專利名稱：酶制備富集對映體的β－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備富集對映體的β-氨基酸的方法。
作為β-氨基羧酸的制備方法，已經(jīng)建立了借助非對映異構(gòu)鹽的常規(guī)外消旋體拆分方法(建議路線為H.Boesch et al.，Org.Proc.Res.Developm.2001，5，23-27)，特別是借助苯乙基酰胺鋰非對映體選擇性加成的拆分方法(A.F.Abdel-Mafid，J.H.Cohen，C.A.Maryanoff，Curr.Med.Chem.1999，6，955-970)。盡管會(huì)帶來許多不利，但是后者方法已經(jīng)被深入細(xì)致地研究并且優(yōu)選使用。一方面，需要化學(xué)計(jì)量量的手性試劑，與催化不對稱方法相比這是主要的缺點(diǎn)。此外，需要昂貴且危險(xiǎn)的輔助物質(zhì)如正丁基鋰來通過去質(zhì)子化而活化化學(xué)計(jì)量試劑。另外，在約-70℃的低溫進(jìn)行反應(yīng)對于得到滿意的立體選擇性是重要的，這意味著對相關(guān)反應(yīng)器材料有高的要求，也就有附加的成本和高的能量消耗。
盡管由生物催化來制備光學(xué)活性的β-氨基羧酸在目前僅處于次要的地位，但特別是生物催化反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)學(xué)優(yōu)點(diǎn)，它是特別希望的。不需要使用化學(xué)計(jì)量量的手性試劑，只需要使用很少的催化量的酶，酶是對自然和環(huán)境友好的催化劑。此外，與大量合成的含金屬催化劑相比，除了它們的催化特性和高活性外，這些在水介質(zhì)中高效使用的生物催化劑具有不需要使用含金屬、尤其是含重金屬并因此是有毒原料的優(yōu)點(diǎn)。
例如，在現(xiàn)有技術(shù)中，β-氨基羧酸的對映體選擇性N-?；呀?jīng)被經(jīng)常報(bào)道。
因此，L.T.Kanerva等在TetrahedronAsymmetry，Vol.7，No.6，p.1707-1716，1996中描述了不同環(huán)脂族β-氨基羧酸乙酯在有機(jī)溶劑中使用2，2，2-三氟乙酯并用來自Candida antarctica的脂肪酶SP 526或者來自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS作為生物催化劑的對映體選擇性N-?；?br> V.M.Sanchez等研究了使用來自Candida antarctica的脂肪酶經(jīng)由N-?；?氨基羧酸酯制備的生物催化(±)-乙基-3-氨基丁酸酯外消旋體的拆分(TetrahedronAsymmetry，Vol.8，No.1，p.37-40)。
EP-A-8 890 649公開了在水解酶存在下通過羧酸酯的對映體選擇性?；瘡耐庀被狨ブ兄苽涔鈱W(xué)活性氨基酸酯且接著分離未反應(yīng)氨基酸酯對映體的方法，其中水解酶選自酰胺酶、蛋白酶、酯酶和脂肪酶。
WO-A-98/50575涉及在立體選擇性地?；庀?氨基羧酸的條件下，使?；o體的外消旋β-氨基羧酸與青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在一定條件下接觸，從而獲得手性β-氨基羧酸及其相應(yīng)酯的方法，而其它的對映體基本上未反應(yīng)，因此獲得手性的β-氨基羧酸。也已經(jīng)研究了相反的反應(yīng)順序(V.A.Soloshonok，V.K.Svedas，V.P.Kukhar，A.G.Kirilenko，A.V.Rybakova，V.A.Solodenko，N.A.Fokina，O.V.Kogut，I.Y.Galaev，E.V.Kozlova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，Synlett 1993，339-341；V.Soloshonok，A.G.Kirilenko，N.A.Fokina，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，V.P.Kukhar，V.K.Svedas，E.V.Kozlova，TetrahedronAsymmetry，1994，5，1119-1126；V.Soloshonok，N.A.Fokina，A.V.Rybakova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，A.E.Sochorinsky，V.P.Kukhar，M.V.Savchenko，V.K.Svedas，TetrahedronAsymmetry，1995，6，1601-1610；G.Cardillo，A.Tolomelli，C.Tomasini，Eur.J.Org.Chem.1999，155-161)。該方法的缺點(diǎn)是產(chǎn)物混合物很難進(jìn)行隨后的對映體選擇性水解。分離游離β-氨基羧酸后，獲得很難分離的苯乙酸與N-苯乙?；?β-氨基羧酸的混合物。
為了得到富集對映體的羧酸，很久前就已知將它們與脂肪酶反應(yīng)。在US 5518903中，該原理已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為N-保護(hù)的β-氨基酸酯，但是卻有不同的成功程度。當(dāng)只有外消旋N-丁氧基羰基-β-氨基丁酸的相應(yīng)芐基酯可以通過脂肪酶以高度對映體選擇性方式拆分時(shí)，殘留的所用甲基酯和正丁基酯僅實(shí)現(xiàn)ee值在70％附近。需要注意的是從相應(yīng)甲基酯到正丁基酯的轉(zhuǎn)變明顯伴隨著所制備酸ee值的降低。例如，用得自Asahi的脂肪酶從N-Boc-β-氨基丁酸起始的酯水解在8天后以37％的產(chǎn)率給出相應(yīng)酸的ee值為45％ee。使用得自Amano的脂肪酶PS時(shí)，相同反應(yīng)在7天內(nèi)以41％的產(chǎn)率可以獲得富集到61％ee的化合物。相比而言，相應(yīng)的甲基酯為70％ee。
最近Faulconbridge等報(bào)道的結(jié)果表明用Amano的脂肪酶PS在pH 8時(shí)發(fā)生芳香β-氨基酸乙酯的酯水解，具有可接受的產(chǎn)率和非常好的對映體過量(Tetrahedron Letters 2000，41，2679-81)。獲得產(chǎn)物的對映體純度高達(dá)99％，但是該合成僅僅在懸浮液中進(jìn)行，有一些缺點(diǎn)。一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)盡管在這些條件下結(jié)晶是選擇性的，但是如比較例2中所述，反應(yīng)本身導(dǎo)致了85.1％ee的較低的ee值?？傊?，這意味著一方面由于形成不希望的對映體而造成產(chǎn)率的損失，另一方面由于改變的結(jié)晶條件，與輕微的方法變化有關(guān)，在工業(yè)規(guī)模中ee值還可能容易地降到99％ee以下，或者甚至降到98％ee以下。但是，藥物應(yīng)用需要盡可能高的ee值＞98％ee，尤其是＞99％ee。另外例如，為了能確保良好的酶超濾分離，在純液體介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)和在懸浮液中進(jìn)行反應(yīng)都是希望的。最優(yōu)地，在這種步驟下產(chǎn)生高的ee值，這并不能由現(xiàn)有的文獻(xiàn)方法所實(shí)現(xiàn)(關(guān)于這一點(diǎn)也參見比較例1和2)。
Nagata等報(bào)道了使用有機(jī)溶劑在單相反應(yīng)介質(zhì)中的酶水解(S.Katayama，N.Ae，R.Nagata，TetrahedronAsymmetry，1998，9，4295-4299)。在此情況下，使用環(huán)狀β-氨基酸酯。使用由丙酮(90％)和水(10％)組成的混合溶劑在20小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間后實(shí)現(xiàn)了94％ee的對映體選擇性和50％轉(zhuǎn)化率的最好結(jié)果。使用較低比例的水得到較差的結(jié)果。通常，與少量水混溶的溶劑相比，使用容易溶于水的溶劑是更優(yōu)越的。因此使用由水和20％丙酮飽和的二異丙醚作為有機(jī)介質(zhì)僅得到58％ee的ee值。相比而言，除了含THF的丙酮外，更容易溶于水的溶劑證明是適合的(95％ee)，但是，在這種情況下，為了實(shí)現(xiàn)任何程度地完全轉(zhuǎn)化都需要長的反應(yīng)時(shí)間(96小時(shí))。
但是迄今為止，這種具有存在有機(jī)溶劑特征的成功合成還僅限于制備環(huán)狀β-氨基酸酯。在環(huán)狀β-氨基酸酯文獻(xiàn)的具體最優(yōu)條件下(見上述)，希望的開鏈側(cè)基目標(biāo)化合物的制備都得到非常低的產(chǎn)率和不可接受的長反應(yīng)時(shí)間(比較例1)。
從現(xiàn)有技術(shù)中并沒有更詳細(xì)地提及、但是可以很明顯地看出的這種或其它的目標(biāo)，可以根據(jù)本發(fā)明的要點(diǎn)通過具有權(quán)利要求1特征的方法而實(shí)現(xiàn)。從屬權(quán)利要求2到8涉及本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。
制備富集對映體的N-未保護(hù)的、特別是開鏈的β-氨基酸的方法可以通過在由水和有機(jī)溶劑組成的兩相系統(tǒng)中，用水解酶酶水解N-未保護(hù)的、特別是開鏈的β-氨基酸酯的對映體混合物來實(shí)現(xiàn)，結(jié)果本發(fā)明的設(shè)定目標(biāo)可以以非常令人驚奇，但是另一方面又沒有不利因素的方式實(shí)現(xiàn)。就此而言，本發(fā)明不僅可以令人驚奇地達(dá)成比迄今已知的有機(jī)/水相系統(tǒng)中基本上更高的反應(yīng)性，而且可以得到更好的對映體選擇性。兩相系統(tǒng)中的反應(yīng)甚至可以被最優(yōu)化至產(chǎn)生≥99％ee的產(chǎn)物(實(shí)施例4)。此外，令人感興趣的是與在純的水相系統(tǒng)中實(shí)驗(yàn)(比較例2，81.5％ee)相比，本發(fā)明實(shí)施例3的ee值(89％ee)是明顯更好的。因此，與水相標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)相比，本發(fā)明方法除了具有有機(jī)溶劑的處理優(yōu)點(diǎn)外，另外還具有在產(chǎn)物中產(chǎn)生更高對映體選擇性的優(yōu)點(diǎn)。
原則上，本領(lǐng)域技術(shù)人員隨意選擇適當(dāng)?shù)孽セ鶊F(tuán)。他將基于經(jīng)濟(jì)和反應(yīng)工程學(xué)方面進(jìn)行他的選擇。用于形成酯的有利的醇特別是那些容易從反應(yīng)混合物中任選通過蒸餾除去的醇。本發(fā)明方法中特別優(yōu)選使用β-氨基酸烷基酯或者β-氨基酸芳基酯。極其優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)恼ァ惐?、正丁酯、仲丁酯、異丁酯或叔丁酯?br> 反應(yīng)參數(shù)的選擇同樣是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以勝任的。他將基于常規(guī)實(shí)驗(yàn)對每種情況分別確定這些參數(shù)。在所有情況下，對于本發(fā)明主題的酶方法而言，pH范圍從4到10，優(yōu)選從6到9，而且最優(yōu)選從7到8.5是適當(dāng)?shù)?。已?jīng)證明Amano供應(yīng)的脂肪酶PS在約pH8時(shí)是特別適合的。
關(guān)于溫度，原則上要求與pH值相同。在此再次根據(jù)酶工作的最佳溫度，可以對每種情況確定其盡可能最優(yōu)的溫度。對于來自喜溫有機(jī)體的酶，溫度可能高達(dá)100℃。其它的酶僅在＜0℃到-15℃下最優(yōu)工作，可能在冰基質(zhì)中工作。反應(yīng)期間設(shè)定的溫度應(yīng)該優(yōu)選在15到40℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選20到30℃。
本領(lǐng)域技術(shù)人員負(fù)責(zé)選擇所用的酶。許多適當(dāng)?shù)拿缚梢詮腛rganic Synthesis，Ed.K.Drauz，H.Waldmann，VCH，1995，p.165及其引用的文獻(xiàn)中的酶催化劑中選擇。對于酯的水解，優(yōu)選使用脂肪酶，更優(yōu)選使用Amano供給的來自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS。
為了應(yīng)用，所考慮的多肽可以以游離態(tài)形式作為均勻純化的化合物或者作為由重組方法制備的酶來使用。另外，多肽還可以作為完整客體有機(jī)體的組分使用，或者與按要求純化的主體有機(jī)體可消化的細(xì)胞材料結(jié)合使用。
還可以使用固定形式的酶(Sharma B.P.；Bailey L.F.and MessingR.A.(1982)，Immobilisierte Biomaterialien-Techniken undAngwendungen，Angew.Chem.94，836-852)。有利地，固定可以通過冷凍干燥進(jìn)行(Paradkar，V.M.；Dordick，J.S.(1994)，Aqueous-LikeActivity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhtdrous OrganicSolvent，J.Am.Chem.Soc.116，5009-5010；Mori，T.；Okahata，Y.(1997)，A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyltransfer catalysts in homogenous organic solvents，Tetrahedron Lett.38，1971-1974；Otamiri，M.；Adlercreutz，P.；Matthiasson，B.(1992)，Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a meansto solubilize the enzyme in active form in toluene，Biocatalysis 6，291-305)。非常特別優(yōu)選的是在表面活性劑存在下的冷凍干燥，表面活性劑例如Aerosol OT、或聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇(PEG)、或Brij 52(二乙二醇單十六烷基酯)(Kamiya，N.；Okazaki，S.-Y.；Goto，M.(1997)，Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active inanhydrous benzene，Biotechnol.Tech.11，375-378)。
極其優(yōu)選在Eupergit上，尤其是在Eupergit C和Eupergit250L(Roehm)上固定(概略地參見E.Katchalski-Katzir，D.M.Kraemer，J.Mol.Catal.BEnzym.2000，10，157)。同樣優(yōu)選在Ni-NTA上通過與His標(biāo)記(六組氨酸)附著改性的多肽結(jié)合來固定(Petty，K.J.(1996)，Metal-chelate affinity chromatography inAusubel，F(xiàn).M.et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，New York；JohnWiley and Sons)。
同樣還可以作為CLECs來使用(St.Clair，N.；Wang，Y.-F.；Margolin，A.L.(2000)，Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals(CLEC)ofalcohol dehydrogenase，Angew.Chem.Int.Ed.39，380-383)。
通過這些措施，還可能從由于有機(jī)溶劑而變得不穩(wěn)定的多肽中產(chǎn)生能夠在含水和有機(jī)溶劑混合物中或者在全部有機(jī)介質(zhì)中工作的多肽。
本發(fā)明主題反應(yīng)可以在為此提供的任何容器中進(jìn)行。這些反應(yīng)容器詳細(xì)而言為常規(guī)間歇式反應(yīng)器、環(huán)管反應(yīng)器或酶-膜反應(yīng)器(Bommarius，A.S.；Drauz，K.；Groeger，U.；Wandrey，C.；MembraneBioreactors for the Production of Enantiomerically Pure a-AminoAcids，inChirality in Industry(eds.；Collins，A.N.；Sheldrake，G.N.；Crosby，J.)1992，John Wiley and Sons，p.371-397)。
適當(dāng)?shù)淖鳛榭梢栽诩榷ǖ姆磻?yīng)條件下與水形成兩相、也就是說因此是不溶的或者水溶性不好的而且可以在本發(fā)明方法中使用的有機(jī)相是所有種類的不溶或水溶性不好的有機(jī)溶劑及其混合物。特別地，這些溶劑是醚、酮、酯、飽和或未飽和的直鏈或支鏈烴。
就此而言，甲基叔丁基醚(MTBE)、二異丙醚、乙酸乙酯、己烷、庚烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷和甲苯、以及它們的任何適當(dāng)希望的混合物都被證明是特別適合的。
如果使用以吸附形態(tài)存在、任選地吸附在水不溶性載體材料和/或少量組分或穩(wěn)定劑上的酶時(shí)，已經(jīng)證明假定酶和載體的分離是容易的，那么有利地是在反應(yīng)中使用酶之前，分離不可溶載體和/或少量組分或穩(wěn)定劑，以便不發(fā)生由所用酶的不溶性載體材料所產(chǎn)生的產(chǎn)物污染。例如，可有利地使用的由Amano提供的脂肪酶PS被吸附到二氧化硅載體上。在這種情況下，為了從反應(yīng)系統(tǒng)中除去硅酸，在向反應(yīng)介質(zhì)中加入反應(yīng)物前，應(yīng)該過濾酶的水溶液。作為一個(gè)原則，酶的活性或者方法的穩(wěn)定性不負(fù)面影響此程序。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“N-未保護(hù)”被理解成指酸的β-氮原子沒有被反應(yīng)條件下穩(wěn)定的N-保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)。這些保護(hù)基團(tuán)尤其被認(rèn)為是通常的保護(hù)基團(tuán)，例如Z、Boc、Fmoc、Eoc、Moc、乙?；?。
(C1-C8)-烷基被認(rèn)為是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，以及所有的成鍵異構(gòu)體。這些基團(tuán)可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH或者S-(C1-C8)-烷基單取代或多取代。
(C2-C8)-烯基被理解成是除甲基外，至少含有一個(gè)雙鍵的如上所述的(C1-C8)-烷基基團(tuán)。
(C2-C8)-炔基被理解成是除甲基外，至少含有一個(gè)三鍵的如上所述的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-?；焕斫獬墒墙?jīng)由-C＝O-官能團(tuán)與分子結(jié)合的(C1-C8)-烷基。
(C3-C8)-環(huán)烷基被理解成是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、或環(huán)庚基等。它們可以被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子和/或含N、O、P、S原子的基團(tuán)所取代、和/或具有含有N、O、P、S原子的環(huán)基團(tuán)，例如1-，2-，3-，4-哌啶基、1-，2-，3-吡咯烷基、2-，3-四氫呋喃基、2-，3-，4-嗎啉基。此類基團(tuán)可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-?；?、(C1-C8)-烷基單取代或多取代。
(C6-C18)-芳基被理解成是含有6到18個(gè)碳原子的芳基基團(tuán)。特別地，它們包括苯基、萘基、蒽基、菲基、聯(lián)苯基。此類基團(tuán)可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-?；?C1-C8)-烷基單取代或多取代。
(C7-C19)-芳烷基是經(jīng)由(C1-C8)-烷基與分子結(jié)合的(C6-C18)-芳基。
(C1-C8)-烷氧基是經(jīng)由氧原子與所述分子鍵合的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-烷氧羰基是經(jīng)由-OC(O)-官能團(tuán)與所述分子結(jié)合的(C1-C8)-烷基。相同地描述類似地應(yīng)用于其它的氧羰基。
(C1-C8)-鹵烷基是由一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的(C1-C8)-烷基。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，(C3-C18)-雜芳基表示具有3到18個(gè)碳原子并且在環(huán)上含有諸如氮、氧、或硫雜原子的五、六或七員芳環(huán)系統(tǒng)。這些雜芳香化合物被特別認(rèn)為是如下基團(tuán)1-，2-，3-呋喃基、1-，2-，3-吡咯基、1-，2-，3-噻吩基、2-，3-，4-吡啶基、2-，3-，4-，5-，6-，7-吲哚基、3-，4-，5-吡唑基、2-，4-，5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基、2-，4-，5-，6-嘧啶基。此類基團(tuán)可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基單取代或多取代。
(C4-C19)-雜芳烷基被理解成是相應(yīng)于(C7-C19)-芳烷基的雜芳香系統(tǒng)。
適當(dāng)?shù)柠u素是氟、氯、溴和碘。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語富集對映體被理解成指與其光學(xué)對映體混合的對映體的比例在＞50％到＜100％的范圍內(nèi)。
所示結(jié)構(gòu)涉及所有可能的非對映體和對映體以及它們可能的混合物。
引用的參考文獻(xiàn)被認(rèn)為是包括在本發(fā)明的公開事實(shí)內(nèi)。
權(quán)利要求
1.通過用水解酶來酶水解N-未保護(hù)的、特別是開鏈的β-氨基酸酯的對映體混合物制備富集對映體的N-未保護(hù)的、特別是開鏈的β-氨基酸的方法，其中水解在由水和給定反應(yīng)條件下與水形成兩相的有機(jī)溶劑組成的兩相系統(tǒng)中發(fā)生。
2.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用β-氨基酸烷基酯或者β-氨基酸芳基酯。
3.如權(quán)利要求2的方法，其特征在于使用相應(yīng)的正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、或叔丁基酯。
4.如前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于反應(yīng)的pH值為4-10，優(yōu)選6-9，并且最優(yōu)選7-8.5。
5.如前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于反應(yīng)中的溫度為-15-+100℃，優(yōu)選為+15-+40℃，并且最優(yōu)選為+20-+30℃。
6.如前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于使用脂肪酶，優(yōu)選使用來自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS。
7.如前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于反應(yīng)在酶-膜反應(yīng)器中實(shí)施。
8.如前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于使用醚、酮、酯、飽和的或未飽和的直鏈或支鏈烴作為有機(jī)溶劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及在由水和給定反應(yīng)條件下能與水形成兩相的有機(jī)溶劑組成的兩相系統(tǒng)中，通過N－未保護(hù)的β－氨基酸酯的酶酯拆分來制備富集對映體的β－氨基酸的方法。
文檔編號C12P13/00GK1456676SQ03123428
公開日2003年11月19日 申請日期2003年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月8日
發(fā)明者哈拉爾德·格勒格爾, 黑爾格·維爾納 申請人:德古薩股份公司