專利名稱：用于檢測酶活性的一種新的二肽衍生物及鹽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的二肽衍生物及鹽，以這種二肽衍生物及鹽作為底物，可用于酶活性檢測。
背景技術(shù)：
為了闡明動物體內(nèi)酶活性與疾病的關(guān)系，國內(nèi)外做了大量的相關(guān)研究。有研究報(bào)道，酶活性與疾病存在顯著相關(guān)性，因此酶活性檢測可作為一種疾病監(jiān)測的輔助手段。例如，檢測亮氨酸氨基肽酶活性用于區(qū)分梗阻性黃疸和肝細(xì)胞性黃疸，谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活性檢測被廣泛應(yīng)用于肝病的診斷。相對于健康人群來說，許多疾病病的樣本都可導(dǎo)致這些酶活性偏高。因此，對于特定病的檢測，酶活性檢測，不具有很高的可信度，需結(jié)合其他臨床檢測數(shù)據(jù)，作出判斷。常規(guī)酶活性檢測方法中存在的底物穩(wěn)定性不好、重復(fù)性差、不易測定等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種新的二肽衍生物及鹽，可用于酶活性檢測，為疾病的輔助診斷提供了一種更可信、更安全、更簡單的診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到一種新的二肽衍生物及鹽，以這種二肽衍生物作為底物，用于檢測酶活性，更可信、更穩(wěn)定、更簡單。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
首先合成了含有X-L-脯氨酸-Y(X :氨基酸殘基。Y :對硝基苯胺，對苯基偶氮胺或4-苯偶氮-I-萘胺結(jié)構(gòu)的二肽衍生物及其鹽，檢測動物體內(nèi)是否存在一些酶能夠水解這些復(fù)合物。最后，我們找到一種單純酶名為χ-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶。這種酶可以把X-L-脯氨酸-Y水解為X-L-脯氨酸和Y_H(即對硝基苯胺，對苯基偶氮胺或4-苯偶氮-I-萘胺。)。各種動物(包括人)體內(nèi)都有這種酶，人血清中、唾液中以及唾液腺以及不同的結(jié)締組織，例如?；蛉搜浪?、牙毛囊、齒齦以及大鼠肉芽腫瘤中都含有這種酶。我們用這些二肽衍生物及鹽做底物，檢測了正常人血清中X-脯氨酰-二肽?；?氨基肽酶的活性，發(fā)現(xiàn)這種酶在正常人群中酶活性水平幾乎相同，但是在青年男性和青年女性中檢測結(jié)果存在顯著差異，在中老年女性與年輕女性中也存在顯著差異。同時(shí)有肝膽疾病(比如急性或慢性肝炎，肝硬化)的病人血清中該酶活性水平顯著升高，而有原發(fā)性高血壓以及惡性腫瘤，比如實(shí)體腫瘤(例如胃癌、胰腺癌、肺癌)以及白血病及惡性毒瘤患者該酶活性顯著降低。因此，我們證實(shí)，用這種新的二肽衍生物及鹽作為底物，檢測X-脯氨酰-二肽?；?氨基肽酶活性可以作為一種非常有效的疾病輔助診斷方法，尤其對于一些惡性腫瘤的診斷。此外，我們證實(shí)目前這種新的二肽衍生物及鹽是安全的復(fù)合物，無致癌性，同時(shí)這種復(fù)合物，滿足底物要求的各種條件，例如易測定(通過酶水解底物)、穩(wěn)定、底物量和酶含量及底物水解量和孵育時(shí)間成線性關(guān)系。二肽衍生物(X-L-脯氨酸-Y) N-端的氨基酸殘基(X)，包括任意的氨基酸殘基，因?yàn)樵撁钢饕饔糜诘诙€(gè)氨基酸殘基(L-脯氨酸)，而不是針對于N-端的氨基酸殘基(X)。N-端的氨基酸殘基常從含有15個(gè)以上碳原子的氨基酸選取。例如，中性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。堿性氨基酸，如賴氨酸、精氨酸。如果這些氨基酸含有不對稱C原子，將會出現(xiàn)不同的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，有L型，D型，DL型空間構(gòu)象，通常情況下為L型氨基酸。此外，這些二肽衍生物 作為底物，不但可以以游離形式存在，而且可以酸鹽形式存在，而這種形式不會抑制酶活性。例如對甲苯磺酸、鹽酸、氫溴酸。因?yàn)辂}的穩(wěn)定性更好，用鹽做底物是更好的選擇。在X-L-脯氨酸-Y中，Y部分，應(yīng)從含有對硝基苯胺，對苯基偶氮胺或4-苯偶氮-I-萘胺的氨基酸殘基中選擇。在這幾種氨基酸殘基中，含對硝基苯胺的殘基是更好的選擇，因?yàn)檫@種殘基與二肽在水中具有相同的溶解度，更穩(wěn)定，更易合成。針對X-L-脯氨酸-Y的酶活性取決于N-端氨基酸殘基(X)差異。X為中性或堿性氨基酸殘基時(shí)，二肽衍生物最容易被酶水解，相比來說酸性氨基酸不易水解。因此，二肽衍生物X部分為中性或堿性氨基酸殘基或酸鹽比如對甲苯磺酸鹽，更適合作為底物，而堿性氨基酸易潮解。另一方面，二肽衍生物X為甘氨酸殘基，在pH8. 7的環(huán)境下，具有最高的水解率。X-L-脯氨酸-Y衍生物，在避光條件下較穩(wěn)定，且水溶性較好。此外，甘氨酸及其酸鹽比如鹽酸、對甲苯磺酸，相比一些堿性氨基酸來說，不易潮解，更易于實(shí)驗(yàn)操作。綜上所述，X-L-脯氨酸-Y中，X為甘氨酸或其鹽，特別是對甲苯磺酸鹽時(shí)，是最佳的底物組合選擇。新型二肽都有X-L-脯氨酸-Y這樣的結(jié)構(gòu)，可很容易地采用肽化學(xué)中熟知的方法進(jìn)行合成。獲得這些二肽，既可以采用如下方法，將L-脯氨酸-Y、對應(yīng)于N端掩蔽-X部分的N端掩蔽-X氨基酸，用類似碳二酰亞胺衍生物的縮合劑耦合為N端掩蔽-X-L-脯氨酸-Y，再脫除掩蔽基團(tuán)，也可以采用活性酯或者類似的方法。適于N-端氨基酸的掩蔽基團(tuán)可從熟知的的基團(tuán)如芐氧?；?、叔-丁氧酰基和叔-戊氧?；羞x用。如果使用的氨基酸具有功能側(cè)基，在對功能側(cè)基進(jìn)行掩蔽后，這類氨基酸也可獲得應(yīng)用。比如，在將側(cè)鏈羧基轉(zhuǎn)換為酯基(如芐酯)后，酸性氨基酸即可使用。胍基用一般的掩蔽基團(tuán)如甲磺?；?、對硝基芐基?；?-(異丙氧基?；?-3，4，5，6-四氯苯甲?；?尤其前兩種)進(jìn)行掩蔽后，可以使用，而賴氨酸的N端-氨基通常用熟知的掩蔽氨基的基團(tuán)進(jìn)行掩蔽，更常用的是與選用于N端-氨基掩蔽相同的掩蔽基團(tuán)。依據(jù)N端掩蔽基團(tuán)采用熟知的方法消除所獲得的N端掩蔽-X-L-脯氨酸-Y的掩蔽基團(tuán)，以及可能存在的功能側(cè)基的掩蔽基團(tuán)。非常重要的是，在消除反應(yīng)中，僅僅消除掩蔽基團(tuán)而不對其它部分有影響。 也可以通過N端掩蔽-X-L-脯氨酸與Y-H首先耦合來合成目標(biāo)二肽的衍生物N端掩蔽-X-L-脯氨酸-Y，再消除掩蔽基團(tuán)。如果希望獲得二肽衍生物與酸形成的鹽，則可以通過在類似水、醇等介質(zhì)中將自由的堿與酸相接觸來制備。如果掩蔽基團(tuán)是類似叔-丁氧?；@樣可以被酸消除的掩蔽基團(tuán)，將N端掩蔽的衍生物與相同的酸接觸，則可以直接獲得期望的鹽。X-L-脯氨酸-Y和鹽，可通過化學(xué)合成方法，很易合成。在各種酸鹽中，甲苯磺酸鹽是最佳選擇，這是由于苯磺酸鹽可形成含少量雜質(zhì)穩(wěn)定的晶體，介于此，可通過簡單的重結(jié)晶的方法，得到較高純度的苯磺酸鹽。用這種二肽衍生物或鹽作為底物檢測酶活性是非常容易的。X-L-脯氨酸-Y的水溶液或鹽溶液首先應(yīng)有一個(gè)合適的濃度。因?yàn)樾枰鄬^長的時(shí)間溶解底物，因此需要加入一些其它合適的物質(zhì)助溶，例如非離子去污劑、酸、醇，或者通過把底物凍干的等方法，讓底物形成多孔結(jié)構(gòu)，以增加其溶解性。凍干粉更方便日常使用。根據(jù)采用的底物種類，底物溶液最佳pH的選擇也不同，但一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體要求決定。最佳的pH —般選在6-9之間，建議取在PH 7. 5-8. 9之間。pH大于9. 5，底物自發(fā)水解，但是底物溶液，特別是甘氨酰-L-脯氨酸對硝基苯胺溶液在大于上述提到的最佳pH區(qū)間內(nèi)仍較穩(wěn)定。4°C可保存一周以上，不降解。Y-H的量很容易通過檢測特定波長，酶促反應(yīng)的吸光度來計(jì)算。Y-H，即對硝基苯胺385nm處檢測,對苯基偶氮胺493nm檢測,4-苯偶氮_1_萘胺532nm檢測。這種吸光度測定方法非常簡單、方便、準(zhǔn)確，適合于常規(guī)酶活性檢測。如果Y-H為對硝基苯胺，酶活性也可通過在酸性條件下對硝基苯胺與過量亞硝酸鈉反應(yīng)形成重氮鹽來檢測。發(fā)生重氮化的對硝基苯胺的量，可通過直接檢測未反應(yīng)的亞硝 酸鈉的量來計(jì)算，但是一般通過所謂的重氮偶合法來檢測。通過氨基磺酸、氨基磺酸銨、尿素或類似物分解亞硝酸鈉，與對硝基苯重氮鹽反應(yīng)形成一個(gè)耦合物，然后通過檢測這種含氮復(fù)合物的合適吸光度值，來檢測酶活性。這種間接檢測方法，比直接測定吸光度值法，要復(fù)雜。但是靈敏度要高很多，特別是對一些酶含量很少的樣本，是一種很有效的檢測方法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :N-芐氧酰基-L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺的制備
三氯氧磷(50. 6g,0. 33mol), -10°C條件下，緩慢攪拌加入到含N-節(jié)氧?；?L-脯氨酸(74. 8g，O. 3moI)、對硝基苯胺(41. 4g，O. 3moI)的四氫呋喃(400ml)溶液中。三乙胺(92. 4mol,0. 66ml)逐滴加入到以上混合液中，內(nèi)部溫度控制在_15°C。用三乙胺調(diào)整pH到7. O后，反應(yīng)混合液溫度可以允許達(dá)到室溫，然后攪拌3小時(shí)。溶劑用乙酸乙酯(I. 2L)交換。乙酸乙酯依次用水(400ml)、lmol鹽酸(300mlx5)，水(400ml)，5%碳酸氫鈉(300mlx3)和飽和鹽溶液(300ml)洗漆,然后硫酸鎂干燥。干燥液是通過低壓濃縮而成，殘余部分通過加入乙醚而結(jié)晶，然后產(chǎn)物在乙酸乙酯(300ml)和甲醇混合液中重結(jié)晶。產(chǎn)量56g 熔點(diǎn):159-161 O。比旋光度:-107.6° (C=I,甲醇)_
元素分析_C_H_N%_
計(jì)算值)~77 5. 19 11. 38
實(shí)驗(yàn)值丨62. 07 |5. 2θ| 1. 62
實(shí)施例2 L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺氫溴酸鹽的制備
N-芐氧?；?L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺(55. 4g,0. 15mol)用26%無水溴化氫溶液溶解，(TC加入到200ml醋酸溶液中，室溫?cái)嚢鑳尚r(shí)?；旌弦海诟梢一?2L)中攪拌，至結(jié)晶析出。通過澄清、乙醚洗滌、干燥得到產(chǎn)物。產(chǎn)物量47g。粗制品用于以下范例中，沒有經(jīng)過純化。分析樣品通過在甲醇中重結(jié)晶得到。熔點(diǎn)225-226°C。
比旋光度:-35.60(C=1.0，甲醇)
權(quán)利要求
1.二肽衍生物為如下結(jié)構(gòu)X-L-脯氨酸一Y，其中X可從以下氨基酸的殘基中選取甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯基丙氨酸、、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸；γ可以從以下化合物中選取對硝基苯胺、對苯基偶氮胺、4-苯偶氮-I-萘胺和二肽衍生物的酸性鹽類。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于，X為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯基丙氨酸、、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸的氨基酸殘基，酸鹽為以下幾種對甲苯磺酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其中Y為對硝基苯胺殘基，而X除了甘氨酸殘基外，對于其它氨基酸殘基X則為L型氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于，X為甘氨酸殘基時(shí)，X可以為甘氨酰-L-脯氨酸對_硝基苯胺酰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于，X為甘氨酸殘基時(shí)，X可以為甘氨酰-L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺甲苯磺酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述，當(dāng)X為L型氨基酸殘基時(shí)，X-L-脯氨酸-Y可以為，L-賴氨酰L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述，當(dāng)X為L型氨基酸殘基，X-L-脯氨酸-Y可以為，L-精氨酰L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述當(dāng)X為L型氨基酸殘基，X-L-脯氨酸-Y，可以為，L-丙氨酰L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述，當(dāng)X為L型氨基酸殘基，X-L-脯氨酸-Y，可以為，L-谷氨酰L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述，當(dāng)X為L型氨基酸殘基，X-L-脯氨酸-Y，可以為，L-天門冬氨酰L-脯氨酸對-硝基苯胺酰胺。
全文摘要
合成以X-L-脯氨酸-Y化學(xué)結(jié)構(gòu)的底物，用于測定X-脯氨酰-二肽?；?氨基肽酶活性。其中X代表氨基酸殘基，Y代表對硝基苯胺，對苯基偶氮胺或4-苯偶氮-1-萘胺。這種復(fù)合物，滿足底物要求的各種條件，例如易測定(通過酶水解底物)、穩(wěn)定、底物量和酶含量及底物水解量和孵育時(shí)間成線性關(guān)系。用這種新的二肽衍生物及鹽作為底物，檢測X-脯氨酰-二肽?；?氨基肽酶活性可以作為一種非常有效的疾病輔助診斷方法，尤其對于一些惡性腫瘤的診斷。
文檔編號C12Q1/37GK102911253SQ20121049865
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者孟琛 申請人:北京華宇億康生物工程技術(shù)有限公司