專利名稱：：酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物制劑
技術領域：
，具體說涉及一種酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒。
背景技術：
：血液中的糖化血紅蛋白(糖化Hb)濃度近年來被用作糖尿病的診斷和治療的重要指標。目前，糖化血紅蛋白的測定可采用離子交換層析法、高效液相色譜法、親和層析法、放射免疫法、酶免疫法和膠乳免疫凝集法等。但這些方法或者需要專用儀器、價格昂貴，或者檢測時間長、測量精度差。最近流行的酶法檢測，利用氧化還原反應，不需要特殊的測定儀器，操作簡便易行，精度高，時間短，因此廣泛應用于生化分析和臨床檢査。糖化血紅蛋白的酶法檢測依照以下方法進行。首先，將含有糖化血紅蛋白的樣品用蛋白水解酶處理，使得糖化蛋白質分解i較小的糖化肽片段和糖化氨基酸；然后，將果糖纈氨酸氧化酶(FVO)作用于該糖化蛋白質的分解物，進行氧化還原反應，釋放出過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶的作用下與顯色基質發(fā)生反應，使得顯色基質顯色；通過測定顯色基質的顯色量，可以確定過氧化氫的量，從而可知樣品中糖化蛋白質的量。以前用于消化糖化血紅蛋白的蛋白水解酶為堿性蛋白酶，包括金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶及氨基肽酶等，酶解效果有待提高，且酶解反應中，除糖化血紅蛋白以外，其它糖化蛋白質和糖化肽也能被水解，影響了檢測結果的精確度。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，克服了以往試劑盒只能在堿性條件下酶解的弊端，酶解效果好于堿性蛋白酶，且用量僅為堿性蛋白酶的十分之一至五十分之一，成本更低；測量結果精確、符合糖化血紅蛋白臨床檢測要求快速、大批量、經(jīng)濟的特點，有利于臨床大規(guī)模應用。本發(fā)明的酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，其是由溶血緩沖液、試劑Rla、試劑Rlb、中和緩沖液和試劑2組成的，其中溶血緩沖液10-1000mmol/LN-環(huán)乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L嗎啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二垸基醚；試劑Rla:10-1000kU/L豬胃蛋白酶，0.1-10腿ol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2,4-二磺苯基)-211四唑鈉鹽，0.0001-0.1mol/LHCl;試劑Rlb:0.1-10mmol/L嗎啉代乙基磺酸，0.5-50mmol/LCaCl2;中和緩沖液0.0001-0.1mol/LNaOH;試劑2:1-1000kU/L果糖纈氨酸氧化酶，30-600kU/L過氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4,4雙偶(二甲胺)-二苯胺鈉■i^fj!，10-1000mmol/LTris隱HCl。本發(fā)明試劑盒在糖化血紅蛋白的酶法檢測中應用了豬胃蛋白酶。豬胃蛋白酶是一類酸性蛋白酶，其最適反應pH值為1.5-3.5。當用于血紅蛋白的酶解時，豬胃蛋白酶的酶解效果好于金屬蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等堿性蛋白酶，且用量僅為堿性蛋白酶的十分之一至五十分之一。本發(fā)明開發(fā)的新型試劑盒初始反應緩沖液為酸性環(huán)境，pH值為2.0左右，后經(jīng)中和緩沖液中和，達到中性環(huán)境附近，便于終止蛋白水解反應，進行下一步的氧化還原反應。在初始反應緩沖液中，可用鹽酸或磷酸營造酸性環(huán)境，首選鹽酸，其反應速度快且反應完全。中和緩沖液可采用氫氧化鈉中和初始反應緩沖液中過量的鹽酸，使反應環(huán)境pH值約為7.0-8.5。此后果糖纈氨酸氧化酶在該偏堿性環(huán)境下(pH7.0-8.5)作用于樣品，產(chǎn)生過氧化氫。過氧化氫在過氧化物酶催化下使顯色基質顯色，通過測定顯色基質的顯色量，最終確定樣品中糖化血紅蛋白的量。'該試劑盒優(yōu)選采用高活性果糖纈氨酸氧化酶FVO-m-21，其含有SEQID.No.1所示核苷酸序列和SEQID.No.2所示氨基酸序列。其制備方法步驟如下(1)以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進行易錯PCR擴增，建立果糖纈氨酸氧化酶的突變文庫；(2)將突變文庫轉入大腸桿菌，對其基因進行克隆、重組轉化和表達；(3)利用醌法測定酶活性，篩選出高活性果糖纈氨酸氧化酶。棒狀桿菌屬Corynebacteriumsp.2-4-1菌株含有果糖基纈氨酸氧化酶(FVO)的編碼基因。本發(fā)明基于FVO的基因編碼序列，設計兩條FVD基因的易錯PCR引物，上游引物序列為5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3，，下游引物序列為5'-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，。以FVO的基因編碼序列作為模板，進行易錯PCR擴增，經(jīng)擴增35個循環(huán)后，PCR產(chǎn)物純化回收，與原核表達載體pMD-18TVector連接，轉化入大腸桿菌XL1-Red中，涂布LB平板，收集含有插入片段的克隆，組成突變體庫。提取突變體庫中的質粒DNA，酶切，回收目的片段，連接入載體pGEX-4T-lm，轉化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖纈氨酸和1^(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-聯(lián)苯胺[DA-64]的LB平板，由于大腸桿菌自身含有過氧化物酶，故37。C培養(yǎng)12-24小時后，可見明顯變色現(xiàn)象。挑取變色快和變色圈大的克隆進行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。將初步篩選出的克隆在25'C液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，誘導表達，裂解細菌，利用醌法測定酶活性，最終得到一株酶活性約為普通果糖纈氨酸氧化酶活性6倍的高活性菌株，其所攜帶的FVO突變命名為FVO-m-21。通過測序分析發(fā)現(xiàn)，該突變克隆中發(fā)生五個堿基點突變，分別是堿基序列中57位'C—T、374位T—C、534位G—A、914位C—A和1056位G—C，共引起了兩個氨基酸突變，分別是氨基酸序列中125位He—Thr和305位Ala—Glu。作為進一步優(yōu)選，本發(fā)明試劑盒的組成如下溶血緩沖液10-800mmol/LN-環(huán)乙基-2氨基乙烷磺酸，10-900mmol/L嗎啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二垸基醚；試劑Rla:10-700kU/L豬胃蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1mol/LHCl;試劑Rlb:2-8mmol/L嗎啉代乙基磺酸，0.5-40腿ol/LCaCl2;中和緩沖液0.0001-0.1moI/LNaOH;試劑2:20-80kU/LFVO-m-21，30-500kU/L過氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4,4雙偶(二甲胺)-二苯胺鈉10-800腿ol/LTris-HCl。作為最優(yōu)選，本發(fā)明試劑盒的組成如下溶血緩沖液600mmol/LN-環(huán)乙基-2氨基乙烷磺酸，450mmol/L嗎啉代丙烷磺酸，50g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑Rla:500kU/L豬胃蛋白酶，3mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑鈉鹽，0.005mol/LHCl;試劑Rlb:6mmol/L嗎啉代乙基磺酸，20腿ol/LCaCl2;中和緩沖液0.03mol/LNaOH;試劑2:50kU/LFVO-m-21，250kU/L過氧化物酶，O.lmmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4雙偶(二甲胺)-二苯胺鈉鹽，600腿ol/LTris-HCl。本發(fā)明試劑盒采用酸性豬胃蛋白酶，克服了以往試劑盒只能在堿性條件下酶解的弊端，酶解效果好于堿性蛋白酶，且用量僅為堿性蛋白酶的十分之一至五十分之一，成本更低；檢測血紅蛋白時，除糖化血紅蛋白以外，其它糖化蛋白質和糖化肽都難以被水解，果糖纈氨酸氧化酶也難以作用于上述其它糖化蛋白質等，因此可以只測定糖化血紅蛋白，使得結果更精確。另外，試劑盒中的高活性酶FVO-m-21可更快速地與糖化肽片段或糖化氨基酸反應，生成過氧化氫，在相同底物量的反應體系中，所需的酶量也更少，可降低生產(chǎn)成本，縮短反應時間，便于更快速的進行大批量樣品檢測。具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，但并不僅限于下述實施例。實施例l:高活力果糖纈氨酸氧化酶FVO-m-21的獲得。一、以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進行易錯PCR擴增。1.引物序列正向引物5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTC*CACCGCTAC-3，反向引物5，-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，2.易錯PCR反應體系和反應條件PCR反應體系100tlL體系中含有10mMTris-HClpH8.30，50mMKCl，6.5mMMgCl2，0.15mMMnCl2，0.2mMdGTP/iiATP，0.8mMdTTP/dCTP，2.2嗎SSBProtein,0.5正向/反向引物，10ng模板DNA2.5單位TaqDNA聚合酶。PCR反應條件94°C5min;94'C30sec，55°C30sec,72。C2min，35個循環(huán)；72°C10min;4°Cforever。3.易錯PCR產(chǎn)物取3pL于P/。的瓊脂糖凝膠電泳，可見lkb左右有產(chǎn)物條帶。將易錯PCR產(chǎn)物用純化回收試劑盒純化回收，與pMD-18TVector連接，轉化入大腸桿菌XLl-Red中，涂布Amp抗性LB平板，可獲得Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因的突變體庫。二、突變體菌株的初篩提取突變體庫中的質粒DNA，用BamHI和HindIII雙酶切，回收1kb左右的目的片段，載體pGEX-4T-lm同樣用BamHI和HindIII雙酶切，回收，二者4'C連接過夜，轉化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖纈氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-二(甲基氨基)-聯(lián)苯胺[DA-64]的LB平板，37'C培養(yǎng)12-24小時后，可見明顯變色現(xiàn)象。挑取變色快和變色圈大的克隆進行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，共挑取克隆48個。三、突變體酶活性的醌法檢測1.在誘導表達4小時后，收集菌液，測量并且記錄細胞培養(yǎng)物的OD600值。2.制備檢測酶活的細菌裂解液。在374B-PERtm細菌蛋白抽提試劑(Pierceproduct78248)中重新懸浮細胞，再加入50uL蛋白酶和磷酸化酶抑制劑以及細菌細胞提取物(Sigma產(chǎn)品P8465)，1uL34mg/mL的氯霉素(用甲醇配制)。快速渦旋振蕩一分鐘。在冰上放置5min。離心1min后置于冰上。3.用Bradford法測定蛋白含量。4.取50nL上述細菌裂解液加到醌法反應混合液中，37'C溫浴1-3min,測量555nm處吸光值。反應混合液成分為lOOmM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)，1purpurogallinunit/ml過氧化物酶，0.45mM4-氨基安替吡啉，0.5"mMTOOS(N-^基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)，5.0mM果糖纈氨酸，總體積為3mL。其中，一個酶活力單位定義為在37'C每分鐘可催化產(chǎn)生0.5pM醌染料。實際酶活力按每分鐘每mg蛋白質所形成的nmol產(chǎn)物來測定。四、高活性突變FVO的序列測定通過酶活力測定，篩選出活力約為普通果糖纈氨酸氧化酶活力6倍的高活突變。提取質粒DNA，測序發(fā)現(xiàn)該突變序列如SEQID.No.1所示。其中發(fā)生突變的位點，為57位C—T、374位T—C、534位G—A、914位C—A和1056位G—C。對應的氨基酸序列如SEQID.No.2所示。其中發(fā)生突變的氨基酸位點，共有兩個氨基酸突變，分別是氨基酸序列中125位lie—Thr和305位Ala—Glu。實施例2.以蒸餾水為溶劑，按照常規(guī)配制試劑方法配制，如表1所示。實施例3應用本發(fā)明試劑盒測定糖基化血紅蛋白標準液。從患者采集全血(患者數(shù)16名)，紅細胞自然沉降回收，取20uL沉降的紅細胞部分，向其中加入上述溶血緩沖液500uL。將得到的30uL溶血試樣與40uL試劑Rla和40ixL試劑Rlb混合，于37'C溫浴3分鐘。加入40nL中和緩沖液，混勻，讀取吸光度A1。再向反應體系中加入20uL試劑2，于37'C溫浴2分鐘，讀取吸光度A2。=A2—A1。。測定時可選擇751nm和571nm處的吸光值。其中，Hb濃度可由波長751nm處的吸光度求出，HbAlc濃度可由波長571nm處的吸光度求出。計算公式，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>表l酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒各配方<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4采用金屬蛋白酶的酶法測定糖化血紅蛋白的試劑盒配方。與實施例2不同處在于試劑Rla的成分和不應用中和緩沖液。其它處理方法相同。試劑Rla為100-10000kU/L金屬蛋白酶0.1-10讓ol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑鈉鹽。表2不同方法糖化血紅蛋白測定值比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2表示為本發(fā)明酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒與用金屬蛋白酶檢測糖化血紅蛋白的試劑盒測量精度對比表，還包括采用HPLC法測定的標準參考值。以HPLC法測定值為橫坐標，本發(fā)明酶法檢測糖化血紅蛋白試劑盒和金屬蛋白酶檢測糖化血紅蛋白的試劑盒測量值為縱坐標，擬合直線，得到實施例的相關式為"y=0.9955x+2.0727，R2=0.9987;"y=1.0227x+1.8455，R2=0.9958"。由此可知本發(fā)明試劑盒的測量精度與HPLC法測定的標準參考值幾乎一致，而且比普通金屬蛋白酶的糖化蛋白檢測試劑要高，因此本發(fā)明試劑盒可以以優(yōu)良的精度測定糖化血紅蛋白。以上實施例是對專利的說明和進一步解釋，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的精神和權利保護范圍內所做的任何修改，都落入本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>寧波美康生物科技有限公司<120>酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒<130>003<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1119<212>DNA<213>Corynebacteriumsp.<220><221>CDS<222>(1)..(1119)<400>1atgtectecaccgetaccaagcatgtcgccgtcattggcggcggcate48MetSerSerThrAlaThrLysHisValAlaVallieGlyGlyGlylie151015ctgggcgtttecaccgccgtccacctgetccgccaaggcgcaacagtc96LeuGlyValSerThrAlaValHisLeuLeuArgGinGlyAlaThrVal202530accetcttgaccgaacagggcetcgccage'gaagccacgggceggtec144ThrLeuLeuThrGluGinGlyLeuAlaSerGluAlaThrGlyArgSer354045ttgtectggetcaactecgccggggaacgctecactccetatcaccag192LeuSerTipLeuAsnSerAlaGlyGluArgSerThrProTyrHisGin505560ctgcgcategetggcgttgaceggtaccgcacgctgttcgccgccgat240LeuArglieAlaGlyValAspArgTyrArgThrLeuPheAlaAlaAsp65707580cccageegggaatggttgcagttcgggggcgggetcatgtggaacgcc288ProSerArgGluTrpLeuGinPheGlyGlyGlyLeuMetTrpAsnAla859095gccggggaaagtgaggtcaccaaagcceggcacgcctacgagaagtec336AlaGlyGluSerGluValThrLysAlaArgHisAlaTyrGluLysSer100105110ateggctacgacteccaactgctggcccctgaagaaaccggcteggtc384lieGlyTyrAspSerGinLeuLeuAlaProGluGluThrGlySerVal115120125acgccaggcategacgccagtgccgtcccggagaacgcaatettcaat432ThrProGlylieAspAlaSerAlaValProGluAsnAlaliePheAsn130135140cctggcgagggctgggtcagectgccggacctggtgaacttcctgatg480ProGlyGluGlyTrpValSerLeuProAspLeuValAsnPheLeuMet145150155160gaggaattccacgccctgggcggccagttggtcetcaacgcaggtaaa528GluGluPheHisAlaLeuGlyGlyGinLeuValLeuAsnAlaGlyLys165170175gccteagtgatggtcgagggcggcegggetaccgcggtcgaaaccgcc576AlaSerValMetValGluGlyGlyArgAlaThrAlaValGluThrAla180185190accggtgaaacctaccccgcggacgccgttetcgtagcctgcggtgcc624ThrGlyGluThrTyrProAlaAspAlaValLeuValAlaCysGlyAla195200205gcgacgccggccgtcgtaaaaccgetcggggtcgagataccgaacggt672AlaThrProAlaValValLysProLeuGlyValGlulieProAsnGly210215220tecccggtctecatgctggttgttaccaagcecgtggagcaccaggtc720SerProValSerMetLeuValValThrLysProValGluHisGinVal225230235240gcggcagtgatgaatacgccgcgcgetgccgtgcgacccaatccgggt768AlaAlaValMetAsnThrProArgAlaAlaValArgProAsnProGly245250255<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>GlyArgPheSer370<210>2<211>372<212>PRT<213>Corynebacteriumsp.<400>2MetSerSerThrAlaThrLysHisValAlaValHeGlyGlyGlylie151015LeuGlyValSerThrAlaValHisLeuLeuArgGinGlyAlaThrVal202530ThrLeuLeuThrGluGinGlyLeuAlaSerGluAlaThrGlyArgSer354045LeuSerTrpLeuAsnSerAlaGlyGluArgSerThrProTyrHisGin505560LeuArglieAlaGlyValAspArgTyrArgThrLeuPheAlaAlaAsp65707580ProSerArgGluTrpLeuGinPheGlyGlyGlyLeuMetTrpAsnAla859095AlaGlyGluSerGluValThrLysAlaArgHisAlaTyrGluLysSer100105110lieGlyTyrAspSerGinLeuLeuAlaProGluGluThrGlySerVal115120125ThrProGlylieAspAlaSerAlaValProGluAsnAlaliePheAsn130135140ProGlyGluGlyTrpValSerLeuProAspLeuValAsnPheLeuMet145150155160GluGluPheHisAlaLeuGlyGlyGinLeuValLeuAsnAlaGlyLys165170175AlaSerValMetValGluGlyGlyArgAlaThrAlaValGluThrAla180185190ThrGlyGluThrTyrProAlaAspAlaValLeuValAlaCysGlyAla195200205AlaThrProAlaValValLysProLeuGlyValGlulieProAsnGly210215220SerProValSerMetLeuValValThrLysProValGluHisGinVal225230235240AlaAlaValMetAsnThrProArgAlaAlaValArgProAsnProGly245250255AsnThrPheAlaLeuAspHisAspTrpTyrGluGlyHislieThrGlu260265270HisAlaAspGlySerPheThrlieProAspAspValValGinGluLeu275280285AlaAspGluSerSerLysLeuHeAlaGlyAsnProGluLeuLysPro290295300GluSerTrpLyslieGlyTyrLysProIlePro@lyAsp<%GluPro305310315320ValPheGlyGluLeuGlyArgValProGlyCysPheValAlaPheThr325330335HisSerGlyAlaThrLeuGlyLeulieAlaGlyGluLeuLeuSerGly340345350GinHeLeuThrGlyAspLysHisProMetPheAlaThrPheArgPro355360365GlyArgPheSer370權利要求1、一種酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，其特征在于該試劑盒是由溶血緩沖液、試劑R1a、試劑R1b、中和緩沖液和試劑2組成的，其中溶血緩沖液10-1000mmol/LN-環(huán)乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L嗎啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a10-1000kU/L豬胃蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1mol/LHCl；試劑R1b0.1-10mmol/L嗎啉代乙基磺酸，0.5-50mmol/LCaCl2；中和緩沖液0.0001-0.1mol/LNaOH；試劑21-1000kU/L果糖纈氨酸氧化酶，30-600kU/L過氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4雙偶(二甲胺)-二苯胺鈉鹽，10-1000mmol/LTris-HCl。全文摘要本發(fā)明涉及一種酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，成分為溶血緩沖液10-1000mmol/LN-環(huán)乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L嗎啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a10-1000kU/L豬胃蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1mol/LHCl；試劑R1b0.1-10mmol/L嗎啉代乙基磺酸，0.5-50mmol/LCaCl₂；中和緩沖液0.0001-0.1mol/LNaOH試劑21-1000kU/L果糖纈氨酸氧化酶，30-600kU/L過氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4雙偶(二甲胺)-二苯胺鈉鹽，10-1000mmol/LTris-HCl。該試劑盒酶解效果好于堿性蛋白酶，用量少成本低，測量結果精確。文檔編號C12Q1/26GK101363042SQ20081016632公開日2009年2月11日申請日期2008年9月23日優(yōu)先權日2008年9月23日發(fā)明者姜云飛,鄒炳德申請人:寧波美康生物科技有限公司