專利名稱：輔酶nad及其組合物在細(xì)胞保護(hù)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開輔酶NAD及其組合物在細(xì)胞保護(hù)藥物中的應(yīng)用，輔酶NAD及其組合物可用于骨髓的保護(hù)，放化療的保護(hù)，提高放化療治療強(qiáng)度，改善患者生存質(zhì)量，提高免疫功能，用于促進(jìn)潰瘍愈合以及防治肝纖維化。
腫瘤患者的造血機(jī)制和造血環(huán)境存在著缺陷和紊亂，因此，大部分患者存在著不同程度的貧血，而化療又能加重貧血。我們既往研究表明，作為輔酶NAD能夠促進(jìn)人體內(nèi)紅細(xì)胞的生成，與化療同時(shí)應(yīng)用可改善貧血狀態(tài)，保證化療順利進(jìn)行，提高生存質(zhì)量。包括腫瘤在內(nèi)的任何影響造血環(huán)境及血細(xì)胞生成因子的疾病都可以造成血細(xì)胞減少，紅細(xì)胞減少則造成貧血。腫瘤本身及與腫瘤相關(guān)的并發(fā)癥都可以直接或間接地導(dǎo)致貧血。細(xì)胞毒性化療藥物對(duì)紅細(xì)胞生成過程有許多負(fù)面影響，主要包括多能干細(xì)胞壞死、紅細(xì)胞前體細(xì)胞壞死、紅細(xì)胞前體細(xì)胞細(xì)胞周期的阻滯和延遲、EPO的水平下降或功能減退、成熟紅細(xì)胞的氧化、骨髓發(fā)育不良及化療藥物相關(guān)性水鈉潴留等。在化療藥物中，環(huán)磷酰胺、馬法蘭及其它烷化劑等非細(xì)胞周期特異性藥物的使用與貧血的關(guān)系最為明顯，特別是當(dāng)大劑量長期使用這些藥物時(shí)可以導(dǎo)致多能干細(xì)胞的進(jìn)行性損耗，烷化劑及VP16和VCR等的長期使用還可以導(dǎo)致骨髓發(fā)育不良?；熕幬锏纳鲜鲎饔媒?jīng)常導(dǎo)致骨髓修復(fù)障礙，進(jìn)而出現(xiàn)長期貧血。化療藥物可以通過抑制多能干細(xì)胞及紅細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖造成貧血，某些化療藥物通過氧化效應(yīng)導(dǎo)致多能造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞前體細(xì)胞及成熟紅細(xì)胞的氧化壞死，PDD、MMC等化療藥物可以造成腎臟損傷或微血管內(nèi)凝血導(dǎo)致貧血?；熕幬镞€可以導(dǎo)致體內(nèi)EPO生成減少或破壞EPO功能。目前所知，抗癌藥物、放射線和化學(xué)戰(zhàn)劑對(duì)腎臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)和粘膜上皮等均有毒性。這些毒性限制抗癌藥物和放療的治療強(qiáng)度，明顯地影響生存質(zhì)量及威脅生命。改善治療的方法包括提高惡性細(xì)胞的對(duì)化療的敏感性或降低化療藥物對(duì)正常組織的毒性，發(fā)展保護(hù)正常組織(不保護(hù)惡性細(xì)胞)免受損傷的藥物。由于抗腫瘤藥物對(duì)靶細(xì)胞的非特異性，正常組織細(xì)胞亦受到殺傷，因此如何避免化療中正常細(xì)胞受損傷和明確參與修復(fù)DNA損傷的機(jī)制具有重要的臨床治療意義。近年來國內(nèi)外研究表明輻射、生物和化學(xué)毒素等均能引起細(xì)胞DNA損傷，誘導(dǎo)人正常細(xì)胞發(fā)生凋亡，造成機(jī)體正常生理功能紊亂和破壞。許多現(xiàn)代戰(zhàn)傷的病理機(jī)制涉及異常的細(xì)胞凋亡/死亡過程，其誘發(fā)的缺血、缺氧、中毒及氧化應(yīng)激等可導(dǎo)致心、腦、肝等多種組織細(xì)胞的凋亡和壞死，并繼而引起多種并發(fā)癥的發(fā)生，基于上述凋亡線粒體機(jī)制的揭示，人們正從新的角度探尋有效控制細(xì)胞凋亡/死亡的戰(zhàn)略，如Ca2+螯合劑，自由基清除劑及環(huán)孢素A等能夠阻抑線粒體滲透性轉(zhuǎn)換抑制細(xì)胞死亡。國外對(duì)于急性放射病的預(yù)防，主要采用化學(xué)藥物、中草藥、生物制劑等基抗放用作用機(jī)制也互不相同，例如保護(hù)靶細(xì)胞分子的巰基，清除自由基，穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)等，雖體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型的研究已發(fā)現(xiàn)為數(shù)頗多的有效輻射防護(hù)劑，但由于藥物毒性等原因很少用于人體。NAD是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶，在啟動(dòng)生物體氧化還原反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜糖蛋白受體表達(dá)起重要作用。目前國內(nèi)外尚未見輔酶NAD用于抗細(xì)胞損傷的研究報(bào)道。
70年代初人們發(fā)現(xiàn)，用抗腫瘤藥物處理的腫瘤細(xì)胞去免疫動(dòng)物，能使其獲得特異性的抗腫瘤免疫。絲裂霉素C(MMC)是目前臨床上常用的一種抗腫瘤藥物，而NAD是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶，不僅能直接作用于腫瘤細(xì)胞核中的DNA，起抑制或殺傷腫瘤的作用，而且能提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其的殺傷活性，但對(duì)后者所涉及的分子基礎(chǔ)目前尚不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道，HSP70蛋白可攜帶多種抗原多肽，起到抗原提呈分子的作用。而多種刺激因素，包括化療藥物，能誘導(dǎo)和改變腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)及胞膜HSP70蛋白的合成及分布。因此，NAD藥物單獨(dú)或聯(lián)合熱休克處理的H22細(xì)胞，其胞膜HSP70蛋白表達(dá)的變化以及藥物處理后的H22細(xì)胞免疫C57BL/6小鼠抗腫瘤的保護(hù)效應(yīng)，為進(jìn)一步闡明抗腫瘤藥物，尤其是NAD處理腫瘤細(xì)胞后提高免疫原性的機(jī)理及新型瘤苗的研制提供理論依據(jù)。
消化性潰瘍易復(fù)發(fā)，難防止。因此，消化性胃潰瘍的治療關(guān)鍵就在于防止復(fù)發(fā)。大鼠乙酸胃潰瘍具有反復(fù)再發(fā)的特點(diǎn)，且與人的胃潰瘍?cè)谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)上十分相似。選用此模型，用NAD治療30d，探討NAD的近期療效和停藥后的遠(yuǎn)期效果以及與胃粘膜表面凝膠的厚度和潰瘍邊緣胃粘膜細(xì)胞增殖的關(guān)系。約有5％～10％的人胃粘膜反復(fù)發(fā)生潰瘍。對(duì)抗消化性潰瘍藥物的評(píng)價(jià)既要重視近期療效，又要重視防止復(fù)發(fā)的遠(yuǎn)期效果。大鼠乙酸胃潰瘍具有反復(fù)再發(fā)的特點(diǎn)，且與人的胃潰瘍?cè)谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)上十分相似。1969年Takagi復(fù)制出大鼠乙酸胃潰瘍模型，其自然愈合過程是潰瘍制成后的d1～d30潰瘍急速愈合而UI迅速降低，此時(shí)為潰瘍的急性期；d31后潰瘍愈合逐漸緩慢而潰瘍UI緩慢降低，至d80 UI最低，此時(shí)為緩慢愈合期；d81后潰瘍UI逐漸升高，d120～d140后UI升高明顯，此時(shí)復(fù)發(fā)率也最高，而后又逐漸降低，到d160又達(dá)到最低水平。d81～d160為復(fù)發(fā)期。NAD具有顯著的抗大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的作用，并在臨床上取得了明顯的療效，但對(duì)潰瘍的復(fù)發(fā)尚未進(jìn)行深入的研究，作者選用大鼠乙酸胃潰瘍模型，用NAD治療30d，探討NAD治療急性期大鼠乙酸胃潰瘍的療效和停藥后防止復(fù)發(fā)的遠(yuǎn)期效果。結(jié)果表明NAD有促進(jìn)潰瘍愈合、防止?jié)儚?fù)發(fā)的作用，且優(yōu)于西咪替丁。NAD能促進(jìn)潰瘍邊緣胃粘膜細(xì)胞DNA的合成和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡，形成新生的胃粘膜細(xì)胞，使?jié)兊靡孕迯?fù)，同時(shí)促進(jìn)了胃粘膜細(xì)胞分泌粘液，加強(qiáng)了二道屏障防御有害因子的作用。
肝纖維化是由于肝細(xì)胞損傷，肝臟細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)尤其是膠原的合成增加，降解減少或二者兼有所造成的。迄今尚無特效的抗肝纖維化藥物。NAD在細(xì)胞質(zhì)中有抗氧化作用，清除脂質(zhì)過氧自由基和羥自由基，使細(xì)胞免受自由基的破壞，從而保護(hù)細(xì)胞膜并預(yù)防細(xì)胞的壞死和突變。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)NAD對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的防治作用。NAD抗纖維化作用機(jī)制可能為①能清除脂質(zhì)氫過氧自由基和羥自由基，從而保護(hù)細(xì)胞膜功能及預(yù)防細(xì)胞的壞死和突變。NAD缺乏可導(dǎo)致肝組織中(GPX)活性降低，活化分子氧產(chǎn)生超氧離子(O)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而破壞肝細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝功能障礙，肝細(xì)胞破壞纖維組織形成。補(bǔ)NAD后(GPX)酶活性加強(qiáng)，對(duì)肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，從而預(yù)防和治療肝纖維化。②通過免疫系統(tǒng)(B-淋巴細(xì)胞，T-淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等)中的GPX，控制H2O2的釋放來調(diào)節(jié)殺傷作用和保護(hù)自身。NAD的抗大鼠肝纖維化作用與秋水仙堿相似，提示NAD是抗肝纖維化的有效藥物。
本發(fā)明的目的是提供可作為一種細(xì)胞損傷的保護(hù)劑，用于細(xì)胞損傷修復(fù)，調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)潰瘍愈合以及防治肝纖維化的有效藥物。
我們的研究表明NAD能預(yù)防正常組織細(xì)胞免受化學(xué)和輻射損傷，細(xì)胞DNA損傷與凋亡產(chǎn)生相關(guān)。該酶能阻斷凋亡分子Caspase-3和Caspase-8表達(dá)，阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿，抑制凋亡時(shí)線粒體膜電位下降和游離鈣離子升高，降低ROS釋放。輔酶NAD能促進(jìn)正常細(xì)胞增殖生長，并能通過上調(diào)bcl-2基因表達(dá)和下調(diào)p53基因表達(dá)抑制凋亡。NAD通過影響凋亡相關(guān)基因c-myc、c-erbB-2、c-fos、fas和cyclin的表達(dá)保護(hù)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)機(jī)制。正常組織細(xì)胞NAD濃度明顯高于腫瘤組織，可以達(dá)到利用正常組織和腫瘤組織之間NAD濃度的差別，可以達(dá)到正常組織細(xì)胞免受放化療損傷而又不影響放化療最佳療效的目的。該輔酶能保護(hù)骨髓三系造血干細(xì)胞，可與造血克隆刺激因子聯(lián)合應(yīng)用，即能刺激造血又能保護(hù)造血干細(xì)胞免受放化療毒性損傷，是骨髓的保護(hù)因子。該酶可作為化學(xué)和輻射損傷的保護(hù)劑，提高放化療治療強(qiáng)度，改善患者生存質(zhì)量。NAD是一種良好的免疫增強(qiáng)劑，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫。NAD有增強(qiáng)胃粘液和黏膜屏障，降低幽門螺桿菌感染發(fā)生率，促進(jìn)潰瘍愈合作用。NAD有抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜并預(yù)防細(xì)胞的壞死和突變以及能防治肝纖維化。其特征為溶于生理鹽水的有效濃度是80～2000ug/ml，在賦形劑中有效比例是40～95％。輔酶NAD及其組合物，其特征為溶于生理鹽水中的最佳濃度是300～550ug/ml，在賦形劑中的最佳比例是30～40％。輔酶NAD及其組合物，其特征為最佳作用時(shí)間是出現(xiàn)細(xì)胞損傷前10至32小時(shí)足量給予。輔酶NAD及其組合物可用于骨髓的保護(hù)，放化療的保護(hù)，提高放化療治療強(qiáng)度，改善患者生存質(zhì)量，提高免疫功能，用于促進(jìn)潰瘍愈合以及防治肝纖維化。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明從基因和蛋白分子水平闡明了NAD的抗凋亡調(diào)控機(jī)制，為細(xì)胞凋亡的逆轉(zhuǎn)和細(xì)胞DNA損傷修復(fù)提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.發(fā)現(xiàn)一種保護(hù)正常組織細(xì)胞免受化學(xué)物理等因素?fù)p傷的獨(dú)特輔酶NAD。3.發(fā)現(xiàn)NAD具有參與調(diào)節(jié)免疫功能，提高機(jī)體抗自由基和抗衰老的能力。4.輔酶NAD及其組合物可用于促進(jìn)潰瘍愈合，改善肝功能，防治肝纖維化的功能。
以下所述的實(shí)例詳細(xì)說明了本發(fā)明實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料人正常細(xì)胞株L02肝細(xì)胞株、SL-7腎細(xì)胞株和MEF肺泡內(nèi)皮細(xì)胞株均在本室置37℃、5％CO2飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中細(xì)胞加入含10％滅活胎牛血清、1.2％谷氨酰胺、1％青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。主要試劑NAD、順鉑、阿霉素、魚藤酮、PARP多抗、細(xì)胞色素C單抗、抗細(xì)胞周期蛋白A單抗6E6、抗細(xì)胞周期蛋白B1單抗V152、抗細(xì)胞周期蛋白D1單抗DCS-6、抗p53蛋白單抗D0-7、抗c-myc蛋白單抗C-33、抗bcl-2蛋白單抗124、熒光染色探針(PI、Rhodamin 123、Fluo-3-AM、Snalf-Calcein-1、H2DCF、Hoechest 33342)、Tunel凋亡檢測試劑盒、RT-PCR反應(yīng)試劑。實(shí)驗(yàn)方法1.MTT比色法檢測1.1 NAD對(duì)PC12細(xì)胞增殖活性的影響PC12細(xì)胞傳代接種于96孔板，密度為1.5-4.5×103/孔，加入含濃度為10-500μg/ml NAD的培養(yǎng)液培養(yǎng)48-72小時(shí)后檢測。1.2 順鉑對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用PC12細(xì)胞傳代接種于96孔板，加入含濃度為0.01、0.1、1.0mg/ml順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后檢測。1.3 NAD預(yù)防順鉑對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用PC12細(xì)胞分別加入含濃度500μg/ml NAD和不含NAD的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后，在加入含濃度為0.01、0.1、1mM順鉑的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)后檢測。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞傳代后分兩組，一組加入含0.3mg/ml順鉑培養(yǎng)液，另一組加入不含順鉑培養(yǎng)液，培養(yǎng)12小時(shí)后，含順鉑組細(xì)胞以5×106/ml重新接種，分別加入含500μg/ml NAD和不含NAD培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，胰酶消化，0.5％多聚甲醛固定，0.1％Triton-100增加細(xì)胞膜通透性，細(xì)胞以2.5×105/300μl分管，洗滌，離心，棄上清，各管分別加入抗細(xì)胞周期蛋白A單抗6E6，抗細(xì)胞周期蛋白B1單抗V152，抗細(xì)胞周期蛋白D1單抗DCS-6，抗p53蛋白單抗D0-7，抗c-myc蛋白單抗C-33，抗bcl-2蛋白單抗124，抗c-erbB-2蛋白單抗NCL-CB11，抗c-fos蛋白單抗UB-06341，混勻，37℃孵育1小時(shí)，洗滌離心，各管加入50μl標(biāo)記FITC的抗鼠二抗或抗兔二抗，37℃孵育30分鐘，洗滌離心，振蕩懸于PBS液，流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12存活和凋亡細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。4.碘化丙啶(PI)染色收集不同因素處理的106個(gè)PC12細(xì)胞，離心后PBS液洗滌，加入冰冷的70％乙醇固定，PBS液洗滌，加入PI熒光染液(50μg/mlPI，10μg/ml RNA酶)4℃避光孵育30分鐘，流式細(xì)胞儀分析DNA熒光強(qiáng)度，細(xì)胞凋亡時(shí)直方圖出現(xiàn)亞二倍體峰。5.透射電鏡觀察按上述條件培養(yǎng)處理的PC12細(xì)胞，用細(xì)胞刮從培養(yǎng)瓶刮下，瓊脂預(yù)包埋法制樣，2.5％戊二醛前固定，1％鋨酸后固定，按常規(guī)漂洗、脫水、滲透和環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈉和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察攝片。
結(jié)果NAD組中PC12細(xì)胞增殖活性上升，NAD組細(xì)胞凋亡率較順鉑組明顯下降，順鉑組出現(xiàn)明顯明顯凋亡形態(tài)改變，凋亡時(shí)細(xì)胞主要阻滯在G1期伴細(xì)胞周期蛋白D1高表達(dá)，p53、bcl-2、c-erbB-2、c-myc、細(xì)胞周期蛋白A、B1表達(dá)分別下降32.2％、42.1％、29.3％、46.2％、45.9％、74.8％；后再予NAD處理48小時(shí)，bcl-2和細(xì)胞周期蛋白B1表達(dá)明顯上升，與對(duì)照組比較，NAD處理組p53蛋白表達(dá)下降31.2％，NADH組中c-myc、c-erbB-2蛋白表達(dá)下降，c-fos蛋白表達(dá)上升。NAD不但促進(jìn)細(xì)胞增殖，而且通過bcl-2蛋白上調(diào)和細(xì)胞周期蛋白D1、c-fos和下調(diào)p53解救順鉑誘導(dǎo)的凋亡損傷。實(shí)施例21.Tunel和Hoechest 33342雙染檢測細(xì)胞凋亡
4％多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，PBS液洗滌后，加入0.1％Tritox-100和0.1％檸檬酸鈉通透，PBS′液再洗滌，加入含有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和熒光標(biāo)記液的Tunel反應(yīng)液避光孵育，洗滌后再加入Hoechest 33342孵育，PBS液洗滌后在熒光顯微鏡下觀察分析。2.激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞胞漿鈣離子、pH、ROS和線粒體膜電位改變培養(yǎng)細(xì)胞以104個(gè)接種petri培養(yǎng)皿中央蓋玻片，待細(xì)胞貼壁后，PBS緩沖液漂洗，各皿分別加入熒光染料Rhodamin 123、Fluo-3-AM、Snalf-Calcein-1、H2DCF在激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞胞漿鈣離子、pH、ROS和線粒體膜電位改變。3.Caspase-3和Caspase-8檢測細(xì)胞離心后加入冰冷的裂解液冰育10分鐘，取上清加入2×反應(yīng)液DEVD-pNA和IETD-pNA后37℃水浴1小時(shí)，置紫外分光光度計(jì)405nm檢測。4.Western Blot檢測凋亡前后PARP和細(xì)胞色素C表達(dá)變化培養(yǎng)細(xì)胞加入蛋白處理提取液，將樣品超聲粉碎后，65℃水浴15分鐘，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至NC膜，用1％封閉液封閉，分別各加入PARP多抗(1∶1000)和細(xì)胞色素C單抗(1∶200)孵育，TBST緩沖液洗滌，加入二抗孵育，TBST緩沖液洗滌，行AP底物顯色反應(yīng)。5.RT-PCR檢測凋亡前后P53、Bcl-2、Fas和β-actin表達(dá)變化培養(yǎng)細(xì)胞加入Tripure提取試劑和氯仿，12000g離心15分鐘，取無色上清，加入異丙醇，12000g離心10分鐘，取RNA沉淀，75％酒精洗滌后，真空干燥，加入DEPC水；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RNA 5μl OligdT 1μl DEPC水6.5μl 5×RT buffer 4μl 10×dNTP 2μl Rnasin0.5μl M-Mlv 1μl，置37℃孵育1小時(shí)；PCR反應(yīng)cDNA 5μl10×dNTP 5μl 10×buffer 5μl Tag酶2U各引物2μlDEPC水32μl，將反應(yīng)管置PCR儀93℃變性45秒53℃退火45秒72℃延伸45秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸300秒，各取8μl PCR產(chǎn)物上樣后1.5％瓊脂糖凝膠電泳。
結(jié)果在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌漫均勻熒光，出現(xiàn)凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒狀熒光。低劑量放療和化療處理組細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子、pH、ROS明顯升高，線粒體膜電位明顯下降，而NAD保護(hù)組未見胞漿內(nèi)鈣離子、pH、ROS升高，線粒體膜電位無明顯變化。低劑量放療和化療處理組凋亡早期出現(xiàn)Caspase-3和Caspase-8上升，而NAD能阻斷凋亡分子Caspase-3和Caspase-8表達(dá)，阻止PARP分子斷裂成為活性分子和細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿。輔酶NAD能通過上調(diào)bcl-2基因表達(dá)和下調(diào)p53基因表達(dá)抑制凋亡。實(shí)施例360例貧血的腫瘤患者隨機(jī)分為非化療組(NOCTX)、不含順鉑的化療組(CTX-NOPLAT)及含順鉑的化療組(CTX-PLAT)。將以上3組患者又隨機(jī)分為NAD治療組和安慰劑治療組。NOCTX組NAD的用量為10mg/日，每日3次，連用8周；CTX組NAD的用量為10mg/日，每日3次，連用8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組NAD治療者的紅細(xì)胞比容(Hct)和血紅蛋白(Hb)值明顯高于安慰劑治療組(P＜0.01)，有效率分別為40.0％、56.1％和58.3％，而且CTX組接受NAD治療者的輸血依賴性明顯低于安慰劑治療者(P＜0.01)。的依賴性分別為26％和56％。
骨髓干細(xì)胞通過Ficoll及離心400×g 20分鐘分離，洗滌后用含20％自身血漿的TC199培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，后用500μg/ml NAD在37℃共同孵育10小時(shí)，再用不同濃度的化療藥孵育12小時(shí)，每個(gè)點(diǎn)接種3個(gè)直徑為35厘米的培養(yǎng)皿；PCM-CFU-GM(2×105MNCs/ml)即在含胎盤條件培養(yǎng)液的瓊脂中的CFU-GM，在培養(yǎng)10天后計(jì)數(shù)，長期培養(yǎng)的干細(xì)胞及計(jì)數(shù)根據(jù)Sutherland等建立的方法。在凋亡早期，當(dāng)細(xì)胞尚未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變時(shí)，伴隨DNA斷裂的積聚，細(xì)胞內(nèi)NAD含量急劇下降，NAD是許多細(xì)胞脫氫酶的輔酶，是細(xì)胞進(jìn)行一切生命活動(dòng)的重要還原能，其損耗是導(dǎo)致細(xì)胞走向死亡的致命因素。外源性補(bǔ)充NAD增加PC12細(xì)胞生長活性，并能抑制放療和順鉑引起的DNA細(xì)胞損傷，修復(fù)損傷細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞分化。正常組織細(xì)胞NAD濃度明顯高于腫瘤組織，可以達(dá)到利用正常組織和腫瘤組織之間NAD濃度的差別，可以達(dá)到正常組織細(xì)胞免受放化療損傷而又不影響放化療最佳療效的目的。不同劑量的順鉑和阿霉素對(duì)12例正常骨髓于細(xì)胞進(jìn)行體外處理，并測定其PCM-CFU-GM的LD95，發(fā)現(xiàn)在處理前經(jīng)過NAD孵育組LD95明顯增加，顯示NAD明確的保護(hù)效果。實(shí)施例4雄性SD大鼠36只，體重115±10克，隨機(jī)分為5組對(duì)照組，5Gy單次照射組，8Gy單次照射組，4Gy/次×2分次照射組，NAD保護(hù)組，每組8只。對(duì)照組動(dòng)物按常規(guī)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物置于20cm×20cm×6cm有機(jī)玻璃鼠盒內(nèi)。采用60COγ線全身照射，劑量率0.9Gy/min，照射時(shí)間安排在下午5時(shí)，2天完成，分次照射組在第1天和第2天照射，單次照射組在第2天照射。分別于TBI后第3天和第7天檢查各組動(dòng)物的外周血像，第7天查肝腎功能及將動(dòng)物脫頸臼處死后取其心、肺、肝，腎和胸椎骨髓作常規(guī)病理制片及病理組織學(xué)檢查。采用不同的全身照射劑量及分割照射方式，觀察大鼠的近期效應(yīng)，以選擇較佳NAD給藥方案。外周血白細(xì)胞數(shù)在照射后第3天即明顯下降(59.8％)，而NAD組僅下降15.3％；至第7天才明顯恢復(fù)，肝腎功能基本正常。本實(shí)驗(yàn)觀察到，隨著劑量的增加，對(duì)心、肺、肝和骨髓的損傷亦隨之增加。分次照射與單次照射比較，對(duì)肺的損傷較輕，而對(duì)骨髓的損傷則略重。從肺、肝，腎和胸椎骨髓作常規(guī)病理制片及病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)NAD組分次照射對(duì)肺的損傷較小，對(duì)骨髓的損傷明顯減輕。說明NAD具有很好的抗輻射損傷效應(yīng)。實(shí)施例5用免疫熒光法和流式細(xì)胞儀檢測不同因素處理的小鼠肝癌H22細(xì)胞膜HSP70蛋白表達(dá)的變化，并用處理后的H22細(xì)胞作為抗原進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組H22細(xì)胞胞膜HSP70蛋白的表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均較對(duì)照組細(xì)胞有顯著增加(P＜0.001)。表達(dá)率以NAD和絲裂霉素處理組細(xì)胞為最高，達(dá)95.1％，而熱休克能進(jìn)一步增加胞膜HSP70蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。用NAD處理的H22細(xì)胞免疫C57BL/6小鼠能誘導(dǎo)出特異性抗腫瘤免疫，該作用可部分被抗HSP70分子的單抗阻斷。腫瘤發(fā)生率在NAD誘導(dǎo)組、單抗阻斷組及陰性對(duì)照組小鼠中分別為27.3％(3/11)、50.0％(5/10)、100.0％(10/10)。攻擊后第28天小鼠平均瘤重分別為(0.17±0.33)g、(0.66±0.77)g和(1.11±0.58)
g。結(jié)論NAD處理的H22細(xì)胞具有較強(qiáng)免疫原性，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫，是一種良好的腫瘤疫苗。其抗腫瘤效應(yīng)是或部分是由表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜上的HSP70蛋白所介導(dǎo)。實(shí)施例6在大鼠乙酸胃潰瘍急性期用NAD治療，并與傳統(tǒng)的抗?jié)兯幬鬟涮娑∠鄬?duì)比，采用Kerss法測定胃粘膜表面凝膠厚度，應(yīng)用傳統(tǒng)的體外摻入氚-胸腺嘧啶(3H-TdR)于胃粘膜的放射性自顯影方法測定胃粘膜細(xì)胞的標(biāo)記率(LR)，同時(shí)觀測d5、d30、d126的潰瘍指數(shù)(UI)、潰瘍抑制率(IR)與凝膠的厚度、LR的關(guān)系。NAD組的UI低于西咪替丁組(42.3±3.9，3.6±1.2，4.4±2.3；49.1±3.6，5.9±1.4，9.2±1.3，P＜0.01)；西咪替丁組的低于對(duì)照組(61.0±3.8，8.9±2.5，12.4±2.4，P＜0.01)；NAD組的IR(％)高于西咪替丁組(31，59，65；19，33，26)；NAD組的凝膠厚度(μm)高于西咪替丁組(45±3，60±3，58±2；36±4，47±4，41±3，P＜0.01)，西咪替丁組的高于對(duì)照組(22±6，35±3，28±5，P＜0.01)；NAD組的LR(％)高于西咪替丁組(10.0±0.5，16.2±0.8，15.0±0.6；9.0±0.5，13.9±0.6，10.8±0.7，P＜0.01)、西咪替丁組的高于對(duì)照組(6.5±0.7，10.1±0.5，8.0±0.7，P＜0.01)；NAD組d30與d126的UI相比無顯著差異。結(jié)論NAD有促進(jìn)潰瘍愈合，防止再發(fā)的作用，機(jī)制是增強(qiáng)了胃粘液屏障和粘膜屏障的作用。實(shí)施例7材料和方法1.1 材料 純系Wistar大鼠雌雄各半，共80只，體重180g～220g，隨機(jī)分為4組A正常對(duì)照組；B病理模型對(duì)照組；C NAD預(yù)防治療組；在尾靜脈攻擊開始后4wk，NAD溶液灌胃；D秋水仙堿治療組；造模完成后給秋水仙堿灌胃。1.2 方法 ①免疫致敏階段(共45d)，于大鼠大腿內(nèi)側(cè)皮下注射人血白蛋白，4.0mg/只，共4次，第1次加福氏完全佐劑；第2次加福氏不完全佐劑；此階段結(jié)束時(shí)取血，測到抗體產(chǎn)生。②尾靜脈攻擊階段(共60d)；每周2次尾靜脈注射人血白蛋白，從2.5mg/只開始，每周增加0.5mg/只，直至4.0mg/只，然后維持不變，共注射16次。取材及標(biāo)本處理分別于尾靜脈攻擊結(jié)束時(shí)及停止攻擊后6wk，12wk共3次開腹取肝中葉組織150mg～200mg。光鏡標(biāo)本甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色，膠原，網(wǎng)狀和彈力纖維三聯(lián)染色后光鏡觀察。電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛，四氧化鋨固定后樹脂包埋，鈾—鉛雙染色后JEM120 OEt電鏡觀察。2 結(jié)果膠原纖維增生程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為6級(jí)。0級(jí)肝組織正常，無膠原纖維增生；I級(jí)少量膠原纖維從匯管區(qū)域或中央靜脈周圍輕度向外延伸；II級(jí)膠原纖維延伸明顯，但未包繞整個(gè)肝小葉；III級(jí)膠原纖維延伸，互相連接，包繞整個(gè)肝小葉；IV級(jí)膠原纖維包繞分割肝小葉，以致正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，但以大方形假小葉為主；V級(jí)肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，假小葉形成，大方形假小葉與小圓形假小葉各占50％；VI級(jí)肝內(nèi)布滿圓形假小葉，假小葉間有粗大增生的膠原纖維。結(jié)果 NAD防治組肝臟纖維化的程度(I級(jí)2只，II級(jí)3只，III級(jí)3只，IV級(jí)1只)明顯低于病理模型組(II級(jí)2只，III級(jí)3只，IV級(jí)5只，V級(jí)3只，P＜0.01)，NAD防治組肝臟超微結(jié)構(gòu)的變化也較輕微。NAD對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化有一定的預(yù)防和治療作用。
權(quán)利要求
1.輔酶NAD及其組合物在細(xì)胞保護(hù)藥物中的應(yīng)用特征在于(1)能保護(hù)造血干細(xì)胞，即能刺激造血又能保護(hù)造血干細(xì)胞免受放射和化療毒性損傷，是骨髓的保護(hù)因子。(2)能保護(hù)正常組織細(xì)胞免受化學(xué)和輻射損傷，利用正常組織和腫瘤組織之間NAD濃度的差別，可以達(dá)到正常組織細(xì)胞免受放化療損傷而又不影響放化療最佳療效的目的，用于腫瘤患者放化療毒性防治藥物。(3)NAD是一種良好的免疫增強(qiáng)劑，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫。(4)NAD有增強(qiáng)胃粘液和黏膜屏障，降低幽門螺桿菌感染發(fā)生率，促進(jìn)潰瘍愈合作用。(5)NAD有抗氧化和抗衰老作用，保護(hù)細(xì)胞膜并預(yù)防細(xì)胞的壞死和突變以及能防治肝纖維化。
2.按照權(quán)力要求1所述的輔酶NAD及其組合物，其特征為溶于生理鹽水的有效濃度是80～2000ug/ml，在賦形劑中有效比例是40～95％。
3.按照權(quán)力要求1所述的輔酶NAD及其組合物，其特征為溶于生理鹽水中的最佳濃度是300～550ug/ml，在賦形劑中的最佳比例是30～40％。
4.按照權(quán)力要求1所述的輔酶NAD及其組合物，其特征為最佳作用時(shí)間是出現(xiàn)細(xì)胞損傷前10至32小時(shí)足量給予。
5.按照權(quán)力要求1～4所述，輔酶NAD及其組合物可用于骨髓抑制的保護(hù)，放化療的保護(hù)及其輔助治療，改善患者生存質(zhì)量；用于免疫生物治療，用于潰瘍愈合以及防治肝纖維化。
全文摘要
本發(fā)明公開輔酶NAD及其組合物在細(xì)胞保護(hù)藥物中的應(yīng)用。NAD能夠促進(jìn)人體內(nèi)紅細(xì)胞的生成,與化療同時(shí)應(yīng)用可改善貧血狀態(tài)。該酶能預(yù)防正常組織細(xì)胞免受化學(xué)和輻射損傷以及凋亡產(chǎn)生。NAD處理的H22細(xì)胞具有較強(qiáng)免疫原性,能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫,是一種良好的腫瘤疫苗,其抗腫瘤效應(yīng)是由表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜上的HSP70蛋白所介導(dǎo)。NAD有增強(qiáng)胃粘液屏障,促進(jìn)潰瘍愈合作用。NAD有抗氧化和抗衰老,保護(hù)細(xì)胞膜并預(yù)防細(xì)胞的壞死和突變以及防治肝纖維化作用。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1264599SQ0011401
公開日2000年8月30日 申請(qǐng)日期2000年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月10日
發(fā)明者張積仁, 徐萌 申請(qǐng)人:第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院