專利名稱：：一種海因酶基因及其編碼的氨基酸和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于基因工程領域，具體的說，涉及一種海因酶基因及其編碼的氨基酸和應用。
背景技術：
：D-氨基酸及其衍生物是醫(yī)藥及食品領域的重要原材料，被廣泛地用于半合成抗生素、多肽激素、擬除蟲菊酯、殺蟲劑和甜味劑等的中間物。其中，D-對羥基苯甘氨酸(D-pHPG)是合成半合成廣譜抗生素阿莫西林、頭孢羥氨芐、頭孢哌酮、頭孢羅奇有頭孢羥胺唑等的重要原料。D-對羥基苯甘氨酸的傳統(tǒng)生產工藝需要通過化學合成和拆分(D-對羥基苯甘氨酸的合成過程如圖1所示)，該工藝存在著收率低，環(huán)境污染嚴重等缺點。自上世紀八十年代以來，酶法制備D-對羥基苯甘氨酸的研究和應用得到發(fā)展，其過程如下首先利用化學手段合成D，L-對羥基苯海因(D，L-HPH)作為生物酶作用的底物，然后利用生物酶將其轉化為D-對羥基苯甘氨酸。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲縮合得到D，L-對羥基苯乙內酰苯海因(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)立體專一性水解開環(huán)生成D-N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在堿性條件或者存在消旋酶的條件下，未被開環(huán)的L-型對映體消旋化為D-型從而進一步被轉化。通過這種酶促不對稱水解反應，可使混消旋的pHPH完全轉化為D-HPG。現在，在工業(yè)上已有采用固定化的D-海因酶或固定化細胞進行該反應的報道。酶法生產D-對羥基苯甘氨酸在工業(yè)上有重要的應用價值，因此對其生產所用的相關酶的研究和改造有重要意義。而D-海因酶可催化5’單替代海因或二氫尿嘧啶的開環(huán)，形成氨基甲酰類的中間物，該中間產物可被氨甲酰水解酶降解為D-對羥基苯甘氨基酸，成為半合成β-內酰胺類抗生素的重要中間體。因而，對D-海因酶的研究逐漸成為了相關行業(yè)的熱點研究課題之一。近年來，人們已經從PseudomonasfluorescensDSM84，BacillusstearothermophilisNS1122A，PseudomonasputidaCCRC12857，Agrobacteriumsp.KNK712，AgrobacteriumradiobacterNRRLB11291克隆出編碼海因酶的基因，并對其進行了分子生物學改造，以改進相關的酶學性質。然而，迄今為止尚未見有克隆來源于Jannaschiasp.CCS1的海因酶的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于，提供一種來源于Jannaschiasp.CCS1的海因酶基因。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種所述的海因酶基因編碼的氨基酸。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列的重組質粒。本發(fā)明的最后一個目的在于，提供一種所述的海因酶基因的應用。為實現上述目的，本發(fā)明通過PCR方法從Jannaschiasp.CCS1基因組擴增獲得海因酶基因。再將擴增后獲得的海因酶的DNA片段與載體pET28a連接，從而獲得海因酶的重組質粒pETJ2。將所述的海因酶的重組質粒轉入到E.coliBL21(DE3)中，并將所述的工程菌BL21(DE3)/pETJ2發(fā)酵培養(yǎng)，從而獲得所述的海因酶基因編碼的氨基酸。將所獲得的海因酶基因的表達產物，以對羥基苯海因作為底物，制備D-對羥基苯甘氨酸，并與來源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶進行了比較。本發(fā)明提供的海因酶基因編碼的氨基酸序列不同于目前已知來源的海因酶，其在以對羥基苯海因作為底物時表現出較高的酶活，明顯高于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶。雖然，在本發(fā)明中，構建表達載體時，使用的是pET28a，但是對本領域的工作人員而言，使用其它的載體來構建相應的表達載體，如pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010等常用的表達載體，也是顯而易見的，故也應屬于本發(fā)明的范圍。同樣的，對本領域的工作人員而言，將構建好的相應表達載體轉化到其它的微生物，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷菌屬(Serratia)、農桿菌屬(Agrobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)等中，獲得相應的轉化型微生物，也是顯而易見的，故也應屬于本發(fā)明的范圍。圖1是D-對羥基苯甘氨酸的合成示意圖。圖2是新的海因酶表達載體pETJ2的構建示意圖。圖3是在大腸桿菌中過表達海因酶的電泳圖。其中各泳道分別為1為誘導前的BL21(DE3)/pETJ2；2為誘導后的BL21(DE3)/pETJ2；3為蛋白Marker。圖4是利用HPLC檢測海因酶反應生成產物的曲線圖。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南(第三版)》(J.薩姆布魯克等著，2003)中所述的條件進行。實施例1、含有目的基因的表達載體和工程菌的構建1.1、引物設計根據Genebank公布的Jannaschiasp.CCS1的基因組序列，設計引物A和B，其序列如下引物A5’-AGGGGGATCCATGAGCAAGGTGATCAAGGG-3’；引物B5’-CTAGAAGCTTTCAAACCCCCGCCGGAATG-3’。1.2、PCR擴增用A和B為引物，以來源于Jannaschiasp.CCS1的基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因。反應體系1×PCRBufferforKODplus，2mMMgSO4，引物A和引物B各0.4μM，dJannaschiasp.CCS1基因組DNA100ng，0.2mMdNTP，1UKODplus/50μl。反應條件94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30個循環(huán)；72℃10min。反應結束后，按操作手冊，將PCR產物用華舜公司的膠回收試劑盒回收純化約1.5kb的產物。對回收產物進行測序，測序結果顯示，擴增獲得的基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列，其對應的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。以來源于Agrobacteriumsp.KNK712的D-海因酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)作為Query，在GenBank中進行同源性檢索。結果顯示，該氨基酸序列(SEQIDNO2)與具有SEQIDNO1記載的氨基酸序列(Q409E0)的同源性為40％，根據NCBI的BLAST結果分析，發(fā)現其存在海因酶的保守結構域，推測其可能具有海因酶的功能。1.3、構建載體和工程菌構建過程如圖2所示，具體操作如下參考操作手冊，用BamHI(購自MBI公司)和HindIII(購自MBI公司)分別對PCR擴增產物和pET28a載體(購自Novagen公司)進行雙酶切，采用MBI公司的雙酶切緩沖液R作為酶切反應的緩沖液。酶切后，產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段(PCR產物酶切后片段大小約為1.5kb，pET28a酶切后大小約為5.4kb)，然后參考操作手冊，用華舜公司的膠回收試劑盒分別回收并純化PCR產物的酶切后片段和載體pET28a的酶切后片段。取PCR產物酶切后片段和pET28a載體片段各4μl，1μlT4連接酶緩沖液和1μlT4連接酶，于16℃，連接過夜，收獲連接產物，即為表達載體pETJ2。取5μl連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接入液體培養(yǎng)基中，于37℃，250rpm，培養(yǎng)6-8小時后，抽提質粒，并驗證克隆。選取酶切驗證正確的克隆測序，以驗證序列是否突變。測序結果顯示，目的基因的序列沒有發(fā)生突變。將構建好的表達載體pETJ2轉化宿主菌E.coliBL21(DE3)(購自Novagen公司)，得到的工程菌命名為BL21(DE3)/pETJ2。雖然，在本實施例中，構建表達載體時，使用的是pET28a，但是對本領域的工作人員而言，使用其它的載體來構建相應的表達載體，如pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010等常用的表達載體，也是顯而易見的，故也應屬于本發(fā)明的范圍。同樣的，對本領域的工作人員而言，將構建好的相應表達載體轉化到其它的微生物，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷菌屬(Serratia)、農桿菌屬(Agrobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)等中，獲得相應的轉化型微生物，也是顯而易見的，故也應屬于本發(fā)明的范圍。實施例2、目的基因的表達挑取E.coliBL21(DE3)/pETJ2的單菌落接入含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接種量接入含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD600≈0.6時，加入終濃度為0.25mM的IPTG，于20℃，誘導培養(yǎng)5小時。將菌液于12000rpm離心2分鐘后，棄上清。用50mMpH8.0的Tris-HCl緩沖液將沉淀重懸，超聲破碎。將破碎后的細胞，通過聚丙烯酰氨凝膠電泳分析目的蛋白的表達量，結果如圖3所示。根據圖3的結果可見，目的蛋白的表達量約占總蛋白的30％，可通過在大腸桿菌重組過量表達J2，以利于后續(xù)的酶蛋白的固定化和連續(xù)轉化的工業(yè)化生產。實施例3、目的蛋白酶活的測定將實施例2中過夜培養(yǎng)的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接種量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD600≈0.6時，加入終濃度為0.25mM的IPTG，于20℃，誘導培養(yǎng)5小時。收集菌液，離心，棄去上清，并于-20℃凍融一次，然后用50mMpH8.0的Tris-HCl緩沖液將菌體重懸。將重懸后的菌體加入到含1％對羥基苯海因、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，40℃反應10分鐘，加入3.7％的HCl中止酶反應并混勻。將上述反應液于12000rpm離心5分鐘，取上清稀釋4倍后利用HPLC分析反應產物生成的量(結果如圖4所示)，計算酶活，結果如表1所示。酶活計算方法表1、目的蛋白酶活測定結果<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="558">O.D.600μmol/min/ml/ODBL21/pETJ22.2±0.10.016±0.002</table></tables>實施例4、目的蛋白比活的測定將實施例2中過夜培養(yǎng)的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接種量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD600≈0.6時，加入終濃度為0.25mM的IPTG，于20℃，誘導培養(yǎng)5小時。收集菌液，離心，棄去上清，然后用50mMpH8.0的Tris-HCl緩沖液將菌體重懸。將重懸的菌液壓榨破壁，采用GE公司NiSepharoseHighPerformance純化目的蛋白，并用Bradford方法測定目的蛋白濃度。將目的蛋白用50mMpH8.0的Tris-HCl稀釋為終濃度0.06mg/mL，加入到含1％對羥基苯海因pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，40℃反應30分鐘，加入3.7％的HCl中止酶反應并混勻。將上述反應液于12000rpm離心5分鐘，取上清稀釋10倍后利用HPLC分析反應產物生成的量(結果如圖4所示)，計算酶比活，結果如表2所示。用同樣的方法可從含有來源于Agrobacteriumsp.KNK712海因酶的工程菌(CGMCCNo.0520.2)中表達、純化得到來源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶，并在上述同樣的條件下，測定其活性和比活。表2、目的蛋白比活測定結果根據上述實施例中實驗結果，可以推定具有SEQIDNO2的氨基酸序列的蛋白，具有海因酶的功能，因此是一種海因酶；且本發(fā)明的海因酶不同于目前已知來源的海因酶，其在以對羥基苯海因作為底物時，表現出較高的比活，其比活約為來源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶的4倍，因此，在運用雙酶法生產對羥基苯甘氨酸的工業(yè)生產中可有較廣闊的運用前景。序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>一種海因酶<130>P5071012<160>3<170>PatentInversion3.1<210>1<211>457<212>PRT<213>Agrobacteriumsp.KNK712<400>1MetAspIleIleIleLysAsnGlyThrIleValThrAlaAspGlyIle151015SerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLysIleThrGlnIleGly202530GlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArgTyr354045ValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSer505560PheAsnThrGlnSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAla65707580AlaCysGlyGlyThrThrThrIleValAspPheCysGlnGlnAspArg859095GlyHisSerLeuAlaGluAlaValAlaLysTrpAspGlyMetAlaGly100105110GlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAspPro115120125ThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIle130135140ThrSerPheLysValPheMetAlaTyrArgGIyMetAsnMetIleAsp145150155160AspValThrLeuLeuLysThrLeuAspLysAlaValLysThrGlySer165170175LeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAlaAlaAspTyrLeuArg180185190AspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAlaLeu195200205SerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAla210215220LeuAlaGluIleValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCys225230235240GluGluSerLeuGluGluValMetArgAlaLysSerArgGlyValArg245250255AlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyrLeuThrLysGluAsp260265270LeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrProPro275280285AlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsn290295300GlyValPheGluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLys305310315320GlyHisLysAspArgGlyArgAsnAspPheArgAlaIleProAsnGly325330335AlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetValTyrGlnGlyValAsn340345350GluGlyArgIleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThrArg355360365ProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaVal370375380GlySerAspAlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetVal385390395400IleGluGlnThrAlaMetHisAsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGlu405410415GlyHisLysValLysGlyValProLysThrValLeuLeuArgGlyLys420425430ValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGlyLys435440445PheLeuLysArgArgLysTyrLysGln450455<210>2<211>487<212>PRT<213>Jannaschiasp.CCS1<400>2MetSerLysValIleLysGlyGlyThrIleValThrAlaAspArgGln151015TrpGlnAlaAspValLeuIleGluGlyGluLysIleAlaGluIleGly202530GluAsnLeuArgGlyAspGluValIleAspAlaGluGlyAlaTyrVal354045IleProGlyGlyIleAspProHisThrHisLeuGluMetProPheMet505560GlyThrThrAlaAlaGluThrPheGluThrGlyThrPheAlaAlaAla65707580AlaGlyGlyThrThrMetLeuValAspPheCysLeuProGlyGluAsp859095GlySerLeuLeuSerAlaIleAspAlaTrpAspAlaLysSerLysAsp100105110GlnIleCysValAspIleSerTyrHisMetAlaIleThrGlyTrpSer115120125GluSerIlePheAsnGluMetAlaAspValValAsnValArgGlyIle130135140AsnThrPheLysHisPheMetAlaTyrLysGlyAlaLeuMetIleGlu145150155160AspAspGluMetPheSerSerPheLysArgCysAlaGluLeuGlyAla165170175LeuProLeuValHisAlaGluAsnGlyAspIleValGlnGluLeuGln180185190GlnLysTyrMetAlaMetGlyValThrGlyProGluGlyHisAlaTyr195200205SerArgProProGluValGluGlyGluAlaAlaAsnArgAlaIleMet210215220IleAlaAspAlaAlaGlyThrProLeuTyrIleValHisValSerCys225230235240GluGlnAlaHisGluAlaIleArgArgAlaArgGlnLysGlyMetArg245250255ValPheGlyGluProLeuIleGlnHisLeuThrLeuAspGluSerGlu260265270TyrPheAsnLysAspTrpGlnTyrAlaAlaArgArgValMetSerPro275280285ProPheArgAsnLysGluHisGlnAspGlyLeuTrpAlaGlyLeuAla290295300AlaGlySerLeuGlnValValAlaThrAspHisAlaAlaPheThrAsp305310315320GluGlnLysArgMetGlyValAspAsnPheGlyMetIleProAsnGly325330335ThrGlyGlyLeuGluGluArgMetAlaMetLeuTrpThrArgGlyVal340345350GluThrGlyArgLeuThrProGluGluPheValAlaValThrSerSer355360365AsnIleAlaLysIleLeuAsnIleTyrProMetLysGlyGlyIleAsn370375380ValGlyGlyAspAlaAspIleValValTrpAspProLysLeuGlyArg385390395400ThrIleThrThrAlaThrAlaLysSerIleLeuAspTyrAsnValPhe405410415GluGlyMetGluValSerAlaSerProArgTyrThrLeuSerArgGly420425430AspValValTrpAlaAlaGlyGlnAsnSerGlnProGlnProGlyArg435440445GlyLysPheValLysArgProProAlaAlaSerAlaSerGlnAlaLeu450455460SerLysTrpLysAlaLeuAsnThrProArgLysIleGluArgAspPro465470475480MetAsnIleProAlaGlyVal485<210>3<211>1464<212>DNA<213>Jannaschiasp.CCS1<400>3atgagcaaggtgatcaagggcggcacgattgtgaccgcagaccgtcaatggcaggcggac60gtgttgatcgagggcgaaaagattgccgagatcggggagaacctgcgcggggatgaggtg120atcgacgcggaaggcgcctatgtgatcccgggcggcatagacccccacacgcatcttgag180atgcccttcatgggcaccacggcggcggagacgttcgagacgggcacctttgcggcggca240gcgggcggcaccacgatgctggtcgatttctgccttccgggcgaggatggcagccttttg300tccgccatcgatgcctgggacgccaaatcgaaggatcagatctgcgttgatatctcctac360cacatggcgatcaccggctggtcggagagcattttcaatgagatggcggacgttgttaat420gtgcgcggcatcaacacatttaagcatttcatggcctataaaggcgcgctgatgatcgag480gatgacgagatgttttcgtcgttcaagcgctgcgctgaattgggcgcgctgccgctggtc540catgccgaaaacggcgatatcgtccaggagttgcaacagaaatacatggcgatgggcgtg600acggggccggagggtcacgcatattcccgtccgcctgaggtcgaaggggaagccgccaac660cgcgcgatcatgatcgccgacgccgctggcacgccgttgtatatcgtccatgtgtcgtgt720gagcaggcccatgaggccatccgccgtgcccgtcagaaggggatgcgggtcttcggggag780ccactgatccagcacctgacgctggatgagagcgagtatttcaacaaggattggcaatat840gcggcccgccgggtcatgtccccgccgtttcgcaacaaagagcatcaggacggtctttgg900gcaggtcttgccgctgggtccttgcaggttgtggccacggaccacgccgccttcaccgac960gagcaaaagcgcatgggcgtggacaatttcggcatgatccccaacggcaccggcgggctt1020gaggagcgcatggcaatgttgtggacgcgcggcgtggaaacgggccgcctgacgccggaa1080gaattcgttgcggtgacgtcatcgaacatcgccaagatcctcaacatttacccaatgaag1140ggtggcatcaacgtcggcggcgacgcggatatcgtggtctgggacccgaaactgggccgc1200acgatcacgacggcaacggcgaaatctatccttgattacaatgtgttcgagggaatggag1260gtgagcgcctccccccgctacaccctgtcgcgcggggatgtggtgtgggcggcggggcaa1320aacagccagccgcaaccgggccgtgggaaattcgtgaaacggcccccggcggcgagtgcg1380tcccaggcgctgagcaagtggaaggcgttgaacacgccgcgcaagatcgagcgcgacccg1440atgaacattccggcgggggtttga146權利要求1.一種海因酶基因，其特征在于，所述海因酶基因來源于Jannaschiasp.CCS1。2.如權利要求1所述的海因酶基因，其特征在于，所述基因編碼的氨基酸具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。3.如權利要求1或2所述的海因酶基因，其特征在于，所述的基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。4.如權利要求1-3任一項所述的海因酶基因編碼的氨基酸。5.如權利要求4所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。6.如權利要求5所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸由具有SEQIDNO3所示的DNA序列的海因酶基因所編碼。7.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。8.如權利要求7所述的重組質粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。9.如權利要求7所述的重組質粒，其特征在于，所述載體包括pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010。10.如權利要求9所述的重組質粒，其特征在于，載體為pET28a。11.如權利要求1-3任一項所述的海因酶基因的應用，其特征在于，用于制備海因酶。12.如權利要求11所述的應用，其特征在于，包括以下步驟A、構建重組質粒；B、轉化宿主菌；C、發(fā)酵培養(yǎng)，獲得海因酶。13.如權利要求12所述的應用，其特征在于，所述重組質粒具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。14.如權利要求13所述的重組質粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。15.如權利要求14所述的重組質粒，其特征在于，所述載體包括pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010。16.如權利要求15所述的重組質粒，其特征在于，載體為pET28a。17.如權利要求11或12所述的應用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。18.如權利要求1-3任一項所述的海因酶基因用于制備D-對羥基苯甘氨酸的應用。19.如權利要求18所述的應用，其特征在于，包括以下步驟A、構建重組質粒；B、轉化宿主菌；C、發(fā)酵培養(yǎng)，制備海因酶發(fā)酵液；D、利用發(fā)酵液將D，L-對羥基苯海因底物轉化為D-對羥基苯甘氨酸。20.如權利要求19所述的應用，其特征在于，所述重組質粒具有編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一種載體DNA序列。21.如權利要求20所述的重組質粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。22.如權利要求21所述的重組質粒，其特征在于，所述載體包括pET系統(tǒng)，pSU系統(tǒng)，pTrc系統(tǒng)，pMW系統(tǒng)，pKK系統(tǒng)，RSF1010。23.如權利要求22所述的重組質粒，其特征在于，載體為pET28a。24.如權利要求18或19所述的應用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了一種海因酶基因，以及該基因編碼的氨基酸、包含該基因的重組質粒和該基因的應用。本發(fā)明提供的海因酶基因所編碼的氨基酸序列不同于目前已知來源的海因酶，所述海因酶基因的表達產物在以對羥基苯海因作為底物時表現出較高的酶活，其比活明顯高于目前工業(yè)生產中常用的來源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶。文檔編號C12N9/78GK101058818SQ200710039229公開日2007年10月24日申請日期2007年4月6日優(yōu)先權日2007年4月6日發(fā)明者姜衛(wèi)紅,蔡淵恒,姜世民,陳軍,楊蘊劉,楊晟申請人:中國科學院上海生命科學研究院