝物水平很難將生物素酶缺乏癥與其它疾病進行區(qū)分（如全羧化酶合成酶缺乏癥 等），而且代謝物水平常受到發(fā)病狀態(tài)、飲食及用藥等影響，因此基于代謝物水平分析的串 聯(lián)質譜技術等方法只能作為生物素酶缺乏癥輔助診斷措施。對于基因水平的分析，由于存 在單核苷酸多態(tài)性等原因，常常給基因分析帶來不確定性；另一方面，基因的表達翻譯及功 能的實現(xiàn)往往需要一些其它分子或蛋白的參與或修飾，有很多這類機制目前還未完全被揭 示，因此基因分析也不能作為診斷的可靠依據(jù)，只適用于對生物素酶缺乏癥的確證及分型。 而酶活性水平分析則基本不存在上述問題，不僅特異性高，而且不受發(fā)病狀態(tài)等影響，因 此，對生物素酶缺乏癥的診斷主要是基于生物素酶的酶活性分析，是生物素酶缺乏癥診斷 的金標準。
[0007] 目前，國際上采用的生物素酶活性分析方法多以人工底物類似物N-生物素-P-氨 基苯甲酸為反應底物，通過檢測其酶促水解產(chǎn)物P-氨基苯甲酸的衍生物的吸光值來檢測 酶活性，此方法較經(jīng)濟，但磺胺類藥物會使檢測結果出現(xiàn)假陰性。另外一種可用于生物素酶 活性篩查的反應底物為生物素-6-氨基喹啉，同樣是一種人工底物類似物，通過檢測其酶 促水解產(chǎn)物氨基喹啉的熒光值來檢測酶活性，該方法成本較高，且可因較高的白蛋白濃度 及使用某些抗生素而出現(xiàn)假陽性，另外，高甘油三酯濃度會使結果出現(xiàn)假陰性。其它方法還 有以熒光及放射性標記的生物素衍生物等為底物的，但均存在費用較高、操作更復雜、更費 時等問題。值得注意的是，上述方法中均是以人工底物類似物作為反應底物，Ebrahim等研 究發(fā)現(xiàn)，以天然底物生物胞素為反應底物時，酶活性較人工底物高30±5%。因此，以生物胞 素為底物時，檢測方法具有更高的檢測靈敏度及更寬的檢測限，且更能反映樣本中生物素 酶活性的真實水平。
[0008] 但是，Ebrahim等建立的方法只能用于血清樣本的檢測，樣本用量大，酶活性穩(wěn)定 時間短，且檢測前還必須對樣本進行透析處理，操作復雜。以上的不足導致該方法無法應用 于新生兒篩查，但如前所述，生物素酶缺乏癥必需得到及時的診治，否則將出現(xiàn)不可逆的損 傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種生物素酶（Biotinidase，EC3. 5. 1. 12)酶活性的檢測 方法，本發(fā)明的檢測方法，是以生物胞素為底物，因此具有較高的檢測靈敏度及更寬的檢測 限；并且不需要對樣本進行任何形式的前期處理，可直接用于酶活性檢測，方便快捷；可在 半自動或全自動的熒光光度計或酶標儀等熒光檢測設備上使用本發(fā)明試劑盒，比較方便。
[0010] 本發(fā)明提供的酶活性的檢測方法，包括如下步驟：
[0011] 1)將樣本加入至試劑1和試劑2中進行反應；反應結束后加入試劑3進行終止反 應；將所述反應后的體系進行離心分離，向得到的上清液中加入試劑4進行中和至pH值為 7~11 ;向所述中和后的體系中加入試劑5進行衍生反應；檢測所述衍生反應后的體系在 激發(fā)波長300~500nm和發(fā)射波長400~600nm下的焚光值；
[0012] 2)將樣本加入至所述試劑1中進行反應；反應結束加入所述試劑2后，立即加入 所述試劑3進行終止反應；將所述反應后的體系進行離心分離，向得到的上清液中加入所 述試劑4進行中和至pH值為7~11 ;向所述中和后的體系中加入所述試劑5進行衍生反 應；檢測所述衍生反應后的體系在激發(fā)波長300~500nm和發(fā)射波長400~600nm下的熒 光值，作為空白對照的熒光值；
[0013] 所述反應與步驟1)中所述反應的條件相同；
[0014] 所述終止反應與步驟1)中所述終止反應的條件相同；
[0015] 所述衍生反應與步驟1)中所述衍生反應的條件相同；
[0016] 3)將至少8種不同濃度的賴氨酸分別與所述試劑5進行所述衍生反應，并檢測所 述衍生反應后的體系在激發(fā)波長300~500nm和發(fā)射波長400~600nm下的熒光值；以賴 氨酸的濃度為橫坐標，以熒光值為縱坐標，制作標準曲線；
[0017] 所述衍生反應與步驟1)中所述衍生反應的條件相同；
[0018] 4)根據(jù)步驟1)中所檢測的熒光值與步驟2)中作為空白對照的熒光值的差值和所 述標準曲線，即得到步驟1)中進行所述衍生反應的賴氨酸的濃度，進而得到所述樣本中生 物素酶的酶活性；
[0019] 所述酶活性的單位定義為：以每L樣本每小時水解所述生物胞素生成的賴氨酸的 微摩爾數(shù)，表示為ymol/L/h;
[0020] 所述試劑1為由緩沖液1和酶活穩(wěn)定劑組成的緩沖體系，所述試劑1的pH值為 3 ~11 ;
[0021 ] 所述試劑2為生物胞素；
[0022] 所述試劑3為終止液；
[0023] 所述試劑4為中和液；
[0024] 所述試劑5為由緩沖液2和衍生底物組成的體系，所述衍生底物為1，2-二乙酰 苯、茚三酮、熒光胺和鄰苯二醛中任一種。
[0025] 上述的檢測方法中，所述試劑1中，所述緩沖液1的摩爾濃度可為50~500mmol/ L，所述酶活穩(wěn)定劑的摩爾濃度可為1~50mmol/L;
[0026] 所述試劑2中，所述生物胞素的摩爾濃度可為0. 05~2mmol/L;
[0027] 所述試劑3中，所述終止液的質量百分含量可為30%~70% ;
[0028] 所述試劑4中，所述中和液的摩爾濃度可為0. 2~2mol/L;
[0029] 所述試劑5中，所述緩沖液2的摩爾濃度可為50~500mmol/L，所述衍生底物的質 量百分含量可為0. 05%~5%。
[0030] 上述的檢測方法中，所述試劑1中，所述緩沖液1的摩爾濃度可為200mmol/L，所述 酶活穩(wěn)定劑的摩爾濃度可為10mm〇l/L;
[0031] 所述試劑1的pH值為5. 5 ;
[0032] 所述試劑2中，所述生物胞素